Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 18
1.1. Диагностика инфаркта миокарда . 18
1.1.1. Миоглобин 24
1.1.2. Белок, связывающий жирные кислоты 24
1.1.3. Лактатдегидрогеназа 25 1.1.4 Креатинкиназа 26
1.1.5. Тропонин Т 26
1.1.6. Тропонин I 27
1.2. Тропонин I. Биохимия и применение в медицине 28
1.2.1. Тропониновый комплекс 28
1.2.2 Тропонин Т 29
1.2.3. Тропонин С 31
1.2 4. Тропонин I 34
1.2.5. Регуляция мышечного сокращения 35
1.2.6. Взаимодействие тропонина I с тропонином Т. 40
1.2.7. Фосфорилирование Tnl. 42
1.2.8. Ингибиторные участки Tnl и его взаимодействие с актином и тропомиозином . 46
1.2.9. Тропонин І в диагностике ИМ. 48
1.3. Белок, связывающий жирные кислоты 60
1.3.1. Общая характеристика 60
1.3.2. FABP как маркер инфаркта миокарда 67
ГЛАВА 2. 73
Материалы и методы 73
2.1. Получение моноклональных антител С5. 73
2.2. Определение классов и субклассов моноклональных антител. 74
2.3. Аффинная очистка моноклональных антител на РгА-Sepharose . 75
2.4. Определение концентрации моноклональных антител. 75
2.5. Образцы ткани. 75
2.6. Тестирование тканей. 76
2.7. Приготовление аффинной колонки для выделения тропонинового комплекса. 76
2.8. Определение концентрации cTnl, cTnT. 77
2.9. Получение конъюгата моноклональных антител с биотином. 77
2.10. Получение конъюгата моноклональных антител с хелатом европия 77
2.11. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле. 78
2.12. Окраска геля. 78
2.13. Иммуноблоттинг. 79
2.14. Приготовление растворов тропонина I. 79
2.15. Твердофазный иммуноферментный анализ. 80
2.16. Идентификация белков тропонинового комплекса. 81
2.17. Образцы сывороток от больных с инфарктом миокарда, нестабильной стенокардией и от здоровых доноров. 81
2.18. Выделение FABP. 82
2.19. Выделение тропонинового комплекса. 83
2.20. Приготовление аффинной колонки для получения
сыворотки, не содержащей cTnl. 84
2.21. Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной основе 84
2.22. Взаимодействие моноклональных антител с
синтетическими пептидами. 86
2.23. Моделирование некроза сердечной ткани. 87
2.24. Иммобилизация человеческого сердечного ТпС на BrCN-активированной сефарозе. 87
2.25. Исследование взаимодействия Tnl с иммобилизованным ТпС. 88
2.26. Фосфорилирование cTnl цАМФ-зависимой протеинкиназои. 89
2.27. Определение участков взаимодействия cTnl с ТпС. 90
ГЛАВА 3 91
Результаты и их обсуждение 91
3.1 Разработка нового метода выделения cTnl из сердца человека. 91
3.2 Получение моноклональных антител к cTnl. 103
3.3 Попытка разработки диагностической системы для количественного определения cTnl в крови больных с ИМ . 107
3.4 Влияние образования бинарного комплекса TnC - cTnl на взаимодействие антител с антигеном. 112
3.5 Изучение кинетики выведения очищенного cTnl и cTnl в форме комплекса с другими тропонинами из кровотока экспериментальных животных 122
3.4. Использование метода смешанного сэндвича для количественного определения бинарного комплекса cTnl - TnC
в крови больных. 125
3.5. Комплекс cTnl - сТпТ в крови больных инфарктом миокарда. 129
3.6. Получение нового поколения моноклональных антител к тропонину I, одинаково эффективно узнающих как свободный cTnl, так и cTnl в комплексе с другими тропонинами. 132
3.7. Синтез библиотеки пептидов cTnl и эпитопное картирование моноклональных антител. 134
3.8. Перекрестное взаимодействие МАТ с сердечными изоформами cTnI других видов животных. 151
3.9. Определение участков взаимодействия cTnl с ТпС. 152
3.10. Изучение биохимических факторов, оказывающих влияние на взаимодействие cTnl с антителами 158
3.10.1. Протеолитическая дефадация cTnl в ткани сердечной мышцы при некрозе. 158
3.10.2. Влияние молекулы ТпС на стабильность cTnl 169
3.10.3. Влияние фосфорилирования cTnl цАМФ-
зависимой протеинкиназои in vitro на связывание антител с cTnl. 171
3.10.4. Влияние гепарина на связывание антител с cTnl 177
3.11. Создание новой диагностической системы для количественного определения cTnl 179
3.12. Исследование влияния различных факторов на пару моноклональных антител 19С7 - 8Е10. 181
3.13. Предварительные клинические испытания новой диагностической системы. 185
3.14. Определение верхней границы нормы для cTnl. 186
3.15. Диагностическая система для количественного
определения белка, связывающего жирные кислоты (FABP). 189
3.16. Исследование содержания cTnl и FABP в сыворотках
больных инфарктом миокарда и нестабильной стенокардией. 197
3.17. Использовние полного тропонинового комплекса с качестве стандарта в диапностических системах 201
3.18. Использование тропонинового комплекса для калибровки диагностических систем. 205
Выводы 214
Список цитируемой литературы
- Диагностика инфаркта миокарда
- Ингибиторные участки Tnl и его взаимодействие с актином и тропомиозином
- Аффинная очистка моноклональных антител на РгА-Sepharose
- Попытка разработки диагностической системы для количественного определения cTnl в крови больных с ИМ
Введение к работе
Сердечно-сосудистые заболевания, а среди них - инфаркт миокарда (ИМ), стоят на первом месте среди причин смерти, опережая онкологические, инфекционные и другие заболевания. Часто болезнь развивается стремительно, и у врачей остаются часы, иногда минуты на то, чтобы поставить правильный диагноз. Поэтому, именно в случае ИМ ранняя и достоверная диагностика, своевременно начатое лечение могут спасти миллионы человеческих жизней.
Во всех развитых странах для диагностики ИМ в настоящее время применяются биохимические методы, основанные на измерении в крови концентрации или ферментативной активности белков - маркеров ИМ. Первым таким белком - маркером в середине пятидесятых годов стала аспартатаминотрансфераза (Ladue J. et al., 1954; Karmen A. et al., 1954). Позже, через год появились сообщения о возможности использования для диагностики ИМ лактатдегидрогеназы (Wroblewski F. et al., 1955; Vessell E. et al., 1957), затем появились работы, посвященные креатинкиназе (Dreyfus J.et al., 1960; Van der Veen K. et al., 1966; Konttinen A. et al., 1975), миоглобину (Grenadier E.et al., 1983), легким и тяжелым цепям миозина (Trahem С. et al., 1978) и целому ряду других белков, которые впоследствии долгое время использовались в клинической практике. Все эти белки различались по молекулярной массе, времени появления в кровотоке после начала заболевания, времени выведения из кровотока и другим параметрам. Однако, всех их объединяло один очень важный недостаток - все они не были абсолютно кардиоспецифичны. Даже "золотой стандарт" последних двух десятилетий - MB изоформа креатинкиназы не позволяла врачам поставить правильный диагноз со стопроцентной гарантией.
В 1987 году было предложено использовать в качестве маркера некроза клеток сердечной мускулатуры белок тропонин I (Tnl) (Cummins В. et al., 1987). Tnl наряду с двумя другими белками - тропонинами Т и С (ТпТ и ТпС) является компонентом тропонинового комплекса, входящего в состав тонких филаментов поперечнополосатой и сердечной мускулатуры. Ранее было показано, что в организме человека существует изоформа Tnl (Syska Н. et al., 1974), которая исключительно кардиоспецифична, не синтезируется в других органах и имеет существенные различия в первичной структуре по сравнению с двумя другими изоформами этого белка, характерными для скелетной мускулатуры. Такие различия позволили получить сначала поликлональные, а затем и моноклональные антитела к сердечному Tnl (cTnl), не имеющие перекрестного взаимодействия со скелетными формами. И уже в 1992 году две группы исследователей из Англии и США сообщили о создании диагностических систем для количественного определения cTnl в крови больных (Larue С. et al., 1992; Bodor G. et al., 1992). С этого момента начинается широкомасштабное использование этого маркера в клинической практике, и на данный момент практически все крупнейшие мировые компании-производители медицинских диагностических систем выпускают или готовятся к выпуску диагностических систем для количественного или качественного определения cTnl в крови больных.
Причиной успеха cTnl у врачей-кардиологов стала, как указывалось выше, его исключительная кардиоспецифичность. На данный момент со всей очевидностью показано, что концентрация этого белка в крови превышает значения, характерные для нормы, только в случае наличия участка некротизации клеток сердечной мышцы (Bertinchant et al., 1996; Altinier S.et al., 1997). В отличие от миоглобина, креатинкиназы, тропонина Т и всех других использовавшихся ранее белков - маркеров ИМ, концентрация cTnl в крови не повышается ни в случае серьезных острых или хронических поражений скелетной мускулатуры, ни в случае почечной недостаточности. Таким образом, с врачи-кардиологи впервые получили в свое распоряжение уникальный инструмент с помощью которого появляется возможность поставить диагноз с очень высокой степенью достоверности.
Следует также отметить, что концентрация cTnl в крови здоровых людей очень низка. Это дает возможность регистрировать даже самое небольшое увеличение его концентрации в случае другого заболевания, зачастую связанного с гибелью клеток миокарда - нестабильной стенокардии.
Однако, несмотря на то, что cTnl широко используется в клинике уже почти на протяжении десяти лет, до сих не существует единого международного стандарта для тропониновых диагностических систем. Очевидно, такая ситуация сложилась из-за того, что до последнего времени оставался невыясненным вопрос, в какой биохимической форме этот белок попадает в кровяное русло и в каком виде существует в кровотоке. Без этих знаний невозможно выбрать одну, наиболее подходящую для использования с этой целью форму белка из многообразия полученных на данный момент форм cTnl (изолированной, в комплексе с другими белками, рекомбинантной и т.д.). Отсутствие точных знаний о представленной в кровотоке форме cTnl, делает невозможным и правильный подбор моно- или поликлональных антител для создания надежных диагностических систем, дающих достоверный результат при количественном исследовании cTnl в крови больного.
Следствием такого положения вещей явилось абсолютное отсутствие корреляции между результатами, полученными при использовании различных диагностических систем. На практике результаты измерения концентрации cTnl в одном и том же образце крови больного двумя различными (даже утвержденными FDA) диагностическими системами могут различаться на порядок и даже более. Это, в свою очередь, приводит в замешательство врачей, использующих тропониновые диагностические системы в клинической практике. Невозможность сравнить результаты, полученные в разных лабораториях на разных приборах, существенно тормозит развитие теоретических разработок, связанных с практическим применением данного маркера в клинической практике.
Работы по получению моноклональных антител к cTnl и по разработке диагностической системы для количественного определения этого белка в крови больных были начаты в нашей лаборатории в 1991 году. После первых же экспериментов по тестированию образцов сыворотки больных с помощью полученных антител, выяснилось, что cTnl в крови больного неоднороден и, что вероятно, представлен в виде различных биохимических форм. Для нас стало очевидно, что без детального изучения биохимических свойств этого белка в кровотоке невозможно создание надежной диагностической системы.
За прошедший с 1991 г. период нам удалось прояснить некоторые биохимические особенности cTnl циркулирующего в крови больного. Нами впервые было показано, что во-первых, значительная часть cTnl существует в крови больных с ИМ в виде комплекса с TnC (Katrukha et al., 1997), а во-вторых, большая часть cTnl в крови, представлена в виде протеолитических фрагментов, а не в виде целой молекулы, как считалось ранее (Katrukha et al., 1998). Мы убедительно показали влияние фосфорилирования молекулы cTnl цАМФ-зависимой протеинкиназои на взаимодействие ряда антител с антигеном и на необходимость учитывания этого фактора при подборе антител для диагностической системы. Было также установлено отрицательное воздействие гепарина на уровень сигнала ряда диагностических систем, что приводит к серьезному искажению результатов измерения белка в крови.
Анализируя результаты наших исследований, мы смогли подготовить рекомендации по подбору и тестированию антител, пригодных для создания надежных диагностических систем. Нами впервые было предложено использовать полный тропониновый комплекс для изготовления стабильных стандартов cTnl в диагностических системах, а наша идея по использованию этого комплекса в качестве международного иммунологического стандарта считается многими учеными наиболее перспективным направлением в развитии процесса стандартизации тропониновых диагностических систем.
Единственным недостатком cTnl как маркера некроза клеток сердечной мышцы является его недостаточно раннее появление в крови больных после появления первых признаков заболевания. Для того, чтобы лечение больных с ИМ и нестабильной стенокардией было наиболее эффективным и не сопровождалось всевозможными осложнениями, необходимо начинать его в течение полутора-двух часов после начала приступа. Однако, повышение концентрации cTnl в крови больного наблюдается обычно не раньше, чем через 4-6 часов после начала сердечного приступа, когда уже существенный участок сердечномышечной ткани подвергается необратимым некротическим изменениям. Безусловно, в этом случае терапевтическое вмешательство становится гораздо менее эффективным. Обычно в клинической практике для ранней диагностики ИМ используются диагностические системы, основанные на количественном определении в крови больного миоглобина. Однако, миоглобин не является кардиоспецифичным белком и при его применении в диагностике ИМ велик риск появления ложноположительных результатов.
В последнее время все больший интерес со стороны исследователей и компаний - производителей диагностических систем уделяется белку, связывающему жирные кислоты (fatty acid binding protein; FABP) как к возможному кандидату на замещение миоглобина при ранней диагностике ИМ (Glatz et al., 1988). FABP, имея сходную с миоглобином кинетику выделения после ИМ, является несравненно более кардиоспецифичным. Кроме того было показано, что использозание FABP наиболее эффективно именно при поражении сердечной мускулатуры.
В данной работе мы приводим результаты исследований, наглядно демонстрирующих, что FABP совместно с cTnl может быть успешно использован не только для диагностики ИМ, но и для диагностики заболеваний, связанных с незначительными повреждениями сердечной мышцы -такими как микроинфаркты и нестабильная стенокардия.
Диагностика инфаркта миокарда
В развитых европейских странах причиной примерно сорока процентов случаев смерти людей являются сердечно сосудистые заболевания и среди них на первом месте стоит ИМ (Yearly mortality data in the Nederlands. Mndber gezondheld (CBS), 1993, 126, 17.). Установлено, что ИМ начинается с образования тромба в одном из коронарных сосудов, что в скором времени приводит к ишемии низлежащих участков сердечной мышцы. Исследования на животных показали, что если просвет сосуда остается закрытым более 30 - 60 минут, то в гистологических препаратах, приготовленных из участка миокарда, который подвергался ишемии, появляются первые признаки некротизации ткани. Чем дольше продолжается ишемия, тем больший участок сердца подвергается необратимым изменениям. Поэтому, чем раньше начинается соответствующее лечение, направленное на удаление тромба и восстановление нормального кровотока в коронарном сосуде, тем благоприятнее исход заболевания (Vermeer F. et al., 1984; Simoons M et al., 1986). В последнее время в арсенале врачей -кардиологов появились действенные средства, такие как стрептокиназа, тканевой активатор плазминогена и целый ряд других препаратов (Rao A. et al. 1988;) Cheseboro J.et al., 1987, которые позволяют за относительно короткое время разрушить образовавшийся в коронарном сосуде тромб и, таким образом, восстановить нарушенное кровообращение. Однако, применение тромболитиков и лекарственных средств, препятствующих дальнейшему тромбообразованию связано с риском появления у больного целого ряда осложнений. Поэтому рекомендуется применять такие лекарственные препараты только в тех случаях, когда врач абсолютно уверен в факте развития у больного ИМ и существует реальная угроза для его (больного) жизни. Таким образом, быстрая и достоверная диагностика заболевания играет решающую роль при лечении больных.
Согласно рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (World Heart Organisation criteria for the diagnosis of acute myocardial infarction. Proposal for the multinational monitoring of trends and determination in cardiovascular disease. Geneva: Cardiovascular Disease unit of WHO, 1981.), диагноз "ИМ" может быть поставлен только в том случае, когда соблюдаются два из трех основных критериев заболевания:
1. Хараіггернал клиническая картина - наличие сжимающих загрудинных болей, пррадинрующих в челюсть и левую руку и длящихся 20 и более г/и нут
2. Появление хараістерньїх изменений в кардиограмме больного подъем сегмента ST с последующей его нормализацией и формированием инвертированных зубцов Т, а также развитие патологических зубцов Q.
3. Изменение во времени (подъем, а затем, после достижения пиковых значений, снижение) в крови больного концентрации биохимических маркеров ИМ.
Контроль по первым двум критериям легко осуществим и не требует дорогостоящего оборудования, но, в то же время, к сожалению, является недостаточно специфичным и не позволяет с полной уверенностью констатировать наличие у больного поражения сердечной мышцы. Так, сходная клиническая картина может быть характерна и для других, не связанных с сердцем заболеваний, а что касается ЭКГ, то по данным американских кардиологов, примерно в тридцати процентах случаев у больных с ИМ, особенно у больных с микроинфарктами, кардиограмма не изменена или наблюдаются столь несущественные изменения, что трактовать их однозначно не представляется возможным. И, наоборот, изменения, наблюдаемые в кардиограмме, могут быть связаны не с развивающимся в данный момент ИМ, а с хроническими или острыми патологическими событиями имевшими место ранее.
К наиболее специфичным методам диагностики ИМ можно отнести биохимические методы, основанные на регистрации в крови больного изменений концентрации или энзиматической активности того или иного маркера некроза клеток сердечной ткани (Lott J.et al., 1984; Lee Т. et al., 1986; Gibler W. et al., 1992). Однако, и в этом случае достоверность поставленного диагноза зависит от правильности выбранного маркера.
Ингибиторные участки Tnl и его взаимодействие с актином и тропомиозином
Как уже отмечалось, главной функцией Tnl является ингибирование АТФ-азной активности актомиозина (Leavis, Р.С. and Gergely, J., 1984). Это ингибирование усиливается в присутствии тропомиозина и полностью снимается в присутствии насыщенного ионами Са2+ TnC (Perry, S.V., 1979). Для понимания механизма функционирования Tnl необходимо подробно проанализировать его взаимодействие с актином, тропомиозином и тропонином С.
Для того, чтобы картировать участки Tnl, обеспечивающие его взаимодействие с другими компонентами тонкого филамента, были получены фрагменты Tnl. Среди фрагментов Tnl скелетных мышц был выявлен пептид, ограниченный остатками 96-116, который сохранял способность интактного белка ингибировать АТФазную активность актомиозина (Syska H.et al., 1976). Этот ингибиторный пептид подавляет сокращение скинированных скелетных и сердечных мышечных волокон, из которых предварительно был удален интактный Tnl (Van Eyk J.E.et al., 1993). Помимо этого, такой пептид сохраняет способность интактного белка взаимодействовать с актином и тропонином С (Syska H.et al., 1976). Позднее было установлено, что в структуре Tnl есть еще один дополнительный ингибиторныи пептид, ограниченный остатками 128-148 (Tripet B.,et al., 1997), также способный подавлять АТА-азную активность актомиозина. По данным ЯМР первый ингибиторныи пептид (остатки 96-116) взаимодействует с остатками 1-7 и 19-44 актина (Levine B.A.et al., 1988), т.е. располагается вблизи участков, обеспечивающих взаимодействие актина с миозином. Местоположение второго ингибиторного пептида Tnl на молекуле актина остается неизвестным. В литературе отмечают сходство первичных структур двух ингибиторных пептидов Tnl (остатки 101-114 и 121-132) (Pearistone J.R.et al., 1997).
В настоящее время подробно проанализирована роль отдельных аминокислотных остатков в структуре первого (главного) ингибиторного пептида Tnl. Минимальная последовательность, сохраняющая ингибиторные свойства, ограничена остатками 104-115, причем особая роль принадлежит остаткам 105 и 114 (Van Eyk J.E. and Hodges, R.S. 1988). Ингибиторные пептиды, полученные из Tnl сердца и скелетных мышц, имеют довольно консервативную первичную структуру, тем не менее Tnl скелетных мышц более эффективно ингибирует АТФазную активность актомиозина и сократительную активность скинированных волокон (Talbot J.A.et al., 1981). Высказывается предположение, что указанное различна обусловлено тем, что в ингибиторном пептиде Tnl сердца есть всего лишь одна неконсервативная замена. В ингибиторном пептиде Tnl скелетных мышц положения 109 и 110 заняты аминокислотными остатками Pro, в то время как в ингибиторном пептиде Tnl сердца гомологичные положения заняты Pro и Thr. Считается, что ингибиторныи пептид скелетных мышц 96NQKLFDLRGKFKRPPLRRVRMn6 представляет собой две амфифильных а 48 спирали, жестко соединенных в виде шпильки дипептидом юэРго-Рго-ио. В случае Tnl сердца две а-спирали ингибиторного пептида обладают большей подвижностью и вследствие этого менее эффективно ингибируют АТФ-азную активность актомиозина. Синтетический ингибиторный пептид Tnl скелетных мышц с заменой P110G обладает повышенной подвижностью двух а-спиральных участков, что приводит к существенному уменьшению его способности ингибирозать АТФазу актомиозина (Campbell A.D. et al., 1992).
Суммируя, можно заключить, что в структуре Tnl есть как минимум два ингибиторных участка. Оба эти участка имеют щелочную природу, при этом первый (основной) ингибиторный пептид (остатки 96-116) имеет форму шпильки, образованной двумя жестко ориентированными друг относительно друга а-спиралями.
Ингибирующий эффект Tnl на АТФазную активность актомиозина заметно усиливается в присутствии тропомиозина (Perry S.V., 1979). Этот факт свидетельствует в пользу прямого взаимодействия Tnl с тропомиозином. Это предположение было подтверждено экспериментальными данными (Мак A.S.et al., 1983), хотя тем не менее участки взаимодействия Tnl с тропомиозином до сих пор не картированы.
Аффинная очистка моноклональных антител на РгА-Sepharose
Перед началом работы ткани тестировали на содержание антител к Treponema pallidum (диагностическая система компании Behring), вирусу -возбудителю гепатита С (диагностическая система компании United Biomedical), вирусу - возбудителю иммунодефицита человека 1-го и 2-го типа (диагностическая система компании Organon teknika) и на содержание вируса - возбудителя гепатита В (диагностическая система компании Organon teknika). В дальнейшем для работы использовали только те ткани, которые давали отрицательный результат при тестировании.
BrCN-активированную сефарозу промывали 1 мМ соляной кислотой, а затем 0.1 М бикарбонатным буфером (рН 8.3), содержащим 0.5 М хлорида натрия. Очищенные на РгА-Sepharose MAT С5 диализовали против того же буфера. МАТ и сефарозу смешивали из расчета 4 мг антител на 1 мл набухшей сефарозы и инкубировали при слабом перемешивании в течение часа при 37С. Затем агарозу осаждали центрифугированием при 800 g в течение 5 минут и инкубировали в тех же условиях с 1.5 М глициновым буфером (рН 8.9), содержащим З М NaCI. Полученный аффинный сорбент последовательно промывали десятью объемами 0.1 М глицинового буфера с рН 2.0 и ФСБ и хранили при +4С в ФСБ, содержащем 0.1% азид натрия в качестве консерванта.
Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с использованием коэффициентов экстинкции А28о (С=0.1%) 0.42 и 0.52 для тропонинов I и Т, соответственно, которые были рассчитаны нами на основании данных аминокислотного состава этих белков.
Раствор антител (1-3 мг/мл) в 0.1 М боратном буфере (рН 8.8) смешивали с изотиоцианатным производным биотина (раствор в диметилсульфоксиде) из расчета 0.1 мг производного биотина на 1 мг антител. Смесь инкубировали 4 часа при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0.02 мл 1 М раствора хлорида аммония на 0.1 мг производного биотина, после чего реакционную смесь инкубировали еще 10 минут. От несвязавшегося биотина раствор антител отделяли последовательным нанесением на гельфильтрационные колонки NAP-5 и NAP-10 (Pharmacia, Upsala, Sweden), промытые предварительно ТСА буфером (20 мМ Tris-HCI, рН 7.8, 150 mM NaCI, 0.1% азида натрия) по методике, рекомендованной производителем. Биотинилированные антитела хранили в ТСА при +4С.
Антитела (3-5 мг/мл) инкубировали с 200 - кратным молярным избытком активированного производного хелата в течение ночи при +4С в 50 мМ натрий карбонатном буфере с рН 9.8, содержащем 0.9% NaCI. От избытка несвязавшегося хелата антитела отделяли по методике описанной в разделе "Получение конъюгата моноклональных антител с биотином".
Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле проводили по методу Laemmli (Laemmli, 1970) Образцы белковых растворов смешивали в соотношении 3:1 с буферным раствором, содержащим 250 мМ трис-HCI, рН 6,8, 8% (вес/объем) ДСН, 40% глицерин, 1,4 М р-меркаптоэтанол, 0,1% (вес/объем) бромфеноловый синий и инкубировали при 100С в течение 5 мин., после чего образцы наносили на фадиентныи полиакриламидныи гель (10-20% акриламида, соотношение акриламид/бисакриламид = 1:37,5) и проводили вертикальный электрофорез, используя прибор для электрофореза SE280 (фирма Hoeffer, США) и источник тока EPS 500/400 (фирма Pharmacia, Швеция) при силе тока 20-25 мА до тех пор, пока фронт не достигал нижнего края кассеты.
После завершения гель-электрофореза, гель промывали в течение одного часа раствором 25% водного изопропилового спирта и оставляли на ночь в растворе красителя (Coomassi Brilliant Blue R250 0.5% раствор на 25% этаноле и 7% уксусной кислоте). Несвязавшийся краситель отмывали раствором, содержащим 25% этанола и 7% уксусной кислоты.
Перенос белков из геля после проведения электрофоретического разделения на нитроцеллюлозную мембрану, осуществляли по методу (Towbin Н., et al., 1979). Качество переноса проверяли, окрашивая мембрану 0.3% раствором красителя Ponceau, приготовленном на 7% уксусной кислоте. Связавшийся с белком краситель отмывали 100 мМ раствором Tris. Затем мембрану инкубировали в течение 5 минут в буфере, содержащем 0.02 М Tris-HCI, рН 7.8, 0.1% Tween 20, 0.5 М NaCI (ТТБС) и 1% бычьего сывороточного альбумина (ТТБС-БСА), после чего - в течение часа - в растворе антител (0.01 мг/мл), приготовленном на том же буфере. После трехкратной отмывки ТТБС мембрану инкубировали в растворе антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой (антитела козы, специфичные к Fc фрагменту мышиных IgG (Sigma), разведение 1:300, приготовленном на ТТБС-БСА) в течение одного часа. После шестикратной отмывки антитела, связавшиеся с белком, проявляли путем обработки мембраны раствором субстрата - диаминобензидина (0.03%) в 0.05 М Tris - HCI буфере (рН 7.5), содержащим 0.03% перекись водорода. Участки связывания антител с белком проявлялись в виде темно-коричневых полос.
Попытка разработки диагностической системы для количественного определения cTnl в крови больных с ИМ
Концентрация cTnl в крови больных с ИМ находится в области довольно низких значений, в диапазоне от 0.2 до 100 нг/мл. Поэтому моноклональные (или поликлональные) антитела, используемые при разработке диагностических систем, должны взаимодействовать с антигеном с достаточно высоким аффинитетом. Согласно теории иммунного ответа, аффинитет получаемых антител находится в прямой зависимости от времени, прошедшего с начала иммунизации животного. Поэтому, мы разработали протокол иммунизации, рассчитанный на 4 - 5 месяцев. При первой иммунизации мышам линии Balb/c внутрибрюшинно вводили 0.1 мг очищенного препарата сердечной изоформы человеческого тропонина I, растворенного в 0.1 мл ФСБ и смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Вторую, третью и четвертую иммунизации проводили с интервалом в один месяц и при этом внутрибрюшинно мышам вводили по 0.05 мг антигена, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда. К концу четвертого месяца после начала иммунизации проводили тестирование животных на содержание в крови антител к cTnl. Образцы крови, отобранные из хвостовой вены, титровали в 96-ти луночных планшетах с преадсорбированным антигеном, с целью выявить мышей, имеющих наивысший титр антител. Животным с наивысшим титром антител дважды, с интервалом в один день, внутрибрюшинно вводили по 0.05 мг антигена, растворенного в ФСБ, и через два дня после последней иммунизации селезенку этих животных использовали для гибридизации с мышиной миеломной линией Sp 2/0. После гибридизации смесь клеток рассевали в одиннадцать 96-ти луночных планшетов в культуральной среде Дульбекко (модификация Игла) с повышенным содержанием глюкозы (4500 мг/л), содержащей 10% эмбриональную сыворотку коров и селективную среду ГАТ (гипоксантин, тимидин, аминоптерин). Через неделю культуральную среду из лунок, в которых набюдался рост гибридомных клеток, тестировали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) по схеме, представленной на Рис. 20.
Как следует из схемы, приведенной на Рис. , сначала культуральную среду тестировали на наличие антител, специфичных к сердечной форме Tnl. Антитела, 105 которые используются для разработки систем диагностики инфаркта миокарда, должны быть исключительно специфичными к сердечной форме Tnl и не взаимодействовать со скелетными изоформами белка. В противном случае, даже несущественные повреждения скелетной мускулатуры могут привести к появлению ложноположительных результатов при диагностике ИМ. Так как гомология между сердечной и скелетными формами белка достигает сорока процентов, то вероятность получения антител, взаимодействующих со скелетными изоформами достаточно высока. Поэтому, на втором этапе все образцы, дававшие положительный сигнал при первом тестировании повторно тестировались на взаимодействие со скелетными изоформами. Для дальнейшей работы отбирали только те лунки, культуральная среда в которых не давала положительного сигнала при тестировании на перекрестное взаимодействие со скелетными формами белка. Клетки из лунок, дававших положительный сигнал при тестировании с сердечной формой белка и отрицательный сигнал при тестировании со скелетными формами, реклонировали методом предельных разведений. Через 7 - 10 дней культуральную среду из лунок с одиночными клонами тестировали на взаимодействие с сердечным Tnl, а клетки из лунок, дававших положительный сигнал повторно реклонировали. Устойчивые клеточные линии, дававшие при повторном реклонировании 100% выход положительных клонов наращивали до количества 5x106 - 107 клеток. Культуральную среду, в которой росли клетки, использовали для определения изотипов антител, как это описано в разделе "Материалы и методы". Часть клеток замораживали в среде, содержащей 10% диметилсульфоксида, 50% эмбриональной бычьей сыворотки и 40% среды, применявшейся при культивировании клеток (проценты объемные). Другую часть клеток вводили внутрибрюшинно мышам линии Balb/C для получения асцитной опухоли. Антитела из асцитной жидкости очищали на РгА - Sepharose и хранили в фосфатно - солевом буфере с 0.1 % азидом натрия. После очистки специфичность моноклональных антител была еще раз подтверждена методом Western Blotting. Принято считать, что после проведения ДСН-гель электрофореза и переноса на нитроцеллюлозу белок теряет свою вторичную и третичную структуру. Однако, все полученные нами моноклональные антитела взаимодействовали с cTnl, перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану. Это позволяет нам предположить, что ни одно из исследуемых моноклональных антител не взаимодействует с конформационными детерминантами, а "узнает" только линейные участки молекулы.
В результате проделанной работы нами было получено 11 гибридом, продуцирующих антитела, специфичные к сердечной изоформе Tnl человека. Шесть гибридом продуцировали антитела субкласса IgGi; три гибридомы -антитела субкласса lgG2a и две гибридомы - антитела субкласса lgG2b (Таблица 3). По всей видимости, ни у одного из этих антител активный центр не содержал свободных аминогрупп. Этот вывод был сделан нами на основании того, что при получении конъюгатов антител с пероксидазой, активированной периодатным методом, или изотиоцианатными производными биотина - веществами, образующими ковалентную связь с белком через свободные аминогруппы, мы не наблюдали у антител потери иммунологической активности.
