Введение к работе
Актуальность темы. Актуальность проблемы бешенства обусловлена широким распространением инфекции и 100 % летальностью (Львов, 2008). В большинстве регионов России эпизоотическая и эпидемиологическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна и поэтому организация мер борьбы с опасной болезнью, общей для человека и животных, остается важной проблемой здравоохранения (Черкасский и др., 2005; Данилов и др., 2007; Онищенко, 2011).
По данным экспертов ВОЗ, за 2011 год около 55 000 человек в мире ежегодно погибает после укусов животных, больных бешенством (Benedictis et al., 2011, ). В Российской Федерации за аналогичный период от бешенства погибли 14 человек, из них 2 детей до 14 лет, в 2012 г. - 4 человека, из них 2 детей до 14 лет (). Ежегодно в различные лечебные учреждения Российской Федерации за медицинской помощью по поводу укусов и других повреждений, полученных от животных, обращается более 450 тыс. человек, примерно половина из них получают направление на специфическое антирабическое лечение (Мовсесянц, 2004; Львов, 2008).
Для экстренной профилактики заболевания людей гидрофобией при тяжелых укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными применяют антирабический иммуноглобулин в сочетании с антирабической вакциной (Селимов и др., 1978; Мовсесянц, 2004; Медуницын, 2005). Единственным производителем антирабического иммуноглобулина в России является ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов).
В настоящее время при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина уровень активности антирабических сывороток продуцентов и готового препарата определяют in vivo в реакции нейтрализации (РН) вируса бешенства на белых мышах (Meslin, 1996). Однако, данный метод трудоемок, требует большого количества животных, длительного времени наблюдения (14 дней) и предполагает использование инфекционного агента. Разработку способов определения специфических антител в антирабических препаратах in vitro настоятельно рекомендует Комитет экспертов ВОЗ по бешенству (WHO, Technical Report Series 824, 1994; Series 931, 2005).
Степень разработанности проблемы. На сегодняшний день имеется широкий спектр методов in vitro для выявления антител к вирусу бешенства, которые имеют различную степень использования в практических лабораториях - реакция непрямой ге-магтлютинации (РНГА) (Шафеева, 1995; Franco, 1996; Истомина, 2011), реакция диффузионной преципитации (РДП) (Atanasiu et al., 1971; Meslin, 1996), реакция связывания комплемента (РСК) (Сугобаева и др., 1989; Хисматулина и др., 1995), иммунофер-ментный анализ (ИФА) (Селимов, 1978; Субботина и др., 1985; Ботвинкин и др., 1988; Karamany et al., 1988; Gelosa et al., 1990; Сазанова и др., 1991; Валишина, 1992; Franco, 1996; Груздев и др., 2001; Кузьмин и др., 2001; Ondrejkova et al., 2002; Самуйленко и др., 2003; Евстигнеев и др., 2003; Евстигнеев и др., 2004; Рахманин, 2008; Metlin, 2008), тест ингибиции фокусов флюоресценции (ТИФФ), тест флюоресценции вирус-нейтрализующих антител (FAVN) (Ondrejkova et al., 2002; Cliquet et al., 2004; Stantic-Pavlinic et al., 2006; Metlin, 2008; Fooks et al., 2009; Welch et al., 2009; Zhang et al., 2009). Постановка двух последних тестов требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вируса бешенства.
Для определения уровня антирабических антител тест ИФА наиболее распростра-
нен и является одним из наиболее чувствительных и удобных методов иммунодиагностики, однако _его недостатками являются применение токсичных, канцерогенных хромогенов и необходимость использования аппаратуры для учета результатов. Указанные недостатки обусловили необходимость разработки безынструментальных тест-систем с использованием неферментных диагностикумов для определения уровня специфических антител и бесприборным учетом результатов теста. Решением данной проблемы является конструирование диагностикума для дот-иммуноанализа с использованием в качестве маркера наночастиц коллоидного золота. По литературным данным, коллоидное золото в мембранных тестах применяют для диагностики паразитарных (Stantic-Pavlinic et al., 2006; Abaza, 2008), вирусных (Samra et al., 2007; Jiang et al., 2011; Lin et al., 2011; Nurulfiza et al., 2011), грибковых заболеваний (Pal, 2004), туберкулеза (Longenberger , 1995; Kassa-Kelembho et al., 2006; /instr/b-105e.pdf), сифилиса (), бруцеллеза (Smits et al., 2003), шигеллеза (Liu et al., 2006; . org/article/info: doi/10. 1371/ journal, pone.), определения беременности на ранних сроках (Тертон и др., 1991; Esumi et al., 1998), выявления дифтерийного токсина (Колодкина и др., 2009), ВИЧ инфекции (Petrov et al., 1991), мелиоидоза, вирусных гепатитов, определения групп крови, дот-блот гибридизации и др. (Дыкман и др., 2011). Однако, на сегодняшний день отсутствуют коммерческие диагностикумы на основе коллоидного золота с вирусными антигенами, в том числе для определения активности антирабических препаратов.
Таким образом, актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.
Цель работы: разработка современного диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в дот-иммуноанализе.
Задачи исследования:
-
Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «Москва 3253» органо-тканевого происхождения для использования его в качестве иммунореагента при конструировании диагностикума.
-
Выделить из вируса бешенства штамм «Москва 3253» культурального происхождения структурный компонент - гликопротеид и охарактеризовать его по основным биохимическим параметрам.
-
Разработать эффективный способ получения конъюгатов наночастиц коллоидного золота с иммунореагентами вирусной и иммуноглобулиновой природы.
-
Отработать методики прямого и непрямого вариантов дот-иммуноанализа для определения содержания специфических антител в антирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина с использованием сконструированных конъюгатов.
-
Провести корреляционный анализ результатов реакции нейтрализации вируса бешенства in vivo и дот-иммуноанализа in vitro.
-
Исследовать стабильность сконструированных конъюгатов.
Научная новизна заключается в том, что экспериментально обоснованы условия выделения и очистки гликопротеида фиксированного вируса бешенства «Москва 3253», используемого в качестве антигена при конструировании иммуносуспензионного диагностикума.
Впервые получены конъюгаты вирусного антигена с наночастицами коллоидного золота. На их основе сконструирована тест-система и продемонстрирована возможность ее применения в производстве антирабического иммуноглобулина на этапах определе-
ния уровня специфических антител в иммунных сыворотках продуцентов и готовом иммуноглобулине.
Впервые показана эффективность применения сконструированного диагностикума для выявления уровня содержания специфических антител в сыворотках людей, вакцинированных по показаниям антирабической вакциной, что актуально для оценки напряженности создаваемого вакциной иммунитета.
Установлена корреляция результатов определения уровня специфических антител в антирабических сыворотках продуцентов и препарате иммуноглобулина в дот-иммуноанализе и реакции нейтрализации на белых мышах.
Практическая значимость работы
Разработанный неферментный диагностикум для проведения экспресс-анализа активности иммунных сывороток открывает перспективы использования в производстве препарата антирабического иммуноглобулина на этапе иммунизации животных, когда необходимо в короткие сроки принять решение о дальнейшей эксплуатации продуцентов.
По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе» (протокол заседания Ученого совета №1 от 09.04.09), «Определение уровня антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей-продуцентов и человека в непрямом варианте дот-иммуноанализа с применением неферментного диагностикума» (протокол заседания Ученого совета № 3 от 05.05.11), «Выделение гликопротеида из фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» (протокол заседания Ученого совета № 3 от 31.05.12).
Приоритетность разработки подтверждена получением патента на изобретение «Иммунодиагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа» (№2360252 РФ, МПК G01N33/532; 27.06.2009, Бюл. №18).
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам выделения и очистки вируса бешенства; определения уровня антирабических антител в сыворотках животных и человека различными методами in vitro (РИГА, РСК, РДП, ТИФФ, ИФА, РН в культуре клеток (ТИФФ); методикам приготовления коллоидного раствора золота и конструирования на его основе диагностикумов; методам постановки дот-иммуноанализа. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.
При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.
Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанные биотехнологические и биохимические приемы позволяют получать очищенный и концентрированный вирус бешенства «Москва 3253» и его основной антигенный компонент - гликопротеид.
-
Сконструирован диагностикум на основе наночастиц коллоидного золота для определения уровня специфических антител в антирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина и предложена технология его приготовления.
-
Сконструированная тест-система позволяет определять уровень антирабических антител в иммунных сыворотках и препарате иммуноглобулина в дот-иммуноанализе.
-
Обоснованы температурно-временные интервалы хранения диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота.
Работа выполнена в лабораториях: биохимии и протеомного анализа отдела микробиологии и профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательских тем 26-2-05 «Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы» (номер госрегистрации 0120.0504663) и 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООН» (номер госрегистрации 0120.0853923).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ (Саратов, 2007); научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье человека» (Рязань, 2007); ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (, Саратов, 2007-2012); Ш Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2010), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием: «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (Пермь, 2012), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск, 2012). Принимала участие в конкурсе XII Международного салона промышленной собственности «Архимед-2009» с разработкой «Набор для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе», которая была награждена решением международного жюри дипломом и серебряной медалью.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и имеется один патент на изобретение № 2360252.
Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 206 источника, из них 83 отечественных и 123 зарубежных. Объем диссертации составляет ПО страниц машинописного текста, включает 5 таблиц, 18 рисунков.
![Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс]](/i/i/4271/187546.png "Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс] Белова Ирина Викторовна")
