Содержание к диссертации
Введение
1. Актуальность проблемы 6
2. Цели и задачи работы 8
3. Научная новизна 9
4. Обзор литературы 10
4.1. Теломеры и их функция 10
4.2. Молекулярная организация теломерного повтора 13
4.3. Белки, связывающиеся с теломерами 18
4.4. Роль теломеразы в восстановлении теломерных
последовательностей 19
4.5. Альтернативные механизмы поддержания структуры теломер 24
4.6. Структура теломер в онтогенезе растений 28
4.7. Молекулярная организация субтеломерных повторов 30
4.8. Особенности организации теломерной ДНК у
Аспараговых (Asparagacea) 31
4.9. Особенности организации генома Луковых 36
4.9.1. Ботаническая характеристика лука-батуна (Л. fistulosum) 37
4.9.2. Практическая ценность использования Л. fistulosum в селекции
лука репчатого 37
4.9.3. Молекулярно-генетическая и цитогенетическая
характеристика A. fistulosum 39
4.10. Особенности молекулярной организации теломер у Allium 42
5. Материалы и методы 49
5.1. Растительный материал 49
5.2. Получение цитологических препаратов 49
5.3. Выделение ДНК 50
5.4. ПЦР-анализ 51
5.5. Гибридизация по Саузерну 53
5.6. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) и получение растянутой ДНК 54
6. Результаты исследований 56
6.1. Геномная организация сателлитной ДНК 56
6.1.1. ПЦР анализ с праймерами на сателлитный повтор 56
6.1.2. Саузерн-гибридизация продуктов амплификации праймеров 34902 и 34903 58
6.1.3. Рестрикционный анализ 59
6.1.4. Саузерн-гибридизация продуктов амплификации праймеров 34905 и 34906 61
6.1.5. Саузерн-гибридизация с геномной ДНК A. fistulosum 62
6.1.6. Гибридизация in situ на растянутую ДНК A. fistulosum 63
6.1.7. ПЦР анализ несателлитной ДНК 64
6.1.8. Саузерн-гибридизация с ПЦР-продуктами праймеров 34905 и PR2 68
6.2. Изучение локализации продуктов амплификации на хромосомах A. fistulosum 68
6.3. Слот-блот анализ геномной ДНК A. fistulosum с
меченным теломерным повтором -TTAGGG 73
6.4. ПЦР анализ геномной ДНК с праймерами на теломерный повтор TTAGGG и TTTAGGG
6.5. Локализация продуктов амплификации праймеров HTelol и НТ1ео2 на хромосомах A. fistulosum 78
6.6. Сиквенирование продуктов ПЦР праймеров HTelol и НТе1о2. ...80
7. Обсуждение 84
7.1. Негомологичная рекомбинация в сателлитном повторе -механизм восстановления теломеры 84
7.2. Дрозофила-подобный механизм восстановления теломер 87
7.3. Восстановление теломер с помощью теломеразы 87
8. Выводы 93
9. Список использованной литературы 94
Введение к работе
Одним из основных элементов эукариотических хромосом являются теломеры, их физические окончания. Установлено, что теломеры защищают хромосомы от деградации нуклеазами и прогрессирующего укорачивания в результате незавершенной репликации в 5 -концах (Zakian, 1995). Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе (Heslop-Harrison et al.,1993; de Lange, 1998). Недавние исследования тонкой молекулярной структуры теломер указывают на их важную роль в процессах старения организма и пролиферации клеток (Егоров, 2001).
Теломеры большинства групп организмов представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями ДНК (Futch et. al.,1995). Для высших растений характерен теломерный повтор - TTTAGGG (арабидопсис-тип) (Richards and Ausubel, 1988). Показано, что представители филогенетической ветви - Аспараговые, к которой относится семейство Луковые, потеряли растительный теломерный повтор и взамен, на концах хромосом, содержат характерный для позвоночных повтор - TTAGGG (Adams et. al. 2001, Sykorova et. al. 2003a). Однако, в отличие от других видов растений, у лука репчатого {Allium сера), не обнаружены ни арабидопсис-тип ни характерный для позвоночных теломерный повтор (Fuchs et. al., 1995, Sykorova et. al. 2003). Показано, что окончания хромосом лука репчатого (А. сера) и лука-батуна (A. fistulosum) содержат сателлитную ДНК размером 378-380 пар нуклеотидов (Irifune et al.,1995). В настоящее время неизвестно, как Луковые защищают окончания своих хромосом и какие последовательности ДНК выполняют функцию теломер. Поэтому данные о строении и природе последовательностей ДНК составляющих теломеры A. fistulosum
дополнят наши знания по эволюции растительной теломеры, ее молекулярной организации и функционированию. Более того, данная работа представляет практический интерес для селекции лука репчатого, так как лук-батун (A. fistulosum L) является источником хозяйственно-ценных генов, таких как, устойчивость к ржавчине (Urocystis cepulae Frost), (Jones and Mann, 1963), шейковой гнили (Botrytis squamosa Walker), луковой мухе (Hylemyia antique Bouche), корневой гнили {Phoma terrestris E. M. Hans.), (Porter & Jones, 1933), устойчивость к холоду, а также генов контролирующих высокое содержание сухого вещества (Van Der Meer and Van Benekom 1978). Данные об организации теломерной ДНК A. fistulosum L. необходимы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах (Khrustaleva et al., 2005).
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
С целью выяснения механизма восстановления теломерных окончаний хромосом у Л. fistulosum была изучена геномная организация теломерной ДНК. При этом были поставлены следующие задачи:
1. С помощью FISH и слот-блот анализа провести поиск последовательностей ДНК гомологичных теломерным повторам позвоночных и арабидопсиса.
2. Изучить организацию сателлитного теломерного повтора с помощью ПЦР, Саузерн-гибридизации и рестрикционного анализа.
3. Изучить организацию и локализацию сателлитной ДНК на митотических хромосомах и растянутой ДНК с помощью FISH анализа.
4. Определить наличие в структуре теломерных повторов микросателлитов и ретротранспозонов.
3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые применен комплексный подход для изучения геномной организации сателлитного терминального повтора Allium fistulosum (378 п.о.), включающий набор молекулярных (ПЦР, рестрикционный анализ, Саузерн-блоттинг) и молекулярно-цитогенетических (FISH на митотическую и растянутую ДНК) методов. Показано, что сателлитная ДНК A. fistulosum организована тандемно (в ориентации "голова-хвост") и содержит кластеры последовательностей ДНК с перестройками в исходном сателлитном повторе 378 п.н. Выявлено, что в области сателлитного терминального повтора присутствуют микросателлиты и ретротранспозоны.
Впервые показано, отсутствие на окончаниях хромосом A. fistulosum функционального теломерного повтора TTAGGG, характерного для позвоночных. Однако выявлено, что в терминальном гетерохроматине присутствуют фрагменты теломерного повтора TTAGGG.
На основе полученных данных построена модель организации ДНК терминального сателлитного повтора A. fistulosum и предложены возможные механизмы восстановления теломер у Луковых.
Полученные данные по молекулярной структуре теломерных повторов у Allium fistulosum могут быть использованы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах. На основании данных о нуклеотидной последовательности клонов теломерной ДНК могут быть разработаны молекулярные маркеры.
Теломеры и их функция
Одним из основных элементов эукариотических хромосом являются теломеры, их физические окончания. Функциональная роль теломер впервые была продемонстрирована Мюллером в 1938 году на дрозофиле. Автором было установлено, что хромосомы, потерявшие теломеры в результате облучения, не восстанавливались (Muller, 1938). Позднее, МакКлинток было показано на кукурузе, что разорванные безтеломерные хромосомы частично сливались с другими поврежденными хромосомами (McClintoc, 1941). Поскольку хромосомы, имеющие теломеры, оставались интактными, автор предположила, что одна из основных функций теломер заключается в защите хромосом от слияния друг с другом
Благодаря значительным достижениям в молекулярной генетике на сегодня установлено, что теломеры защищают хромосомы от деградации нуклеазами и прогрессирующего укорачивания в результате незавершенной репликации в 5 -концах, а также позволяют клетке отличать интактные хромосомы от поврежденных (Zakian, 1995).
Роль теломер при защите от деградации нуклеазами была показана при изучении белков связанных с теломерой. Так, у линий дрожжей со сниженной активностью белка Rapl (белок связывающейся с теломерной ДНК), наблюдались более короткие теломеры (Lustig et.al.,1990; Conrad et.al., 1990). Удаление теломеры из хромосомы дрожжей приводило к быстрому укорачиванию теломерных концов (Sandell and Zakian, 1993; White and Haber, 1990). Поскольку клеточных делений не было, а укорачивание теломер происходило быстрее, чем при незавершенной репликации, было предположено, что этот феномен результат деградации ДНК.
Одной из важных функций теломер является предохранение хромосом от укорачивания в результате не завершения репликации в 5 -концах. Еще в 1972 году Ватсон сообщил о том, что укорачивание концов линейных молекул ДНК обусловлено биохимическими особенностями ДНК-полемераз (Watson, 1972). Обычные ДНК-полимеразы реплицируют ДНК только от 5 к 3 -концам и не могут инициировать синтез ДНК de novo. Как следствие, после репликации ДНК один конец линейной хромосомы будет реплицироваться до самого конца, а другой будет иметь короткий недореплицированный участок, образовавшийся после удаления РНК праймера (рис.1).
Растительный материал
Цитологические препараты для флюоресцентной in situ гибридизации были приготовлены методом давления.
Предметные стекла обрабатывали 5N НС1 в течении 3 часов. Затем промывали в бидистиллированной воде (не менее 3 раз). Перед использованием стекла погружались в спирт на 10 мин. и высушивали на воздухе.
Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге, после 3-5 дней семена обрабатывали ц-бромнафталином при 4С в течение 24 часов. Корешки фиксировали в смеси из этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение часа и хранили при температуре +4С до использования.
Для приготовления препаратов корешки промывали в бидистиллированной воде 3 раза и в цитратном буфере. Затем обрабатывали в ферментной смеси: целлюлаза Onozuka 2%, пектинаназа 5S 2%, мацерозиме 2,5%, драйзелаза 1% в течение 1 часа при 37С. После этого корешки отмывали в цитратном буфере и готовили давленные препараты в 45% уксусной кислоте.
Для перевода временных препаратов в постоянные использовали метод замораживания - скалывания. Для этого свежеприготовленные препараты замораживали при температуре - 70С в течение 30 минут. После этого снимали покровное стекло и обрабатывали препарат 96% спиртом в течение 5 минут и высушивали на воздухе. Постоянные препараты хранили при температуре - 20С до использования.
Основными критериями отбора стекол для in situ гибридизации служили:
- количество полных метафазных пластинок;
- разброс хромосом;
- отсутствие цитоплазмы и клеточной стенки;
- отсутствие «мусора и грязи»;
Выделение ДНК.
ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
Молодые листья растирали в буфере для экстракции (0.35 М сорбитол, 100 мМ трис-HCl, 5мМ ЭДТА, рН 7) на холоду. Центрифугировали 10 мин. 14000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, добавляли буфер для экстракции, интенсивно встряхивали. Лизировали при 65С в буфере для лизиса (1 М трис- НС1 рН 7.5, 0.5 ЭДТА, 5 М NaCl, 2% СТАВ) с добавлением 5 % саркосила. После лизиса, производили очистку смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали при 14 000 об/мин. в течении 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость и осаждали ДНК в одном объеме изопропанола. Центрифугировали в 14 000 об/мин. в течение 10 мин., осадок высушивали и растворяли в MQ-воде. Размер
Геномная организация сателлитной
В работе изучалась организация теломерного, сателлитного повтора 378 п.н. с помощью ПЦР, Саузерн-гибридизации и рестрикционного анализа.
ПЦР анализ с праймерами на сателлитный повтор Для ПЦР-анализа были использованы две пары праймеров: первая пара праймеров 34902 и 34903 в прямой ориентации и вторая пара праймеров 34905 и 34906 в обратной ориентации (Рис. 5). При этом праймер 34902 был комплиментарен 34906, а праймер 34903 комплиментарен 34905.
Рис. 5. Модель, описывающая расположение праймеров, использованных для ПЦР.
При проведении ПЦР с праймерами 34902 и 34903 амплифицировали два фрагмента ДНК размером 378 и 760 п.н. (данные не представлены), что соответствует длине единицы сателлитного повтора. Фрагмент 760 п.н. был вырезан из геля и амплифицирован с теми же праймерами. При этом ПЦР выявила только фрагмент 378 п.н., что свидетельствует о тандемном расположении "голова-хвост" сателлитного повтора 378 п.н. Однако, возможные нарушения в структуре сателлитного повтора можно выявить с помощью одностороннего ПЦР. При правильной тандемной организации "голова-хвост" односторонний ПЦР не даст амплификацию четких фрагментов ДНК.
При использовании только одного праймера 34902 мы получили амплификацию сдвоенных фрагментов длиной от 195 до 1040 п.н. Амплификация таких фрагментов ДНК показывала некоторую периодичность с шагом 380-400 п.н. (рис.6, первая дорожка). праймер 34902,2 - праймер 34903, 3 - праймер 34905, М - маркер
При одностороннем ПЦР с праймером 34903 амплифицировалась лестница фрагментов являющихся мультимерами фрагмента 395 п.н. (рис.6, вторая дорожка). При использовании праймера 34903 в обратной ориентации (праймер 34905) также амплифицировалась лестница фрагментов с шагом в 400 п.н. (рис.6, третья дорожка). Однако размер фрагментов ДНК, амплифицируемых этим праймером не совпадал с продуктами, амплифицируемыми праймером 34903. При ПЦР с праймером 34906, амплифицировалась лестница фрагментов, начиная с фрагмента, размером 400 п.н. (рис. 7-4). Показано, что условия ПЦР сильно влияли на количество и размер амплифицируемых фрагментов. Так, при изменения температуры отжига от 57 до 70С появлялись и исчезали дополнительные фрагменты ДНК, а также выраженный шмер, который присутствовал при амплификации на 57 градусах, а при температуре отжига 70С - исчезал.
