Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов Жуков, Владимир Александрович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Важным аспектом предотвращения
неблагоприятных последствий эпизоотии и эпидемий инфекционных
заболеваний, появления новых (вновь возникающих) инфекций является
своевременный прогноз восприимчивости животных или человека к патогенам,
а также подбор и создание наиболее эффективных противовирусных средств.
Решение данных задач основано на использовании модельных биологических
систем - культур клеток и модельных животных с последующим испытанием
безвредности и оценки эффективности на животных и человеке. Однако,
широкое использование биологических моделей и биотехнологий не
сопровождалось столь же интенсивной разработкой методов или моделей
экстраполяции (масштабирования) количественных параметров,

характеризующих свойства вирусов, с одной модельной системы на другую и в конечном итоге на организм хозяина (животного и/или человека), как, например, в радиобиологии, фармакологии и токсикологии - дисциплинах, где также используются живые модельные системы. Использование для микробов методов экстраполяции, разработанных для химических и физических факторов, невозможно, т.к. в отличие от последних микробы являются размножающимися (инфекционными) объектами. Разные виды животных, вообще говоря, не являются равно чувствительными к одному и тому же виду микробов, поэтому прямой перенос результатов экспериментов по определению показателей инфекционности патогенов или защитного уровня противовирусных препаратов (ПВП) на модельных животных на другие виды животных и человека неправомочен. Наиболее важным показателем вирусов является 50% инфицирующая доза (ID₅₀), характеризующая главное свойство микробов - способность инфицировать и образовывать инфекционный процесс. Важность этого показателя определяется и тем, что вероятность инфицирования организма хозяина является дозо-зависимой, при этом величина Ю₅₀ является характеристическим параметром функциональной зависимости вероятности инфицирования от дозы заражения. Это означает, что Ю₅₀ определяет долю заболевших в группе инфицированных объектов, т.е. заболеваемость в коллективе. Определение Ю₅₀ экспериментальным путем требует заражение групп макроорганизмов известными дозами патогена.

Очевидно, что для вирусов, вызывающих инфекции с летальным исходом, в применении к человеку такая возможность отсутствует. Что касается оценок, сделанных на основании моделирования аварийных случаев, то согласно многим исследователям эти данные являются приблизительными, требуют уточнения и дополнительного обоснования.

Более пятидесяти лет в вирусологических исследованиях используются первичные культуры клеток, выделенные из органов-мишеней хозяина. В многочисленных исследованиях с первичными культурами макрофагов показано наличие корреляции способности макрофагов продуцировать вирус в экспериментах in vitro с восприимчивостью организма хозяина к различным макрофаготропным вирусам. Эти данные свидетельствуют о потенциальной пригодности первичных культур клеток органов-мишеней для оценки восприимчивости их хозяина к микроорганизмам.

В свете вышеизложенного работы по изучению межвидовой взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на клеточном и организменном уровнях хозяина, в том числе при изучении свойств вируса с использованием первичных культур клеток органов-мишеней являются актуальными. Следует признать актуальным проведение таких исследований для социально-значимых и особо-опасных инфекций. Представителем первой группы является вирус гриппа (ВГ), второй - вирус Марбург (ВМ).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка метода экстраполяции (прогнозирования) 50% инфицирующей дозы вируса (ID₅₀) с модельного (лабораторного) животного на хозяина (в том числе человека), а также разработка на базе предложенного метода новых подходов к выбору кандидатных препаратов и модельных животных для оценки эффективности потенциальных противовирусных препаратов в отношении защиты хозяина (в том числе человека).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Построение математической модели взаимосвязи Ю₅₀ вируса для хозяина и параметров взаимодействия вируса с восприимчивыми клетками хозяина на фоне действия факторов врожденного иммунитета (далее -уравнение инфекционности).

2. Построение алгоритма экстраполяции Ю₅₀ с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток.

3. Построение алгоритмов оценки параметров модели прогнозирования Ю₅₀ в экспериментах in vitro.

4. Разработка методов получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток легких и трахеи лабораторных животных.

5. Экспериментальное определение Ю₅₀ вируса гриппа при аэрогенном инфицировании экспериментальных животных.

6. Экспериментальное изучение особенностей взаимодействия вируса гриппа с восприимчивыми клетками (альвеолоцитами I и II типа, реснитчатыми клетками), макрофагами и нейтрофилами в суспензионной первичной культуре клеток легких и трахеи экспериментальных животных.

7. Оценка вклада внеклеточных защитных (барьерных) факторов выстилки респираторных органов экспериментальных животных в формирование их восприимчивости к вирусу гриппа.

8. Проверка работоспособности алгоритма прогнозирования Ю₅₀ на примере прогноза ID₅₀ вируса Марбург для обезьян и ID₅₀ вируса гриппа для крыс и мышей.

9. Применение метода для прогнозирования Ю₅₀ вируса Марбург для человека. Разработка новых подходов к выбору кандидатных препаратов и экспериментальных животных, моделирующих заданную инфекцию и пригодных для оценки противовирусной активности кандидатных препаратов, перспективных в отношении защиты человека от данной инфекции.

Научная новизна и практическая значимость. В данной работе впервые проведено комплексное теоретико-экспериментальное исследование взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на организменном и клеточном уровнях хозяина с использованием методов математического и экспериментального моделирования. В ходе исследования получены следующие новые результаты.

1. На основании обобщенной схемы развития инфекционного процесса для патогенов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания, разработано уравнение инфекционности. Данное уравнение связывает параметры вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) с вероятностью инфицирования хозяина одним вирионом, которая связана с Ю₅₀ обратной зависимостью.

2. На основании анализа уравнения инфекционности разработаны два варианта алгоритма экстраполяции Ю₅₀ с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток: частный вариант предназначен для случая, когда отличия в активности

факторов врожденного иммунитета у хозяина и модельного животного не существенны и модифицированный вариант - когда отличия существенны.

3. Разработаны алгоритмы оценки параметров модели прогнозирования Ю₅₀ в экспериментах in vitro с использованием суспензионных и монослойных первичных культур клеток, в том числе алгоритмы оценки вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета без прямого подсчета количества инфицированных клеток и алгоритмы оценки средней урожайности вируса в клетке.

4. Адекватность уравнения инфекционности, алгоритма оценки параметров модели прогнозирования ID₅₀, частного и модифицированного алгоритмов прогнозирования показана на примерах прогнозирования Ю₅₀ вируса Марбург для обезьяны (зеленая африканская мартышка) и ID₅₀ вируса гриппа для мыши ICR и крысы Wistar.

5. Показано, что для прогнозирования восприимчивости обезьяны к вирусу Марбург, используя морскую свинку в качестве модельного животного, достаточно учитывать только отличие в восприимчивости макрофагов.

6. Проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток мыши CD-I и крысы Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro. Показано, что восприимчивость и вируспродуцирующая способность альвеолоцитов I и II типов при их инфицировании вирусом гриппа in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток.

7. Показано, что для прогнозирования восприимчивости трахеи и легких мыши ICR и трахеи крысы Wistar к вирусу гриппа при использовании мыши CD-I в качестве модельного животного достаточно использовать только первичные культуры клеток соответствующего органа, а для легких крысы Wistar необходимо также использовать данные по вируснейтрализующему действию секреторных факторов бронхоальвеолярной эпителиальной выстилки крысы. Это свидетельствует, что первичные культуры клеток адекватно моделируют свойства клеток (при взаимодействии с вирусом) in vivo и позволяют адекватно оценивать «базовую» (клеточно-опосредованную и без учета факторов врожденного иммунитета) восприимчивость хозяина к вирусу гриппа. При незначимом проявлении иммунных факторов «базовая» соответствует реальной восприимчивости.

8. На основании анализа уравнения инфекционности обоснованы количественные критерии восприимчивости и резистентности хозяина к инфекции в зависимости от величин параметров вирус-клеточного взаимодействия (вероятности инфицирования клетки одним вирионом и

средней урожайности вируса в клетке), критерий оптимального выбора ПВП, определяющий критическую степень снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия, при достижении которой вероятность образования инфекционного процесса при любой дозе инфицирования становится равной нулю, т.е. когда макроорганизм становится резистентным к инфекции. Показано, что для обеспечения невосприимчивости хозяина нет необходимости достигать полной невосприимчивости клеток, когда вероятность инфицирования клеток и/или урожайность клеток равна нулю, необходимо, чтобы величина произведения параметров вирус-клеточного произведения была меньше либо равна 1. Данный критерий можно использовать для выбора кандидатных ПВП при их испытании в клеточных системах.

9. Математическими методами показано, чтобы перевести макроорганизм с помощью противовирусных средств в невосприимчивое к вирусу состояние, достаточно с одной и той же (критической) кратностью уменьшить один из следующих параметров - вероятность инфицирования клетки (интегрально характеризующую стадии прикрепления и проникновения вируса в клетку) или среднюю урожайность вируса в клетке (интегрально характеризующую стадии репродукции, сборки и выхода вируса).

10. Математическими методами обосновано условие, выполнение которого необходимо для проявления эффекта синергизма при сочетанном применении двух ПВП, т.е. когда два неоптимальных ПВП, примененные совместно, переводят макроорганизм в невосприимчивое состояние. Для проверки выполнения условия достаточно оценить уровни снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия для каждого из тестируемых ПВП в отдельности. Условие может быть использовано для выбора кандидатных пар ПВП, когда индивидуальное применение средств не обеспечивает перевода хозяина в состояние полной резистентности.

11. Выведен критерий выбора модельного животного для тестирования ПВП. Выполнение критерия обеспечивает, что ПВП, являющийся оптимальным для модельного животного, будет оптимальным и для моделируемого хозяина.

12. С применением разработанного метода оценено, что вероятность (аэрогенного) инфицирования человека одним вирионом вируса Марбург равняется 0,014 (-0,004;+0,005). Полученное значение может быть использовано для оценивания риска заражения человека при моделировании различных ситуаций чрезвычайного характера. В частности, данная оценка была использована в исследовании, выполненном с участием автора в Center for Security Studies and Research, East Carolina University, Greenville, North Carolina, USA и посвященном оценке эффективности современных средств обнаружения микроорганизмов в воздушной среде (основанных на методах ИФА, ПЦР, масс-

спектрометрии) в сравнении с вероятностью инфицирования человека, находящегося в контаминированной зоне.

13. С использованием разработанных алгоритмов оценена восприимчивость к вирусу Марбург и вируспродуцирующая способность клеток макрофагов морских свинок, обезьян и человека in vitro. На основании этих данных оценены величины критического уровня критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к животным и человеку. Прогнозируется, что оптимальный для человека ПВП должен снижать вероятность инфицирования клетки или урожайность вируса или их произведение не менее чем в 187 раз. На основании анализа критических уровней критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к человеку, морской свинке и обезьяне (зеленой африканской мартышке) показано, что для выбора эффективного ПВП против вируса Марбург морская свинка являются более подходящей моделью человека, чем обезьяна. Оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия могут быть использованы в математических моделях развития инфекции Марбург указанных хозяев, а критические уровни - при подборе ПВП для борьбы с указанной инфекцией.

14. Разработана лабораторная технология получения и культивирования первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи, сохраняющих жизнеспособность и способных продуцировать вирус гриппа в течение 54 часов.

15. Для вируса гриппа разработаны методики оценки параметров модели прогнозирования Ю₅₀ (а именно вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средней урожайности вируса в клетке) в экспериментах in vitro с суспензионными первичными культурами клеток легкого и трахеи лабораторных животных.

16. Построена и проверена на литературных данных формула для оценки коэффициента эпидемиологической эффективности противовирусных средств через дозы Ю₅₀ этиологического вируса, измеренные для интактного и обработанного препаратом макроорганизма. В совокупности с моделью прогнозирования Ю₅₀ формула позволяет прогнозировать возможную эпидемиологическую эффективность кандидатных препаратов, основываясь на данных лабораторных экспериментов.

17. По результатам исследования изданы методические рекомендации по проблеме прогнозирования 50% инфицирующей дозы вируса для хозяина и оценке параметров моделей прогнозирования.

Полученные данные существенно углубляют и дополняют представления о методических подходах, которые следует использовать при изучении и характеризации вирусов, разработке и оценке потенциальной эффективности

противовирусных средств. Разработанные модели, уравнения, методы, алгоритмы и критерии могут быть использованы для количественной оценки потенциальной опасности существующих и вновь возникающих вирусов для человека, оценивания значимости участия различных типов клеток и факторов врожденного иммунитета в формирование восприимчивости хозяина к инфекции, что позволит более надежно и обоснованно выбирать кандидатные противовирусные средства на стадиях лабораторных исследований.

Положения, выносимые на защиту. Предметом защиты диссертации является комплекс математических моделей и алгоритмов, позволяющих прогнозировать Ю₅₀ вируса для хозяина (в том числе человека) на основе параметров вирус-клеточных взаимодействий, полученных в экспериментах in vitro, обеспечивать оптимальный выбор противовирусных препаратов, обладающих заданными свойствами, и оценивать их эпидемиологическую эффективность, подбирать адекватных модельных животных, а также оценивать степень подобия восприимчивости клеток к вирусам in vitro относительно in vivo. Используя технологию математического и экспериментального моделирования, в работе получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.

1. Уравнение инфекционности адекватно связывает параметр восприимчивости организма хозяина к вирусу (вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) с параметрами вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) для вирусов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания.

2. Частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования Ю₅₀ с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней позволяют адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам, вызывающим инфекцию во входных воротах, в условиях соответственно незначительных и выраженных отличий факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина.

3. Разработанные алгоритмы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия позволяют адекватно оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия.

4. Первичные культуры клеток макрофагов адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусу Марбург. Первичные культуры клеток трахеи и легкого адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость соответствующего органа хозяина к вирусу гриппа in vivo.

5. Величина произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия может быть использована в качестве критерия восприимчивости/резистентности хозяина к инфекции, а также критерия выбора оптимального ПВП и выбора модельного животного для выбора ПВП оптимального для хозяина.

6. Величина коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП может быть оценена сверху величиной 1- ED_50u/ED_50V, где ED_50u и ED_50V -50% эффективная доза патогенна (ID₅₀ или LD₅₀), определенная для хозяина, получившего и не получившего препарат.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 33 всесоюзных, всероссийских и международных научных конференциях: Всесоюз. конф. «Математическое моделирование иммунитета и инфекционного процесса», Кольцове, Новосибирская обл., 1989; Всесоюз. конф. «Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ», Москва, 1990; Intern. Conf. on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, USSR, 1991; Bcepoc. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии», Томск, 1991; Fourth Intern. Aerosol Conf, Los Angeles, California, 1994; Bcepoc. конф. "Экология и здоровье", Новосибирск, 1996; 3rd Intern. Conf. on Medical B-Protection, Munchen, 1996; Russian-German colloq. on Filoviruses: The modern state of problem, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997; Bcepoc. конф. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера», Новосибирск, 1998; Bcepoc. вторая научн. конф. "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1998; Intern. SB Medical Treatment Symp. Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without chemical and biological weapons, Zagreb-Dubrovnik, Croatia, 1998; 18th Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Tacoma, Washington, USA, 1999; Intern. Congress on Circumpolar Health, Harstad, Norway, 2000; Intern. Conf. on Bacterial and Viral Virulence Factors, Smolenice, Slovakia, 2000; 19th Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), St. Louis, Missouri, 2000; 3-rd Intern. Conf. on Emerging Zoonoses 2001, Noordwijkerhout, Holland, 2001; Intern. Conf. On Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, 2002; X междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине экологии», Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2002; Intern. Biological Medical Conf. 2003, Prophylaxis and treatment of BW health disorders, Munich, Germany, 2003; 22nd Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Anaheim, California, USA, 2003; Intern. Conf. On Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, 2004; Междун. конф. «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» - Сосновка, Новосибирская обл., 2004; 23rd

Conference of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Atlanta, Georgia, 2004; Intern. Biological Medical Defense Conf. 2004, Munich, Germany, 2004; Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 2004; European Aerosol Conference, Budapest, Hungary, 2004; 2-й Междун. конф. «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда», Пущино, Московская обл., 2005; XIII Intern. Cong, of Virology, San Francisco, California, USA, 2005; Intern. Biological Medical Defense Conf. 2005, Munich, Germany, 2005; III Рос. Научн. конф. с междун. участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2006, Новосибирск; 9th World Conf. on Biosensors, Toronto, Canada, 2006; Междун. конф.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07», Гурзуф, Украина, 2007; 11-th Intern. Biological Medical Defense Conf. 2007, Munich, Germany, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ, в т.ч. 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертационной работы, списка цитируемой литературы (511 ссылок), раздела с благодарностями и приложения. Работа изложена на 324 страницах, включая 14 рисунков и 29 таблиц.

Похожие диссертации на Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов

Системный подход при выборе биоцидных препаратов для обработки бумаги документов, поврежденных микромицетамиТрепова, Екатерина Сергеевна

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекцийАгафонов, Александр Петрович

Структурно-функциональная вариабельность антигенов Y. pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратовГремякова Татьяна Андреевна

Молекулярные механизмы подавления антиинфекционных защитных систем клетки-хозяина на модели экспериментальной полиовирусной инфекцииКондратова Анна Анатольевна

Разработка модели хронической туберкулезной инфекции и ее использование для отбора перспективных вакцинных штаммов Mycobacterium tuberculosisШрамко, Павел Александрович

Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс]Снатенков Евгений Александрович

Использование ионизирующего излучения и иммуностимуляторов для усовершенствования средств и методов диагностики герпесвирусных инфекцийСафин Мунир Вазыхович

Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции [Электронный ресурс]Алтухова Виктория Владимировна

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитовМазепа, Владимир Николаевич

Обоснование методических подходов к выбору и использованию тест-объектов для биомониторинга загрязнения водных объектов соединениями мышьяка : на примере ОУХО "Марадыковский" Кировской областиМальцева, Светлана Александровна