Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Латеральный проточный иммуноанализ 8
1.1. Строение иммунохроматографической тест-полоски 10
1.2. Теоретические основы латерального проточного иммуноанализа 13
1.3. Основные компоненты иммунохроматографических тест-систем 17
1.3.1. Аналитическая мембрана 17
1.3.1.1. Полимерный состав и свойства мембран 17
1.3.1.2. Факторы, влияющие на сорбцию белков на мембране 20
1.3.2. Мембрана для нанесения образца 22
1.3.3.Мембрана для нанесения конъюгата 23
1.3.4.Абсорбирующая (впитывающая) мембрана 23
1.3.5.Антитела в иммунохроматографическом анализе 24
1.3.6. Метки, используемые в иммунохроматографическом анализе 25
1.3.6.1. Латексные частицы 26
1.3.6.2. Флуоресцентные метки 26
1.3.6.3. Квантовые точки 27
1.3.6.4. Парамагнитные частицы 28
1.3.6.5. Коллоидное золото 29
1.3.6.6. Нанооболочки 32
Глава 2. Биохимические маркеры для диагностики острого инфаркта миокарда 35
2.1. Белок, связывающий жирные кислоты (с-БСЖК) 36
2.1.1. Структура и функции с-БСЖК 36
2.1.2. Методы определения с-БСЖК 40
2.2. Тропонин 43
2.2.1. Структура и функции тропонина 43
2.2. 2. Методы определения тропонинов 46
III. Экспериментальная часть 50
Глава 3. Материалы и методы 50
3.1. Материалы и оборудование 50
3.2. Методы исследования 52
3.2.1. Получение наночастиц коллоидного золота по методу Френса 52
3.2.2. Получение золотых нанооболочек на сферах из диоксида кремния 52
3.2.3. Определение оптимальных условий сорбции антител на наночастицах золота53
3.2.4. Получение конъюгата частиц золота с антителами 54
3.2.5. Получение конъюгата наносфер с антителами 54
3.2.6. Составление иммунохроматографической тест-полоски 54
3.2.7. Проведение иммунохроматографического анализа 55
3.2.8. Определение чувствительности и специфичности тест-системы 55
IV. Результаты и обсуждение 57
Глава 4. Получение наночастиц золота и конъюгатов антител на их основе 57
4.1. Получение и характеристика наночастиц золота 57
4.2. Получение конъюгатов антител, специфичных к с-БСЖК, с наночастицами золота .60
Глава 5. Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения С-БСЖК 64
5.1. Оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с использованием в качестве метки наночастиц золота для определения с-БСЖК 64
5.1.1. Выбор пары антител 64
5.1.2. Влияние размеров наночастиц золота на аналитические характеристики тест системы 66
5.1.3. Выбор аналитической мембраны 67
5.1.4. Оптимизация концентраций специфических реагентов 69
5.1.5. Выбор мембран для нанесения образца 71
5.2. Иммунохроматографический анализ с-БСЖК с использованием золотых нанооболочек в качестве метки 75
5.2.1 .Получение и характеристика золотых нанооболочек 75
5.2.2. Использование нанооболочек в качестве метки в иммунохроматографическом
анализе 81
5.3. Определение с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека 83
5.4. Стабильность тест-системы с-БСЖК 86
Глава 6. Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения тропонина 88
6.1. Получение конъюгатов антител, специфичных к тропонину I, с наночастицами золота 88
6.2. Оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с использованием наночастиц золота для определения тропонина 1 91
6.2.1. Выбор пары антител 91
6.2.2. Выбор мембран 92
6.2.3. Влияние размеров наночастиц золота на аналитические характеристики тест системы 94
6.3. Определение тропонина І в сыворотке и цельной крови 95
6.4. Стабильность тест-системы тропонина 1 98
Глава 7. Определение с-бсжк и тропонина i и в образцах сыворотки крови 101
Глава 8. разработка иммунохроматографическои тест-системы для одновременного определение с-бсжк и тропонина 1 105
VI. Список литературы 1
- Факторы, влияющие на сорбцию белков на мембране
- Структура и функции с-БСЖК
- Получение золотых нанооболочек на сферах из диоксида кремния
- Получение конъюгатов антител, специфичных к с-БСЖК, с наночастицами золота
Введение к работе
Актуальность темы.
Лабораторная диагностика является неотъемлемой частью современной медицины, без которой немыслима полноценная врачебная помощь. Методы лабораторной диагностики довольно многочисленны и продолжают активно развиваться. Широкое применение в клинической диагностике нашли иммунохимические методы, в частности, методы иммуноферментного анализа. В течение последнего десятилетия в мировой аналитической практике очень интенсивно развиваются иммунохимические методы экспресс-анализа, которые приходят на смену стандартным методам иммуноферментного анализа благодаря своим преимуществам - простоте выполнения, возможности проведения анализа во внелабораторных, а зачастую и в домашних условиях, отсутствию необходимости использования дорогостоящих приборов, высокой чувствительности, возможности визуальной регистрации результатов анализа, низкой стоимости и т.д. Наиболее распространенным вариантом является метод латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА), также известный как иммунохроматографический анализ (ИХА). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, содержащих все необходимые для анализа компоненты в готовом виде. В качестве метки используются наночастицы золота, позволяющие визуально детектировать результаты анализа.
Методы иммунохроматографического анализа наиболее подходят для определения веществ, содержание которых в норме незначительно или отсутствует, и значительно возрастает при развитии патологии. К таким веществам относятся кардиомаркеры, определение которых является актуальным для диагностики различных сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе острого инфаркта миокарда (ОИМ). Развитие ОИМ сопровождается обширным разрушением кардиомиоцитов и выбросом в кровь многих специфических белков.
В настоящее время наиболее предпочтительными биохимическими маркерами повреждения миокарда являются тропонины вследствие их абсолютной кардиоспецифичности. При повреждении миокарда повышенная концентрация тропонина в крови обнаруживается через 3-4 часа, пик приходится на 3-4 сутки, и она остается повышенной до 7-10 дней. Однако определение тропонинов не подходит для ранней диагностики ОИМ, поэтому наряду с исследованиями тропонинов рекомендуется определять ранние миокардиальные маркеры.
Автор выражает искреннюю благодарность доценту кафедры химической энзимологии, к.х.н. Осипову А.П. и н.с, к.х.н. Андреевой И.П. за участие в постановке задач и обсуждении результатов.
Выбор второго объекта исследования - белка, связывающего жирные кислоты (с-БСЖК), обусловлен актуальностью проблемы ранней и точной диагностики острой ишемической болезни, включая острый инфаркт миокарда, в современной кардиологии. В настоящее время ни один из известных методов не гарантирует надежной диагностики ОИМ на ранней стадии болезни. Так, например, до 25% всех ОИМ не вызывают никаких изменений на кардиограмме (ЭКГ), от 20% до 30% всех случаев ОИМ протекают без болевого приступа, особенно у пожилых, а также больных диабетом и гипертонической болезнью. Недавно в качестве нового биохимического маркера ранней диагностики ОИМ был предложен с-БСЖК. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину, концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа. Этот факт, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с миоглобином, делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.
Одновременное определение с-БСЖК и тропонина I повышает эффективность диагностики ОИМ на ранних стадиях, позволяет определить скрытые формы инфаркта.
В настоящее время на отечественном рынке экспресс тест-системы на основе ЛПИА, в основном, представлены продукцией зарубежных производителей. В связи с этим актуальным с точки зрения потребности практики и развития технологической и реагентой базы является проведение исследований по созданию практически значимых аналитических систем отечественного производства на основе латерального проточного иммуноанализа.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение основных принципов создания тест-систем на основе латерального проточного иммуноанализа для определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I, а также их совместного одновременного определения в сыворотке и цельной крови.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
получение и характеристика наночастиц золота;
изучение условий стабильности золотых наночастиц и конъюгатов с антителами на их основе;
изучение влияния мембран, размера наночастиц золота, соотношения антител на чувствительность и специфичность иммунохроматографического анализа;
оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с-БСЖК и тропонина I;
оптимизация условий проведения совместного одновременного анализа с-БСЖК и тропонина I;
апробация разработанных тест-систем на образцах крови пациентов.
Научная новизна. Разработаны основные подходы к созданию иммунохроматографических тест-систем с использованием наночастиц золота для определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I для диагностики острого инфаркта миокарда. Изучено влияние свойств мембран, размера наночастиц золота на результаты проведения иммунохроматографического анализа, определены оптимальные соотношения антител, иммобилизованных на мембране и меченых наночастицами золота, условия сорбции антител на наночастицах золота.
В результате выполнения данной работы были разработаны высокочувствительные методы для определения с-БСЖК и тропонина I с использованием в качестве визуальной метки наночастиц золота.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований созданы тест-системы для индивидуального определения с-БСЖК, тропонина I, а также для их совместного одновременного визуального экспресс определения.
В проведенных исследованиях была показана возможность определения с-БСЖК и тропонина І в сыворотке и цельной крови практически здоровых людей и пациентов с диагнозом острого коронарного синдрома. Было показано, что разработанные тест-системы обладают высокой чувствительностью и специфичностью для диагностики острого инфаркта миокарда на ранних стадиях. Разработанные экспресс тест-системы можно использовать в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений кардиологического профиля, а также отделениях скорой помощи и кардиореанимации для подтверждения или опровержения диагноза острого инфаркта миокарда на ранних и более поздних стадиях заболевания.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010), VI Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций» (Москва, 2011), 5м Конкурсе проектов молодых ученых в рамках 16й международной специализированной выставки «Химия-2011» (Москва, 2011), VII Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва,
2013), Международной конференции «Биокатализ-2013: Фундаментальные основы и применение» (Москва, 2013).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах из Перечня журналов ВАК, 6 тезисов докладов международных и российских конференций.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), экспериментальной части (глава 3), описывающей материалы и методы исследования, результатов и обсуждения (главы 4-8), выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 121 странице, содержит 10 таблиц и 62 рисунка. Список литературы включает 134 ссылки.
Используемые сокращения. ИФА - иммуноферментный анализ, ЛПИА -латеральный проточный иммуноанализ, ИХА - иммунохроматографический анализ, БСА - бычий сывороточный альбумин, ЗХВК - золотохлористоводородная кислота, МАт - моноклональные антитела, НЧЗ - наночастипы золота, ОИМ - острый инфаркт миокарда, ПАт - поликлональные антитела, с-БСЖК - белок, связывающий жирные кислоты из сердца человека, ТнІ - тропонин I, ФБ - 0,01 М К-фосфатный буфер, рН 7,4; ФБС - 0,01 М К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl; ФБСТ - 0,01 М К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20.
Факторы, влияющие на сорбцию белков на мембране
Количество белка, связанного на пористой мембране, определяется в основном внутренней поверхностью пор, доступной для иммобилизации. При прочих равных параметрах величина внутренней поверхности мембраны, доступной для связывания нелинейно уменьшается с увеличением размера пор, линейно возрастает при увеличении толщины мембраны и нелинейно возрастает при увеличении пористости [17].
При иммобилизации антител на аналитическую мембрану ширина тестовой и контрольной линий может также варьироваться в зависимости от характеристик мембраны: толщины, смачиваемости мембраны, скорости протекания жидкости. При иммобилизации антител в случае тонкой мембраны количество раствора распространяется на большей поверхности мембраны. При увеличении концентрации ПАВ в составе мембраны ширина реакционной полосы может увеличиваться, что в свою очередь может приводить к уменьшению интенсивности наблюдаемого сигнала и потере чувствительности анализа. По этой причине необходимо для каждой используемой мембраны соблюдать определенную концентрацию ПАВ, соответствующую оптимальным параметрам анализа и аналитическим характеристикам. Скорость потока жидкости по мембране также может оказывать влияние на ширину реакционной линии: при увеличении скорости распространения жидкости по мембране ширина линии увеличивается. Чтобы этого не происходило, можно уменьшить концентрацию ПАВ в растворе, или вводить специальные добавки в буферный раствор [18].
Состав буферной смеси для нанесения специфических антител в тестовую и контрольную зоны. Состав буферной смеси имеет большое значение для условий адсорбции иммунохимических реагентов на мембране и сохранения их активности этих реагентов после высушивания, хранения и последующей реактивации при проведении анализа. Конкретный состав буферной смеси обычно определяется индивидуальными свойствами используемых при адсорбции на мембранах специфических компонентов.
Выбор буферной смеси имеет значение с точки зрения достижения наилучшего связывания активных компонентов на мембране и последующего соблюдения оптимальных условий для протекания специфических реакций в процессе проведения анализа. Как минимум, это требование должно выполняться для величины рН буферного раствора. При нанесении на мембрану специфического компонента возможно использование различных буферных растворов, например, фосфатного, боратного, трисового, карбонатного и др. Но поскольку при высушивании мембраны с нанесенными компонентами концентрация соли сильно возрастает, это может существенно сказываться на структуре адсорбированных белковых молекул и их стабильности. Например, при использовании трисового буферного раствора, содержащего первичные аминогруппы, последние способны образовывать прочные солевые связи с отрицательно заряженными карбоксильными группами аминокислотных остатков белков, нарушающими эффективность специфических взаимодействий с аналитом. По этой же причине соли натрия предпочтительнее солей калия. Для работы в области рН 4-6 возможно использование ацетата аммония, который практически полностью удаляется при высушивании [16,24].
Выбор рН. Величина растворимости белков обусловлена зарядом поверхности белковой молекулы и минимальна вблизи изоэлектрической точки белка. Поэтому при нанесении белка на поверхность мембраны желательно использовать рН раствора вблизи изоэлектрической точки наносимого белка (pl±l). Большинство антител имеет изоэлектрическую точку р! от 5,5 до 7,5, в связи с чем оптимальным значением рН буферного раствора для нанесения антител является рН 7,0-7,5 [17, 24].
Ионная сила. При нанесении растворов антител на мембрану желательно использовать как можно меньшую величину ионной силы буферного раствора, так как ионная сила способна уменьшать электростатические взаимодействия между антителами и мембраной, принимающими участие в сорбционном процессе. Аналогичный эффект оказывает физиологический раствор, способствующий повышению растворимости антител, но снижающий их гидрофобную сорбцию на мембране. Увеличение молярности буфера приводит к увеличению количества соли, которая остается в порах после высушивания мембраны, что приводит к их забиванию и ухудшению капиллярных свойств мембраны при проведении анализа. Поэтому, как правило, сорбционный буферный раствор имеет молярность не превышающую 10 мМ Следует по возможности избегать добавления в раствор хлористого натрия, если этого не требуется для поддержания активности или стабильности адсорбируемых антител [17, 24].
Использование метанола, этанола или изопропанола. Добавление в раствор таких спиртов, как метанол, этанол или изопропанол в концентрациях от 1 до 10 % по весу оказывается благоприятным по следующим трем причинам. Во-первых, присутствие спирта способствует лучшему проникновению антител в поры мембраны благодаря уменьшению вязкости раствора, поверхностного натяжения и электростатического отталкивания. Во-вторых, небольшие количества спирта приводят к снижению растворимости антител без изменения эффективности взаимодействий и изменения структуры центров связывания молекул. В третьих, присутствие даже небольших количеств спирта в буферном растворе приводит к улучшению процесса сушки мембран после нанесения адсорбируемых антител. Подбор оптимальной концентрации спирта для конкретной системы необходимо осуществлять эмпирическим путем [17].
Структура и функции с-БСЖК
На сегодняшний день разработано достаточно много различных вариантов количественного и качественного отпределения тропонинов (ТнТ и ТнІ) в крови или моче пациента на основе иммунохимических методов, имующих как принципиальные, так и второстепенные различия.
В настоящее время уровень ТнТ в сыворотке можно определять количественным методом с использованием иммуноферментного анализатора фирмы Boehringer Mannheim-ELISA (Enzymun Test System - ES300) фотометрическим способом [117, 118]. Время проведения анализа 90 минут, что не совсем удобно в экстренных ситуациях. Для повседневной клинической практики, когда принципиальным является факт обнаружения диагностически важного уровня ТнТ, наиболее удобен качественный метод определения ТнТ (Boehringer Mannheim). Тест проводится на планшете с адсорбированными на ней двумя видами моноклональных антител, специфичных к ТнТ: биотинилированные и меченые золотом. Для получения результата требуется 20 минут, минимальный фиксируемый уровень 0,2 иг/мл [119].
Одним из первых методов количественного определения ТнІ был радиоиммунологический метод иммуноанализа [120], в котором использовались поликлональные кроличьи антитела против ТнІ. Предел обнаружения данного метода составлял 10 нг/мл, перекрестная реакция со скелетным тропонином I составляла 2%.
В 90-е годы был разработан одностадийный "сэндвич" метод, в котором были использованы моноклональные антитела, узнающие разные эпитопы молекулы ТнІ [121]. Предел обнаружения данного метода составлял 0,2 нг/мл. Стандартная кривая для данного метода была линейной в области от 0 до 20 нг/мл. Позднее были разработаны многочисленные автоматические методы определения Тн1, основанные на флуоресцентной, хемилюминесцснтной или электрохимической детекции с использованием различных анализаторов, которые позволяют значительно увеличить чувствительность определения ТнІ [122 - 124].
Компанией Beckman был разработан гомогенный иммуноферментный метод определения Тн1 с использованием хемилюминесцентной детекции [125]. Образец сыворотки крови добавляется к антителам, адсорбированным на магнитных частицах, и конъюгату моноклональных антител со щелочной фосфатазой. В качестве субстрата используется Lumi-Phos 530. Интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации тропонина в образце. Предел обнаружения данного метода составил 0,01 нг/мл. Компанией Abbott был предложен иммуноферментный метод определения ТнІ в крови или плазме крови с использованием электрохимической детекции [124]. На электрохимический сенсор, размещенный на кремниевой пластинке в картридже иммобилизованы моноклональные антитела, специфичные к ТпІ. На рабочий электрод добавляются конъюгат поликлональных антител со щелочной фосфатазой и анализируемый образец. В процессе инкубации (7 минут) на электрохимическом сенсоре образуется тройной комплекс антитело-антиген-меченое антитело. После добавления субстрата щелочной фосфатазы образуется электроактивный продукт, количество которого прямо пропорционально концентрации ТпІ в образце. Предел обнаружения метода составляет 0,02 нг/мл. Полученные данным методом калибровочные кривые позволяют определять концентрацию сТпІ в образце в диапазоне от 0,02 до 50,00 нг/мл. Был также разработан турбидиметрический метод определения концентрации ТпІ, основанный на агглютинации частиц латекса, сенсибилизированных антителами [126]. Две пары моноклональных антител, специфичных к разным эпитопам молекулы, адсорбируются на карбоксилированных частицах латекса. После добавления образца плазмы в предварительно подготовленную реакционную среду происходит взаимодействие ТнІ с антителами, связанными с латексными частицами. В результате чего происходит агглютинация частиц латекса, которая регистрируется по изменению поглощения реакционной смеси. Данный метод проводился на автоматическом анализаторе Dimension Vista 1500 (Siemens Diagnostics), концентрация ТнІ в образце рассчитывалась автоматически. Предел обнаружения метода составил 0,04 нг/мл, калибровочная кривая была линейна в области от 0 до 50 нг/мл.
В последние годы были разработаны простые качественные тесты для определения ТнІ в цельной крови, основанные на принципе латерального проточного иммуноанализа. Эти методы являются быстрыми и удобными в использовании и могут применяться в нелабораторных условиях для подтверждения или опровержения диагноза ОИМ в критических ситуациях. Одним из первых был разработан иммунохроматографический тест Cardiac STATus (Spectral Diagnostics, Canada), способный определять ТнІ в крови, сыворотке крови или плазме [127]. Образец при нанесении его на полоску под действием капиллярных сил движется вдоль нее. ТнІ, находящийся в образце, связывается с парой моноклональных антител 81-7 и 21-14, меченых коллоидным золотом, и с биотинилированными поликлональными антителами с образованием тройного комплекса, затем в аналитической части мембраны комплекс связывается с иммобилизованным стрептавидином, образуя окрашенную тестовую полосу. Предел обнаружения этого теста составил 0,01 нг/мл. Не было обнаружено перекрестной реакции с сердечным тропомиозином, сердечным ТнТ, ТнС, скелетной изоформой ТнІ [128, 129].
В настоящее время на рынке представлено множество иммунохроматографических тестов для определения ТнІ. Образец крови наносится на полоску, при прохождении которой ТнІ из образца вначале связывается с конъюгатом моноклональных антител с коллоидным золотом, а затем с иммобилизованными в тестовой зоне полоски моноклональными антителами. Избыток детектирующего реагента задерживается в контрольной зоне. Если количество ТнІ в образце меньше предела обнаружения, на полоске образуется одна красная линия, если больше - две красные линии в тестовой и контрольной зонах. Пределы обнружения таких тестов варьируются от 0,3 нг/мл (тест BIOCARD Troponin I, Финляндия) до 2 нг/мл (Hexagon Troponin, Германия и Troponitest+, Франция) [130].
Компанией Zephyr Biomedicals (India) был разработан полуколичественный тест Amicheckrop, также основанный на методе иммунохроматографии [130]. В отличие от предыдущих тестов, на аналитической части мембраны выделяют 3 зоны: тестовую, контрольную и референсную. Интенсивность окраски референсной зоны соответствует концентрации ТнІ 1 нг/мл. Сравнивая интенсивность окраски референсной и тестовой зоны, можно оценить концентрацию ТнІ в образце. Если интенсивность линии в тестовой зоне меньше, чем в референсной, то концентрация ТнІ соответствует 0,3-1 нг/мл, если же интенсивность линии в тестовой зоне совпадает или выше, чем в референсной зоне, то концентрация ТнІ в образце более 1 нг/мл.
Также разработаны иммунохроматографические тест-системы для одновременного определения ТнІ в сочетании с миоглобином и/или КФК-МВ. В работе [131] сообщается о создании иммунохроматографической тест-системы для совместного определения высокочувствительного ТнІ и миоглобина. Предел обнаружения ТнІ составил 1пг/мл. Компанией Cortez Diagnostics, Inc разработан мультитест для диагностики ОИМ - "OneStep 3 in 1 Troponin I/CK-MB/Myoglobin RapiCard InstaTest", позволяющий одновременно определять тропонин I, миоглобин и изоформу креатинфосфокиназы [131]. Предея обнаружения ТнІ
Получение золотых нанооболочек на сферах из диоксида кремния
Для разработки иммунохроматографической тест-системы для определения с-БСЖК была использована сэндвич-схема анализа, которая подробно рассмотрена в литературном обзоре (Рис. 2). На аналитической части мембраны в тестовой зоне иммобилизованы специфические антитела к с-БСЖК. На мембране для конъюгата иммобилизованы специфические антитела к с-БСЖК, меченые НЧЗ. При нанесении образца, содержащего с-БСЖК, на мембрану антиген сначала связывается с мечеными антителами, образуя комплекс, который движется с капиллярным потоком к тестовой зоне мембраны. В тестовой зоне комплекс антиген-меченое антитело взаимодействует с иммобилизованными антителами, образуя окрашенный тройной комплекс. Интенсивность окраски тестовой линии прямо пропорциональна содержанию с-БСЖК в образце.
На первом этапе разработки метода ИХА для определения с-БСЖК было необходимо выбрать пару антител, иммобилизованных на фазе и меченых наночастицами золота, обеспечивающих максимальную чувствительность анализа с-БСЖК. Были изучены все возможные комбинации, когда на фазе нанесен один вид антител, а конъюгат приготовлен с другими антителами. Для каждой комбинации был проведен ИХА для стандартных растворов с-БСЖК в ФБСТ и были постоены градуировочные графики зависимости интенсивности полос (в условных единицах) от концентрации с-БСЖК в анализируемом растворе (Рис. 18). -
Самая высокая чувствительность и аналитический сигнал были получены для пары моноклональных антител MAT F10 , иммобилизованных на аналитической мембране 150-N-CNPH, и MAT F9 , меченых наночастицами золота (Рис. 18, кривая «1»), В случае использования поликлональных антител ГТАт К5 , иммобилизованных на мембране, в комбинации с тем же конъюгатом, сигнал заметно уменьшался, и наблюдалось присутствие фонового сигнала (Рис. 18, кривая «2»). Результаты анализа с мечеными наночастицами золота MAT F10 были хуже как с моноклональными, так и с поликлональньгми антителами (Рис. 18. кривые «3» и «4», соответственно). При использовании поликлональных антител, иммобилизованных на мембране и меченых наночастицами золота, например, ПАт К5 с конъюгатом НЧЗ-ПАт К10 (Рис. 18, кривая «5»), наблюдался низкий сигнал, присутствие фонового сигнала и самая низкая чувствительность анализа. Возможно, это связано с тем, что поликлональные антитела связываются с небольшой по размеру молекулой с-БСЖК, блокируя доступные эпитопы связывания в аналитической зоне.
Было предложено модифицировать схему проведения анализа, чтобы разделить две стадии сэндвич-анализа. Для этого вначале через аналитическую зону тест-полоски пропускали исследуемый образец, затем добавляли конъюгат антител с наночастицами золота. В данном случае сначала образовывался комплекс с-БСЖК с антителами, иммобилизованными в аналитической зоне, а затем после добавления меченых антител образовывался тройной комплекс. Из анализа полученных кривых (Рис. 19) следует, что чувствительность двустадийного анализа при использовании пары поликлональных антител не увеличилась, а при использовании пары иммобилизованные поликлональные антитела-конъюгат с моноклональными антителами увеличение сигнала наблюдалось лишь при высоких концентрациях с-БСЖК. Таким образом, дальнейшие эксперименты проводились с MAT F10 , иммобилизованными в тестовой зоне мембраны, и конъюгатом с H43-MAT F9 . 60 80 100
Далее было изучено влияние размера наночастиц золота на чувствительность анализа. Для выбранной ранее пары антител были получены градуировочные зависимости для конъюгатов MAT F9 на основе наночастиц золота различного диаметра: 15 нм, 25 нм и 35 нм (Рис. 20). Полученные кривые показывают, что при увеличении размера частиц золота аналитический сигнал значительно возрастает. Это согласуется с литературными данными [133], где было показано возрастание величины коэффицинта экстинции растворов FW3 с увеличением размеров частиц. Увеличение аналитического сигнал при использовании НЧЗ большого диаметра также может быть связано с тем, что человеческий глаз лучше воспринимает более контрастный пурпурный цвет, характерный для большого размера золота. Однако происходит появление фонового сигнала, нежелательного при визуальной оценке результатов экспресс-теста.
Следующим этапом работы был выбор аналитических мембран, которые являются основными компонентами иммунохроматографической тест-системы. Для экспериментов было использовано три вида нитроцеллюлозных мембран, отличающихся по сорбционной емкости, скорости протекания жидкости, размерам пор - CNPF (10ц), CNPC (15ц) и 150-N-CNPH. Основные характеристики изучаемых мембран приведены в таблице 3.
Связывающая способностьбелков низкая средняя высокая Из всех представленных мембран самый низкий аналитический сигнал наблюдался при использовании мембраны CNPC с размером пор 15ц и наименьшим временем протекания жидкости (Рис. 21). С увеличением размера пор мембраны скорость протекания образца возрастает, но при этом сокращается время взаимодействия антигена в образце с антителами, иммобилизованными на мембране, о чем свидетельствует снижение аналитического сигнала. Похожие результаты были получены при использовании мембран CNPF (10ц) и 150-N-CNPH, характеризующихся большим временем протекания жидкости.
Для мембран 150-N-CNPH и CNPC (15ц) была изучена зависимость интенсивности аналитического сигнала от времени анализа (рис. 22). Для мембраны CNPC, характеризующейся самой высокой скоростью протекания жидкости (100 сек/4 см), интенсивность аналитического сигнала через 10 минут после начала анализа в 2 раза превышала аналогичный для мембраны 150-N-CNPH (150 сек/4 см). В связи с этим для дальнейших экспериментов была выбрана мембрана CNPC, так как при схожих с 150-N-CNPH значениях аналитического сигнала мембрана CNPC обеспечивала более короткое время проведения анализа, что важно для экспресс-диагностики.
В работе было изучено влияние условий проведения сушки иммобилизованных на мембране антител (температуры и времени) на величину измеряемого аналитического сигнала. Сушка проводилась при комнатной температуре, при 37С и при 50С в течение 2ч, 5ч, 24 ч и 48 ч. Исходя из полученных данных, в качестве оптимальных условий сушки были выбраны 37С в течение 24 часов.
Для выбора оптимальных концентраций антител MAT F10 , иммобилизованных на аналитической мембране и конъюгата H43-MAT F9 были получены градуировочные графики при различных концентрациях специфических компонентов (Рис. 23). Из анализа полученных кривых следует, что при увеличении концентрации сорбированных MAT F10 (с 0,25 мг/мл до 1 мг/мл в ФБС) и количества конъюгата (с 5 мкл до 10 мкл на полоску) происходит увеличение интенсивности регистрируемого сигнала и наклона градуировочного графика на начальном отрезке, что характерно для сэндвич-методов анализа. Однако в случае использования в анализе иммобилизованных MAT F10 С концентрацией 1 мг/мл наблюдалось появление фонового сигнала, то есть наличие неспецифического взаимодействия в условиях отсутствия с-БСЖК в анализируемом растворе, что крайне важно при визуальной оценке результатов анализа в не лабораторных условиях. Таким образом, в качестве оптимальной концентрации реагентов была выбрана концентрация иммобилизованных антител MAT F10 равная 0,5 мг/мл при нанесении конъюгата на стекловолоконную мембрану для конъюгата в количестве 7,5 мкл (А52о=2 опт.ед.).
Получение конъюгатов антител, специфичных к с-БСЖК, с наночастицами золота
Для получения конъюгатов золотых нанооболочек с антителами были выбраны частицы, полученные при смешении ростового раствора и силикатных частиц, покрытых золотыми «зародышами», в соотношении 10:1, которые имели наиболее полное и равномерное золотое покрытие силикатных ядер. Золотые нанооболочки очищали от избытка продуктов реакции многократным центрифугированием и перерастворением в дистиллированной воде. Конъюгаты с золотыми нанооболочками были получены по методу, аналогичному для наночастиц золота.
Одной из целей настоящей работы было изучение возможности использования золотых нанооболочек в качестве метки в латеральном проточном иммуноанализе. С помощью разработанной в настоящей работе тест-системы для определения с-БСЖК было проведено сравнение наночастиц золота и золотых оболочек, используемых в качестве меток в ИХА (Рис. 34, 35). Для проведения ИХА анализа были выбраны нанооболочки с диаметром силикатного ядра 120 нм. При использовании частиц более крупного диаметра, аналитический сигнал уменьшался, и наблюдалась темная полоса у начала мембраны. Возможно, это связано с тем, что крупные частицы агрегируют и задерживаются у начала мембраны, не все частицы проходят через поры мембраны, и тестовой зоны достигает только малая часть частиц. Следует отметить, что перед проведением анализа необходимо было тщательно очистить конъюгат золотых нанооболочек с антителами многократным промыванием, чтобы избежать появления неспецифических взаимодействий в виде фонового сигнала. В случае использования золотых нанооболочек аналитический сигнал незначительно снижался, но чувствительность анализа при этом увеличивалась по сравнению с использованием в качестве метки наночастиц золота в 2 раза и составила 1,5 нг/мл. Стоит отметить, что сине-черный цвет полосы при использовании нанооболочек обладает более высоким контрастом по сравнению с розовым цветом в случае наночастиц золота.
Таким образом, впервые была показана возможность использования золотые нанооболочки в ИХА в качестве метки. Однако процесс получения золотых нанооболочек достаточно сложный и многостадийный, а их использование в ИХА в нашем случае не привело к ощутимому выигрышу в чувствительности, и с практической точки зрения использование наночастиц золота в качестве визуальной метки более предпочтительно. 5.3. Определение с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека
Одна из задач настоящей работы заключалась в создании тест-системы для экспресс-определения с-БСЖК как в сыворотке/плазме крови, так и в цельной крови. Это позволило бы легко и быстро проводить анализ не только в лабораторных условиях, но и в условиях скорой помощи, в отделениях кардиореанимации, а также у постели больного для подтверждения или опровержения диагноза острого инфаркта миокарда.
Компоненты, входящие в состав крови, могут оказывать существенное влияние на результаты анализа. В связи с этим разработанная ранее тест-система для иммунохроматографического определения с-БСЖК с наночастицами золота в качестве метки была использована для определения с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека. Градуировочные зависимости, полученные для стандартных растворов с-БСЖК в ФБСТ и сыворотке, не содержащей с-БСЖК, показали, что в случае проведения анализа в сыворотке крови уровень максимального сигнала выше по сравнению с аналогичными условиями анализа в буферном растворе, что свидетельствует о влиянии компонентов сыворотки крови на результаты анализа (Рис. 36).
Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов с-БСЖК, приготовленных: 1 - в сыворотке крови; 2 - в ФБСТ. Аналитическая мембрана CNPC, мембрана для образца GFB-R7L. Для проведения анализа с-БСЖК в цельной крови человека в первую очередь необходимо было подобрать мембрану для нанесения образца, которая позволяла бы фильтровать клетки крови и не пропускать их на аналитическую мембрану. Как правило, фильтрующие мембраны, обеспечивающие высокий выход плазмы из образца, более предпочтительны в ИХА, поскольку в данном случае в анализе можно использовать большие объемы образца, что значительно влияет на чувствительность анализа. Кроме того, при выборе мембран необходимо учитывать время протекания жидкости и степень вытекания на аналитическую зону эритроцитов, так как это приводит к помутнению протекаемой плазмы и появлению фонового сигнала, что затрудняет визуальную детекцию результатов. Мембрана GFB-R7L, выбранная ранее для определения с-БСЖК в сыворотке крови, оказалась не пригодна для определения аналита в цельной крови, так как она не предназначена для фильтрации кровяных клеток.
Было изучено 5 видов целлюлозных мембран, предназначенных для фильтрации красных кровяных клеток, отличающихся структурой, толщиной и способом применения -FR1(0,35), FR1(0,6), FR2(0,35), FR2(0,7), WFR1. Из всех представленных мембран только мембраны FR1(0,6) и FR1(0,35) хорошо отделяли красные кровяные клетки от плазмы и не пропускали их на аналитическую часть мембраны. Однако при использовании мембраны FR1(0,35) скорость протекания крови была значительно ниже, поэтому для дальнейших экспериментов была выбрана мембрана FR1(0,6).
Для данной мембраны было изучено влияние объема добавляемого образца и показано, что при увеличении объема крови (с 30 до 50 мкл) мембрана FR1(0,6) уже не полностью фильтровала кровь, и наблюдалось загрязнение аналитической части. Кроме того, наблюдалось присутствие фонового сигнала, поэтому в качестве оптимального был выбран объем образца крови 30 мкл.
Сравнение градуировочных графиков, полученных при использовании мембран GFB-R7L и FR 1(0,6) в сыворотке крови, показало, что в случае с мембраной FR1(0,6) аналитический сигнал уменьшается незначительно (Рис. 37). Таким образом, мембрана FR1(0,6) была выбрана для определения с-БСЖК как в сыворотке, так и в цельной крови человека.
Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов с-БСЖК, приготовленных в сыворотке крови и в цельной крови, не содержащей с-БСЖК, с использованием мембраны FR1(0,6) незначительно отличались друг от друга, и на результаты анализа это не оказывало существенного влияния (Рис. 38).
