Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме 10
1.1. Биология представителей вида Hirudo medicinalis L . 10
1.1.1. Морфология и физиология 10
1.1.2. Пищеварительная и выделительная системы 13
1.1.3. Нервная система и органы чувств 15
1.1.4. Репродуктивная система и особенности размножения 18
1.2. Экологические особенности вида 21
1.2.1. Характеристика среды обитания 22
1.2.2. Ареал медицинской пиявки в России и на сопредельных территориях 27
1.2.3. Этологические особенности и механизмы поведенческих реакций 28
1.3. Технологии промышленного разведения Hirudo medicinalis 35
1.3.1. Технологические аспекты содержания и кормления 35
1.3.2. Биотехнология размножения пиявок 37
1.4. Значение Hirudo medicinalis для медицины и ветеринарии 39
1.4.1. Характеристика биологически активных веществ, вырабатываемых пиявками 40
1.4.2. Биопрепараты на основе веществ, вырабатываемых организмом медицинской пиявки 43
1.4.3. Применение медицинских пиявок в медицине и ветеринарии 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Характеристика объекта исследования 50
2.2. Технологические приемы кормления и выращивания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях 52
2.3. Исследование веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду 54
2.3.1. Анализ спектра органических и неорганических метаболитов 54
2.3.2. Исследование аминокислотного состава 54
2.4. Разведение Hirudo medicinalis 55
2.5. Исследование микрофлоры Hirudo medicinalis 57
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение 60
3.1. Подбор и оптимизация технологического режима кормления и содержания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях 60
3.1.1. Значимость биотических факторов в биотехнологии разведения пиявок 67
3.1.2. Роль абиотических факторов среды при разведении пиявок 70
3.1.3. Химический состав веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду 77
3.2. Размножение медицинских пиявок 91
3.3. Характеристические параметры маток, коконов, нитчаток 97
3.4. Рост нитчаток в зависимости от особенностей кормления 105
3.5. Рост и развитие взрослых медицинских пиявок 112
3.6. Сравнительный анализ внутривидовых различий Н. medicinalis officinalis и Н. medicinalis orientalis при разведении in vitro 116
3.7. Особенность видового состава бактериальной микрофлоры Hirudo medicinalis 121
3.7.1.Микрофлора кишечника 121
3.7.2. Микрофлора кожных покровов 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 137
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 139
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 140
ПРИЛОЖЕНИЯ 171
- Биология представителей вида Hirudo medicinalis L
- Характеристика объекта исследования
- Подбор и оптимизация технологического режима кормления и содержания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях
Введение к работе
Общая характеристика работы. Диссертационная работа представляет собой законченное научное исследование, содержащее результаты, полученные автором в процессе выполнения плановых научных исследований кафедры биологии, генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (по теме № 01.200.203527) в период с 2002 по 2005 годы.
По характеру изучаемых явлений диссертация относится к области биотехнологии разведения животных и экологии. Работа сочетает теоретические и практические аспекты решения проблемы разработки оптимальной по срокам и экологическим параметрам биотехнологии разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях.
Актуальность темы. В настоящее время медицинские пиявки широко используются для лечения человека и сельскохозяйственных животных, сформировалась самостоятельная область медицины — гирудотерапия, которая успешно развивается (Жаров Д.Г., 2003).
Организм медицинской пиявки - это, по сути, естественная биофабрика по производству целого комплекса уникальных биологически активных веществ, в которых остро нуждаются современная медицина и ветеринария — это гирудин, эглины, бделлины, гементин, брадикинины. Организм медицинской пиявки также вырабатывает широкий спектр ферментов: гиалуронидазу, дестабилазу, оргелазу, коллагеназу, апиразу, эластазу, триглицеридазу. Все эти вещества являются биологически активными субстанциями естественного происхождения. Их значимость для медицины и ветеринарии трудно переоценить (Никонов Г.И., Баскова И.П., 1986; Бас-кова И.П., Завалова Л.Л., 1998; Никонов Г.И., 1998; Савинов В.А., Чистов А.В.,2001).
Видовые особенности Н. medicinalis настолько уникальны, что для извлечения из организма пиявки всего комплекса биологически активных
6 веществ не требуется затрат на выделение, очистку, фасовку, доставку и сами средства введения. По биологической сущности пиявки являются кровососущими эктопаразитами, и все биологически активные вещества самопроизвольно впрыскиваются в организм больного при кровоизвлече-нии. Это позволяет рассматривать медицинскую пиявку как идеальный инструмент решения широкого спектра эндоэкологических проблем больного человека или животного (Савинов В.А., Кудинов В.Г. и др., 1994; Селезнев К.Г., 2003; Геращенко Л.Л., 2004).
С точки зрения экологии, пиявки являются редким исчезающим видом, занесенным в Красную книгу (RED DATA BOOK, 1983). Вылов медицинских пиявок из естественных водоемов запрещен.
В XXI веке потребности медицины и ветеринарии в биологически активных субстанциях естественного происхождения будут нарастать, соответственно будут возрастать потребности в медицинских пиявках (Бас-кова И.П., 2001; Никонов Г.И., Латрилль Ж., 2002).
В Российской Федерации природные ресурсы медицинской пиявки также практически исчерпаны и для медицины и ветеринарии используют пиявок, выращенных на биофабриках, которых на территории РФ всего три. Особенности технологий разведения медицинских пиявок представляют коммерческую тайну и в литературных источниках не публикуются. Биофабрики торгуют только сертифицированными взрослыми пиявками, поэтому получить для исследовательских целей пиявок на разных стадиях онтогенеза с биофабрик невозможно. При отсутствии медицинских пиявок в естественной природной среде остается единственная возможность разработать собственную биотехнологию разведения пиявок (для целей НИР) в лабораторных условиях.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - разработать ускоренную биотехнологию лабораторного разведения Н. medicinalis, основанную на биологических и экологических особенностях вида.
В соответствии с этой целью решались следующие задачи: подбор и оптимизация технологических режимов содержания и кормления пиявок в лабораторных условиях; оценка роли биотических и абиотических факторов среды в биотехнологии разведения Н. medicinalis; характеристика веществ, выделяемых Н. medicinalis в окружающую среду; подбор и оптимизация технологических режимов для полной реализации репродуктивного потенциала пиявок; сравнительный анализ внутривидовых различий подвидов Н. medicinalis officinalis и Н. medicinalis orientalis; характеристика особенностей экзогенной и эндогенной микрофлоры медицинских пиявок, выращенных в лабораторных условиях.
На защиту выносится: полный биотехнологический цикл ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях; экологически обоснованные оптимумы технологических режимов разведения, выращивания и предреализационного хранения пиявок; потребительская ценность вод, обработанных пиявками; характеристика эндогенной и экзогенной бактериальной микрофлоры медицинских пиявок.
Научная новизна. Разработан ускоренный биотехнологический цикл разведения медицинских пиявок для целей НИР в лабораторных условиях. Подобраны оптимальные температурные режимы выращивания, размножения и хранения пиявок.
Установлено, что вода, обработанная пиявками, представляет потребительскую ценность, поскольку содержит широкий комплекс биологически активных веществ; не является токсичной, что подтверждено тестиро- ванием на белых мышах, не содержит патогенной микрофлоры, что подтверждено бактериологическими посевами.
Установлено, что для технологии лабораторного разведения наиболее подходит по своим технологическим характеристикам пиявка подвида аптекарская (Н. т. officinalis).
Выделена и охарактеризована эндогенная и экзогенная бактериальная микрофлора медицинской пиявки, исследован химический состав веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду.
Практическая значимость. Разработана биотехнология ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях, она внедрена в Ульяновской сельскохозяйственной академии. По этой технологии получены первые 800 особей, давших полноценное потомство, не уступающее по своим свойствам пиявкам, выращенным на биофабриках и в природной среде (См. табл. 16). Выявлен наиболее эффективный для разведения и практического использования подвид медицинской пиявки - Н. т. officinalis, поскольку его потребительские характеристики: скорость присасывания, количество поглощенной крови, уровень смертности превосходят таковые у Н. т. orientalis.
Разработанная биотехнология разведения пиявок в лабораторных условиях делает доступными для изучения все стадии онтогенеза этого вида и позволяет получать необходимый экспериментальный материал для научно-исследовательских и учебных целей.
Апробация результатов научных исследований. Материалы исследований были представлены и обсуждались на конференциях различных уровней, в том числе на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2005). Результаты научно-исследовательской работы обсуждались на межвузов- ских научных семинарах кафедры биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «УГСХА» и кафедры биоэкологии ГОУ ВПО «УлГУ» (2004, 2005).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано семь работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 170 страницах, включает 23 таблицы, 22 рисунка, шесть фотографий. Состоит из введения, обзора литературы по изучаемой проблеме, описания объектов, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Библиография включает 346 наименований, в том числе 83 на иностранных языках.
Биология представителей вида Hirudo medicinalis L
Длина взрослой пиявки составляет 90-120 мм, масса 1,5-2 г. Длина тела может достигать и больших размеров - 250-300 мм (Стояновский Д.Н., 2002). В лаборатории Г.Г. Щеголева (1945) была выращена за полтора года гигантская пиявка длиной 440 мм, с массой 38,8 г, диаметр ее задней присоски (во время присасывания) равнялся 13 мм.
Окраска тела медицинских пиявок специфична, хотя сильно варьирует. По спине проходит несколько полос. И полосы, и основной фон, на котором они расположены, вариабельные признаки. Окраска спины зависит от среды обитания, наследственности и ряда других факторов и колеблется в широких пределах от коричневой, рыжеватой до оливково-черной, оливково-зеленоватой и оливково-желтоватой, темно-зеленой, зеленой, черной и т.д. Соотношение темного и оранжевого пигментов в продольных полосах может быть различным, форма полос также изменчива. Окраска брюшной стороны варьирует от очень светлой с темными пятнами неправильной формы до темной; промежуточные формы имеют рябую поверхность из-за смеси светлых и темных пятен, образующих разнообразные рисунки (Каменев Ю.Я., Каменев О.Ю., 2003; Лукин Е.И., 1976). Окраска пиявок часто зависит от окраски субстрата, на котором они обитают (Лукин Е.И., 1976).
Для практических целей выделяют три формы Н. medicinalis (Каменев Ю.Я., Каменев О.Ю., 2003; Стояновский Д.Н., 2002; Лукин Е.И., 1977; Щеголев Г.Г., Федорова М.С.,1955; Иогансон Л., 1935).
Аптекарская медицинская пиявка (Н. medicinalis officinalis). Ее отличительным наружным признаком является наличие на брюшке двух черных полос, расположенных по краям. На спине ясно выделяются две оранжевые полосы с правильно повторяющимися расширениями. Эта форма пиявки встречается в Краснодарском крае, Молдавии и Армении.
Лечебная медицинская пиявка (Н. т. medicinalis). Отличительные наружные признаки: брюшко покрыто черными пятнами неправильной формы; вдоль спины тянутся узкие оранжевые полосы с незначительными правильно повторяющимися расширениями, на которых располагаются черные пятна каплевидной или булавовидной формы. Распространен данный подвид в основном на Украине.
Восточная медицинская пиявка (Н. т. oriental is). Эта форма пиявки более яркая, чем лечебная и аптекарская. Вдоль ее спины тянутся узкие оранжевые полосы, через равные промежутки покрытые черными четырехугольными пятнами. Брюшко черное, с зелеными пятнами, попарно расположенными через одинаковые промежутки. Она встречается в Закавказье, Грузии, Армении, Азербайджане.
Лабораторные исследования показали, что лечебная и аптекарская медицинские пиявки легко скрещиваются и дают потомство, отличающееся большей жизнестойкостью (Стояновский Д.Н., 2002; Щеголев Г.Г., Федорова М.С.,1955).
Пиявки имеют вытянутое в длину и сплющенное в дорзо-вентральном направлении тело. Форма тела может значительно изменяться, т.к. пиявки обладают способностью сильно вытягиваться во время плавания или сокращаться при механических воздействиях, во время сна или после кормления (Лукин Е.И., 1976, Стояновский Д.Н., 2002).
Тело пиявки с обоих концов заканчивается присосками. Пиявка сосет кровь при помощи передней присоски. Задняя присоска служит для фиксации тела и для передвижения по твердым субстратам, ее диаметр больше половины наибольшей ширины тела (Титова Е.А., 2002).
Заднепроходное отверстие, или порошица, открывается на спинной стороне тела у задней присоски. На брюшке, ближе к переднему концу, располагаются одно за другим два половых отверстия - мужское и женское. На брюшной стороне тела пиявки открывается 17 пар мочевых отверстий (Стояновский Д.Н., 2002).
Тело медицинской пиявки негладкое, у медицинской пиявки насчитывают 103 кольца. Поверхность тела усыпана мелкими сосочками, которые имеются на всех кольцах. Консистенция тела довольно плотная и подвержена изменениям в зависимости от физиологического состояния животного, наполнения кишечника кровью и т.д.
Число сомитов, в отличие от других кольчецов, постоянно и равно 33, из которых последние семь образуют заднюю присоску, а передние четыре - ротовую присоску. У медицинской пиявки в сомите пять колец. Для пиявок характерна вторичная кольчатость тела. Она затрагивает только наружные покровы и на внутренние органы не распространяется (Титова Е.А., 2002; Эпштейн В.М., 1980, 1989; Лукин Е.И., 1976; Лукин Е.И., 1968).
Тело пиявок одето кутикулой, под ней находится эпителий с железами, выделяющими слизь, облегчающую передвижение. У основания эпителиальных клеток рассеяны пигментные клетки, обусловливающие окраску пиявок (Стояновский Д.Н., 2002; Титова Е.А., 2002).
Плотные покровы и наличие паренхимы защищают тело от высыхания и позволяют пиявкам длительное время пребывать на суше и совершать сухопутные миграции (Шарова И.Х., 2002).
Характеристика объекта исследования
Диссертационная работа выполнялась в период с 2002 по 2005 г. Исследования проводились на кафедре биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии факультета ветеринарной медицины ФГУ ВПО «УГСХА».
Объект исследования - медицинские пиявки двух подвидов - апте . карские и восточные. На начальном этапе исследований пиявки были заку плены на биофабрике «ГИРУД.И.Н.» города Балаково Саратовской области. К моменту начала экспериментов возраст пиявок составлял десять месяцев, из них шесть месяцев пиявки находились в состоянии голода. Пиявки имели сертификат соответствия, их вес составлял от 0,5 до 5 грамм. В дальнейшем работа выполнялась на пиявках последующих поколений, ре продуцированных и выращенных в нашей лаборатории, по собственной технологии лабораторного разведения, - всего 800 особей.
Схема исследований включает несколько этапов (См. рис. 1). Предварительный этап исследований был посвящен поиску медицинских пиявок в водоемах Ульяновской области. В 2002 году были обследованы водоемы Инзенского, Базарносызганского районов, где по архивным данным краеведческого музея в довоенные годы встречались пиявки. В этих районах из представителей класса пиявок были обнаружены только конские и ложноконские, которые не являются эктопаразитами, а . являются хищниками, способными к укусу, но неспособными к кровоиз влечению. Также были отловлены рыбьи пиявки, наносящие урон рыбному хозяйству и не имеющие потребительской ценности.
В период с 2002 по 2003 г мы продолжали поиск медицинских пиявок в водоемах остальных районов Ульяновской области: Тереньгульского, Старомайнского, Новомалыклинского, Чердаклинского и т.д., однако медицинские пиявки в числе выловленных представителей класса пиявок не были обнаружены. На протяжении трех лет мы предпринимали попытки акклиматизации пиявок, выпуская их в водоемы Чердаклинского района по 100 особей за летний сезон (массой более 0,5 г в мае месяце 2003-2005 годов), однако, уже в осенние месяцы (сентябрь-октябрь) и после зимовки пиявки, расселенные в водоемах, не были обнаружены.
Подбор и оптимизация технологического режима кормления и содержания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях
На первом этапе исследований стояла задача разработать технологию кормления пиявок. В естественной среде обитания пиявки, являясь эктопаразитами, питаются, присасываясь, прокусывая кожные покровы, и извлекая кровь у млекопитающих, земноводных или рыб. В своих исследованиях мы рассматривали возможность технологического развития двух вариантов кормления. Первый - базовый, т.е. природный тип кормления путем естественного кровоизвлечения. Второй способ кормления - искусственный, основанный на использовании свежеполученной крови крупного рогатого скота. Поиск технологического решения наиболее оптимального варианта кормления прошел несколько этапов.
На начальных этапах мы пытались накормить пиявок в чашках Петри, налив в них небольшое количество свежей крови. Эти попытки не увенчались успехом, они приводили к большому проценту гибели пиявок во время и после кормления, поскольку белки свертывающей системы крови, обволакивая тела пиявок, мешали осуществлять им дыхание и обмен веществ с окружающей средой. Кроме того, кровь, по сравнению с традиционной средой обитания пиявок - водой, представляет собой гипертонический раствор, в котором пресноводные пиявки выжить не смогут. Была еще одна технологическая проблема - пиявки насасывают кровь подобно насосу, а в жидкой среде, которую мы им создали, этот механизм не работал.
Основываясь на первых технологических просчетах, мы поняли главное - тип питания должен быть поверхностным, похожим на эволюци-онно сложившийся механизм эктопаразитизма.
Поэтому мы решили, во-первых, использовать свернувшуюся кровь, превратившуюся в сгустки; во-вторых, сгустки поместить в мешки. Для изготовления мешков использовали льняные или синтетические ткани.
Основную массу пиявок кормили, выпуская их в стеклянные сосуды на мешочки, содержавшие сгустки крови крупного рогатого скота. Однако, такая технология кормления была трудно воспроизводимой при групповом кормлении мелких пиявок, весом до 0,5 г. Для части пиявок сохранили возможность естественного кормления. С этой целью использовали людей-добровольцев. Кормление путем естественного кровоизвлечения, безусловно, давало лучшие результаты, по сравнению с кормлением на сгустках крови.
Четко прослеживалось, что группа, кормившаяся естественным природным способом, по характеристическим параметрам превосходила группу, кормившуюся на сгустках крови крупного рогатого скота.
После первого и второго кормления у пиявок, получавших кровь путем естественного кровоизвлечения, масса тела была в 1,4-1,5 раза выше, чем у пиявок, накормленных кровью крупного рогатого скота (р 0,05). Соответственно, больше была и масса поглощенной крови (р 0,05).
Важным показателем эктопаразитической активности пиявок являлась скорость присасывания. Высокая скорость присасывания относится к важным потребительским характеристикам. Скорость присасывания в наших экспериментах составляла в среднем 2,8±0,7 мин.
Для отработки технологии кормления и изучения пищевых поведенческих реакций пиявок было сформировано пять опытных групп по 40 пиявок в каждой. Было проведено пять опытных кормлений, в ходе которых отслеживались пищевые поведенческие реакции пиявок. Отмечалось активно или неактивно питались пиявки, выявлялись особи с агрессивным поведением, проводился учет пиявок, подвергшихся нападению, учитывался процент гибели от укусов.
