Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Бактериальные токсины 8
1. 1.1. Стафилококковый энтеротоксин В 10
1. 1.2. Дифтерийный токсин 15
1.1.3. Столбнячный токсин 20
1. 1.4. Сибиреязвенный токсин 21
1.2. Растительные токсины 25
1.2. 1 .Рицин 25
1.2.2. Вискумин 31
1.3. Методы обнаружения биотоксинов в окружающей среде 32
1. 4. Белковые микрочипы 33
1.4.1. Двумерные белковые микрочипы для обнаружения биотоксинов 34
1.4. 2. Белковые микрочипы на основе гидрогелей 35
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 39
2.1. Белковые микрочипы 41
2. 2. Белковый гидрогелевый микрочип для обнаружения биотоксинов 44
2. 3. Регистрация результатов иммуноанализа 47
2.4. Исследование процессов, проходящих в объеме гелевой
ячейки 47
2.5. Различные варианты иммуноанализа анатоксина рицина, проводимые на микрочипе 50
2.6. Иммуноанализ анатоксинов: вискумина, стафилококкового энтеротоксина В, столбнячного токсина, дифтерийного токсина и летального фактора сибиреязвенного токсина 54
2.7. Прямой анализ анатоксина стафилококкового энтеротоксина В масс-спектрометрической регистрацией сигнала 56
2. 8. Параллельный анализ нескольких анатоксинов на микрочипах 57
2. 9. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами 60
2.10. Гликопротеиновый микрочип 61
2.10.1. Выбор способа иммобилизации углеводов в гелевом элементе микрочипа 61
2.10.2. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере анатоксина рицина) 66
2.11. Оптимизация условий для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа анатоксина рицина 69
2.12. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами 72
2.13. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 74
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 76
3.1. Приборы и реактивы 76
3.2. Получение анатоксинов и моноклональных антител против токсинов....77
3.3. Получение моноклональных антител против трисахаридов групп крови 78
3.4. Изготовление белковых микрочипов 78
3.5. Методика получения конъюгатов антител с биотином 79
3.6. Методика получения конъюгатов антител с пероксидазой хрена 79
3.7. Окрашивание белков флуоресцентными красителями СуЗ/Су5 80
3.8. Методики проведение анализов на микрочипах 80
3.8.1. Флуоресцентные и хемилюминесцентные измерения 80
3.8.2. Кинетические измерения на микрочипах 81
3.8.3. MALDI-TOF масс- спектральный анализ на микрочипе 82
3.8.4. Иммуноанализ анатоксинов на белковых микрочипах 83
3.8.5. Прямой иммуноанализ анатоксинов на микрочипах 83
3.8.6. Конкурентный иммуноанализ на микрочипах (анатоксин рицина) 84
3.8.7. Сэндвич- иммуноанализ анатоксинов 84
3.8.8. Одновременный анализ нескольких анатоксинов на
микрочипах 86
3.8.9. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами
3.9. Исследование при помощи флуоресцентного сканирующего конфокального микроскопа проникновения белков с различной молекулярной массой в гелевый элемент микрочипа (на примере прямого и сэндвич- анализа анатоксина рицина) 88
3.10. Определение степени иммобилизации белков (антител и анатоксинов) и сахаридов в геле 89
3.11. Гликочипы, содержащие иммобилизованные неогликоконъюгаты и спейсерированные трисахариди 89
3.12. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) культуральной жидкости, содержащей антитела против трисахарида А (А16) на 96-луночном планшете 90
3.13. Анализ сыворотки третьей группы крови на гликочипах, содержащих иммобилизованный трисахарид А в спейсерированной форме 91
3.14. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере анатоксина рицина) 91
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
Введение к работе
Разнообразные природные токсины представляют серьезную угрозу здоровью человека. В настоящее время хорошо известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным относятся бактериальные токсины (ботулинический и столбнячный токсины, токсины золотистого стафилококка), токсины растительного происхождения (рицин, вискумин, токсины сине-зеленых водорослей), микотоксины и пр. Эти токсины могут попадать в организм не только в результате инфицирования, но и с пищей, водой, а также воздушно-капельным путем. Поэтому большое значение в настоящее время имеет разработка быстрых и чувствительных методов определения токсинов для проведения клинических анализов, проверки пищевых продуктов, экологического мониторинга.
Для идентификации и анализа, как самих токсинов, так и организмов, которые их вырабатывают, в настоящее время используются различные лабораторные методы, включающие тесты на животных, микробиологические методы, анализ ДНК с использованием ПЦР, иммунологические методы: радиоиммунологический, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализы. Одним из чувствительных, быстрых и удобных методов анализа токсинов является твердофазный иммуноанализ. При разработке иммуноанализа токсинов используют антитела, специфичные к токсинам, а в качестве антигена, как правило, используют анатоксины, которые являются инактивированными токсинами.
К недостаткам традиционных иммунологических методов относится невозможность одновременно тестировать образец на наличие нескольких биологически активных соединений. Эта проблема решается в случае проведения анализа на белковых гидрогелевых микрочипах, разработанных в данной диссертации, которые позволяют обнаружить присутствие нескольких анатоксинов в анализируемом образце. Для создания белковых микрочипов и оптимизации методов иммуноанализа биотоксинов были использованы антитела и анатоксины, любезно предоставленные коллегами из Института Биоорганической Химии им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина (В. А. Несмеянов).
Технология гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов была разработана в ИМБ РАН под руководством академика А.Д. Мирзабекова и совершенствуется по настоящее время. Белковый гидрогелевый микрочип представляет собой матрицу
индивидуальных гелевых ячеек на поверхности стекла, содержащих различные ковалентно иммобилизованные зонды (антитела, антигены).
Микрочип для одновременного определения нескольких анатоксинов позволит значительно увеличить эффективность анализа, ускорить и миниатюризировать проведение исследований и может найти применение в клинической и лабораторной практике.
Бактериальные токсины
Бактериальные токсины, продуцируются микроорганизмами, подразделяются на два больших класса: эндотоксины и экзотоксины. Действие экзотоксинов всегда направлено на какой либо отдел или функцию клетки. Эндотоксин вызывает множество функциональных нарушений вследствие продукции большого количества медиаторов. Основные характеристики эндо - и экзотоксинов приведены в таблице 1.
Экзотоксины
Экзотоксины, попадая в клетку путем эндоцитоза, далее действуют в клетке как фермент или ингибитор нейротрансмиттеров.
Если говорить о ферментативной функции, наиболее распространенным вариантом поведения экзотоксинов в клетке является необратимая трансформация аденозин 5 -дифосфата путем присоединения рибозных групп с образованием какого-либо неполноценного внутриклеточного протеина (токсины холеры, дифтерии). В случае, когда экзотоксин выступает в роли ингибитора нейротрансмиттеров (токсин Clostridium botulinum), в клетке происходит блокирование синаптической передачи на уровне нейронов.
Эндотоксины
Эндотоксин (или липополисахарид) является обычным структурным компонентом клеток многих Грамм-отрицательных бактерий. Эндотоксин состоит из белка, являющегося токсической частью молекулы, связанной с липополисахаридным комплексом. При определенных условиях белок оказывает прямое повреждающее действие на клетки эндотелия, но основным механизмом является взаимодействие белка со специфическими видами клеток и каскадными системами плазменных белков, в результате чего высвобождается множество промежуточных активных продуктов (токсин Staphylococcus aureus, SEB)
Вещества, образующиеся в результате взаимодействия эндотоксинов с клетками и каскадными системами плазменных белков, способствуют высвобождению:
цитокинов, таких как фактор некроза опухолей NF-a;
интерлейкинов IL-1 и IL-6;
интерферона INF а;
окиси азота (N0);
продуктов метаболизма арахидоновой кислоты, таких как простагландины, лейкотриены и тромбоцит-активирующие факторы.
Из всех веществ, которые высвобождаются при действии эндотоксинов, наиболее значимая роль отводится фактору некроза опухолейNF-a; в очищенном виде он "репродуцирует" большинство симптомов септического шока. Интерлейкин-1 и a-интерферон действуют синергично с TNF-a.
Белковые микрочипы
Для производства белковых гидрогелевых микрочипов за основу нами была взята технология получения олигонуклеотидных трехмерных гидрогелевых микрочипов, разработанная под руководством А. Д. Мирзабекова в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН им. В. А. Энгельгардта. Как упоминалось ранее, трехмерные полиакриламидные гели являются хорошим носителем для иммобилизации олигонуклеотидов и олигонуклеотидные микрочипы уже используются для диагностики туберкулеза и его лекарственно устойчивых форм, лейкемии [Gryadunov D. 2005, Nasedkina Т. 2003]. Подобная технология изготовления микрочипов, но с некоторыми изменениями, была использована нами для иммобилизации белковых молекул.
Белковый гидрогелевый биочип представляет собой стеклянную подложку, на которую нанесены полусферические гелевые элементы, количество которых зависит от целей эксперимента. Каждый гелевый элемент микрочипа может содержать иммобилизованный индивидуальный белок (антитело, антиген).
Трехмерный гель обладает существенными преимуществами по сравнению с двумерными поверхностями для иммобилизации белков. В гелях достигается высокий процент иммобилизации зондов за счет развитой трехмерной поверхности. Иммобилизованные белки равномерно распределены по всему объему геля на достаточно удаленном расстоянии друг от друга даже при высокой концентрации зондов. Гелевые элементы микрочипа отделены друг от друга гидрофобной поверхностью, поэтому каждую ячейку микрочипа можно рассматривать как индивидуальную пробирку для проведения биохимических реакций. Гель состоит примерно на 95% из воды и содержит глицерин, поэтому иммобилизованные белки сохраняют биологическую активность.
Для изготовления гидрогелевых белковых микрочипов мы использовали стеклянные пластинки, активированные Bind Silane (для создания непредельной метакрилатной группы на поверхность стекла); далее на активированное таким образом стекло пином робота наносится полимеризационная смесь, содержащая иммобилизуемые зонды (антитела и антигены) и гелеобразующие мономеры (рис. 8). Ковалентная иммобилизация или «сополимеризация» белков происходит при облучении гелевого элемента микрочипа ультрафиолетом с длиной волны 350 нм. Иммобилизация белка протекает одновременно с образованием геля, т.е. происходит ковалентное связывание белка, содержащего активную группу (-NH2 или -SH) с
компонентами растущей полимерной цепи в течение фото индуцированной полимеризации в присутствии бифункционального сшивающего агента (кросслинкера). Для того чтобы участвовать в реакции фотоиндуцируемой полимеризации, белки должны содержать активную группу, способную вступать в реакции присоединения и замещения с фрагментами гелеобразующих мономеров, например, амино- и сульфгидрильные группы аминокислот Lys и Cys могут выступать в качестве активных групп при фотоиндуцируемой полимеризации. В качестве гелеобразующих соединений в нашей работе использовали соединения с непредельной группой, такие как метакриламид и N, N-метилен бисакриламид.
Приборы и реактивы
Пероксидаза хрена (HRP, RZ 3.0), N-гидроксисукцинимидный эфир биотина и авидин Sigma (St. Louis, МО); хемиюминисцентный субстрат (SuperSignal ELISA Pico Stable Peroxide и Luminol Enhancer solution) Pierce (Rockford, IL); флуоресцентные красители СуЗ и Су5 в виде моносукцинимидного эфира, сефадекс G-25 (Sephadex G-25), протеин А- и протеин G- сефарозы, Bind Silan (Amersham Pharmacia Biosciences); Су5-меченный раствор антител против IgG мыши из козла, конъюгат антител против IgG мыши с биотином (IgG) (Piscataway, NJ); антитела против человеческого IgG из мыши, конъюгат против человеческого IgG из мыши с биотином, конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой, 4-метилбеллиферрил фосфат (флуоресцентный субстрат для АР) (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA); хроматографические колонки Micro Bio-Spin Laboratories (Hercules, CA); стеклянные слайды для изготовления микрочипов (Corning 2947 Micro Slides) Corning Glass Works (Corning, NY). Прозрачные камеры 25- и 100- мкл использовали для проведения анализа на микрочипах (in situ frames, Eppendorf Scientific, Westbury, NY).
Химические реактивы, приобретенные из коммерческих источников, использовали без предварительной очистки.
Спейсерированные углеводы: трисахариды групп крови А и В (Atri и Btri), лактоза, а-манноза, дисахарид В (спейсер -OCH2CH2CH2NH2), Atri и Btri в виде полиакриламидных (РАА) гликоконъюгатов (растворимы в воде, 30-40 кДа, содержание Atri или Btri не менее 20%) и Neu5-Aca-PAA были предоставлены Н. В. Бовиным (ИБХ, Москва).
Масс спектры регистрировали на MALDI TOF масс спектрометре Kompakt MALDI 4 (Kratos Analytical, Chestnut Ridge, NY), используя синапиновую кислоту в качестве матрицы. Конфокальное исследование гелевого элемента микрочипа проводили на сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS (Germany), лазер с длиной волны возбуждения 548 нм, изображение гелевого элемента микрочипа в разрезе получено при помощи специальной программы Leica confocal software.
Получение анатоксинов и моноклональных антител против токсинов.
Препараты моноклональных антител и анатоксинов были любезно предоставлены коллегами из Института Биоорганической Химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова (В. А. Несмеянов).
Гибридомы моноклональных антител были получены нашими коллегами по следующей методике. Проводили полиэтиленгликоль индуцированное слияние мышиных миеломных клеток с лимфоцитами мыши, иммунизированной соответствующим токсином. Моноклональные антитела отбирали по способности связываться с нативным токсином. Гомогенность выделенных антител подтверждалась SDS-PAGE-электрофорезом.
Столбнячный и дифтерийный анатоксины были произведены «Биомед» (Москва, Россия) и предоставлены Д. А. Закгеймом. Гибридомы клонов 2АЗ и 4С7 против дифтерийного токсина были произведены В. Л. Юриным (ГОСНИИ «Генетика», Москва, Россия) слиянием P3X63-Ag8.653 миеломных клеток со спленоцитами мыши Balb/c (выделены из асцитов) иммунизированной дифтерийным токсином. Моноклональные антитела очищали осаждением с сульфатом аммония и DEAE ионообменной хроматографией. Все полученные моноклональные антитела являлись IgGl подтипом с к-легкой цепью и обладали константой афинности SxlO M"1.
Гибридомы 3D2C6 и 3D 10В11 против токсина столбняка были получены В. В. Свиридовым (Институт Вакцин и Сывороток им. Мечникова) путем слияния P3X63-Ag8.653 миеломных клеток со спленоцитами мыши Balb/c, иммунизированной столбнячным токсином. Моноклональные антитела очищали осаждением с сульфатом аммония и DEAE ионообменной хроматографией.
Инактивированный Staphylococcus aureus энтеротоксин В (SEB) и моноклональные антитела против SEB были предоставлены П. Г. Свешниковым (Русский Исследовательский Центр Молекулярной Диагностики и Терапии, Москва, Россия). Гибридомы S222 и S643 против SEB были получены слиянием РЗХ63-Ag8.653 миеломных клеток с клетками лимфатических узлов Balb/c мыши, иммунизированной инактивированным при помощи температуры SEB [Alakhov V. 1992]. Моноклональные антитела очищали осаждением с сульфатом аммония и DEAE ионообменной хроматографией. Моноклональные антитела обладали высокой специфичностью и не вступали в перекрестное взаимодействие с энтеротоксинами А, С и D.
