Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор и обсуждение литературы 10
1.1. Helicobacter pylori, история открытия, свойства микроорганизма, эпидемиология инфекции и ассоциированность ее с другими заболеваниями 10
1.2. Хеликобактериоз и методы его диагностики 21
1.3. Уреаза, ее свойства и методы исследования 34
1.4. Методы определения уреазной активности 37
1.5. Уреазная система Helicobacter pylori 41
Глава 2. Объекты и методы исследования . 54
Глава 3. Процесс определения Helicobacter pylori по урезаной активности
3.1. Кинетика ферментативного гидролиза карбамида 66
3.2. Кинетика диффузионных процессов 77
3.3.Обнаружение продуктов реакции гидролиза. Линейно- колористический метод индикации веществ 85
3.4. Формулирование требований к разрабатываемым тест-системам...92
Глава 4. Разработка способа определения уреазной активности in vitro 95
4.1. Определение рН биоптата 96
4.2. Оптимизация индикаторной системы 98
4.3. ХЕЛПИЛ-тест 101
4.4. Проверка ХЕЛПИЛ-теста 108
Глава 5. Способы определения уреазной активности in vivo 114
5.1. ХЕЛИК-тест как метод определения уреазной активности in vivo 114
5.2. Пассивные дозиметры для определения аммиака 123
5.3. Индикаторные трубки как детектор содержания аммиака 121
5.4. Диагностика хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора 127
5.5. Повышение чувствительности ХЕЛИК-теста 129
Глава 6. Оценка возможности применения ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-теста для диагностики хеликобактериоза в медицинской лечебной и исследовательской практике 133
6.1. Применение ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов в медицине 133
6.2. Схема диагностики инфекции Helicobacter pylori 135
Выводы 139
Благодарности 141
Библиографический список использованной литературы 143
- Helicobacter pylori, история открытия, свойства микроорганизма, эпидемиология инфекции и ассоциированность ее с другими заболеваниями
- Объекты и методы исследования .
- Кинетика ферментативного гидролиза карбамида
Введение к работе
Бактерия Helicobacter pylori обитает на слизистой оболочке желудка человека и других млекопитающих и вызывает заболевание, названное хеликобактериозом. Инфекция H.pylori является одной из наиболее распространенных на Земле; ею инфицировано около половины человечества, в разных странах от 20 до 95% населения. В России уровень инфицирования составляет 70-80%.
Присутствие микроорганизмов на слизистой оболочке желудка (СОЖ) вызывает постепенное изменение слизистой и приводит к таким заболеваниям желудочно-кишечного тракта, как хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка и др.
Бактерия H.pylori была открыта почти 20 лет назад; за это время изучены свойства микроорганизма, его метаболизм, ферментная система, взаимодействие с макроорганизмом. Это открытие называют «революцией в гастроэнтерологии», так как оно коренным образом изменило представления о сущности, патогенезе и терапевтическом подходе к целому ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с данной инфекцией.
Мнение большинства врачей-исследователей сейчас однозначно — бактерия H.pylori оказывает патогенное влияние на организм человека, следовательно, эту инфекцию необходимо своевременно обнаруживать и лечить, не допуская развития тяжелой патологии. Таким образом, разработка методов определения инфекции Н pylori является весьма актуальной задачей. Более того, требуются новые диагностические технологии, позволяющие быстро и достоверно определить хеликобактериоз у пациента.
Существующие методы определения H.pylori (бактериологические, морфологические, биохимические, иммунологические, молекулярные)
настолько громоздки, что не могут быть использованы для массовой серийной диагностики. Необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод обнаружения бактерии H.pylori, а также реализовать этот метод в удобных и недорогих тестах для широкого применения в медицинской практике.
Детектирование хеликобактериоза может проводиться по продуктам реакции уреазного гидролиза карбамида - специфической реакции, которая обеспечивает бактерии возможность выживания в агрессивной кислой среде желудка. Данный метод определения инфекции H.pylori по уреазной активности является косвенным, но позволяет достичь весьма высоких показателей чувствительности и специфичности.
Цель работы
Разработка специфичного, чувствительного, экспрессного и удобного метода определения уреазной активности (УА) биологического материала in vitro и совершенствование метода определения УА in vivo.
Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:
определить закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении УА in vivo и in vitro; выявить лимитирующие стадии этих процессов и оптимизировать определение УА;
- разработать способы определения инфекции H.pylori по УА in vivo и
in vitro с различными вариантами получения и обработки аналитического
сигнала;
разработать технологию изготовления экспресс-тестов для определения УА биологического материала in vitro;
- оценить диагностическую эффективность новых тестов и
апробировать их на клиническом материале.
Научная новизна работы
- Впервые определение инфекции H.pylori по ее уреазной активности
рассмотрено как комплексный процесс; выявлены лимитирующие стадии
при прохождении процесса in vivo и in vitro и определены пути совершенствования биохимического метода определения бактерии;
исследованы процессы переноса субстрата карбамида к уреазе бактерии, обитающей на поверхности СОЖ, а также продуктов ферментативного гидролиза из зоны реакции;
впервые разработана физико-химическая индикационная система на плоском волокнистом носителе для определения уреазной активности биологического материала, в т.ч. биоптатов СОЖ;
на основании выявленных особенностей механизма процесса усовершенствован метод определения уреазной активности in vivo;
показана применимость разработанного метода для диагностики инфекции H.pylori, проведено сопоставление его специфичности и чувствительности с аналогичными характеристиками применяемых в медицинской практике методов;
разработана комплексная схема диагностики хеликобактериоза, включающая инвазивные и неинвазивные методики.
Практическая значимость
Разработан новый метод определения уреазной активности биологических объектов; на основе предложенного метода разработан ХЕЛПИЛ-тест - экспресс-тест для оценки уреазной активности биологического материала in vitro.
Разработана рецептура и технология производства ХЕЛПИЛ-теста, определены его специфичность и чувствительность.
Модифицирована методика неинвазивного определения
хеликобактериоза (ХЕЛИК-тест) с помощью индикаторных трубок в качестве детекторов, в результате повышена чувствительность определения и уменьшено время обследования.
Разработан новый способ определения хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора и устройство для этого способа определения.
Разработан комплекс методик диагностики H.pylori, включающий инвазивное и неинвазивное определение хеликобактериоза. ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тесты прошли клинические испытания и рекомендованы Министерством Здравоохранения России к серийному производству и практическому применению в медицинских учреждениях России.
Апробация работы
Основные результаты были представлены в постерном докладе на XVI
Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (25 - 29 мая 1998 года, Санкт-Петербург), постерном сообщении на 22м Международном Симпозиуме по Хроматографии ISC-98 (13 - 18 сентября 1998 года, Рим), в докладе на III Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori (7 апреля 2000 года, Москва), докладе на VIII Восьмой Российской гастроэнтерологической неделе (18-21 ноября 2002 года, Москва), постерном сообщении на 15м Европейском Конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине EUROMEDLAB-2003 (1-5 июня 2003 года, Барселона).
По результатам работы опубликовано 8 статей, 3 тезиса^ докладов, получен Патент РФ на изобретение «Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления» RU №2184781, оформлены заявки на Патенты на патенты «Способ диагностики хеликобактериоза ин виво» (Корниенко Е.А., Дмитриєнко М.А., 2002), приоритет от 19.04.2002 и «Способ неинвазивной диагностики инфекции Helicobacter pylori ин виво и устройство для его реализации» (Дмитриєнко М.А., Корниенко Е.А., 2003), приоритет от 11.04.2003.
Разработанные тесты проверены в научно-исследовательских медицинских и лечебных учреждениях города Санкт-Петербурга и других городов России, в т.ч. в Санкт-Петербургской Педиатрической Академии,
Санкт-Петербургской Медицинской Академии Последипломного образования, Санкт-Петербургском Медицинском Университете, Военно-Медицинской Академии (г.Санкт-Петербург), " Научно-Исследовательском институте Скорой помощи (г.Санкт-Петербург). Представлены отзывы и акты апробации тестов для диагностики хеликобактериоза.
Проект "Аналитический комплекс для диагностики хеликобактериоза" занял первое место в городском конкурсе научных работ "Внедрение-97", проводимом под эгидой Союза Ученых Санкт-Петербурга.
Разработаны Методические рекомендации по методикам определения уреазной активности и диагностики хеликобактериоза.
Разработаны Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза по уреазной активности биоптата {in vitro) ХЕЛПИЛ-тест-«АМА» ТУ 9398-001-45564088-2003 и Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза дыхательным методом {in vivo) ХЕЛИК-тест-«АМА» ТУ 9398-002-45564088-2003, проведены их технические приемочные испытания, а также клинические испытания на базе кафедры педиатрии ФПК и 11П Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической академии, кафедры детских болезней №2 Российского государственного медицинского университета (г. Москва) и Научного центра Здоровья детей РАМН (г. Москва). По результатам этих испытаний Министерство Здравоохранения РФ рекомендовало тесты к серийному производству и практическому применению в медицинской практике, к внесению в Реестр изделий медицинского назначения.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 25 рисунков и 15 таблиц. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, благодарностей, приложений (протокол проверки, отзывы, акт технических испытаний, протоколы клинических испытаний, выписка из протокола комиссии МЗ РФ) и библиографии (178 наименований).
Helicobacter pylori, история открытия, свойства микроорганизма, эпидемиология инфекции и ассоциированность ее с другими заболеваниями
Предположения об инфекционном начале некоторых заболеваний желудка, таких как гастрит и язвенная болезнь, о присутствии в желудке млекопитающих и человека неких микроорганизмов высказывались уже достаточно давно. Наиболее полный систематический обзор по истории открытия бактерии сделан в сборнике лекций по проблеме инфекции Н. pylori «Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии» Е.К.Баранской [14]. События, определяющие основные этапы предыстории и развития того раздела гастроэнтерологии, который в статье назван наукой гели-кобактериологией, приводятся здесь в виде таблиц и интересно комментируются. На основе материалов, приведенных в сборнике Е.К. Баранской, а также в работе M.Kidd and I.Modlin «Век Helicobacter pylori. Парадигмы утрачены, парадигмы вновь обретены» [120], можно составить сводную таблицу наиболее значительных событий в исследовании инфекции Helicobacter pylori (таблица 1).
Из таблицы 1 видно, как менялись представления исследователей, как довольно долго накапливались разрозненные факты, приведшие затем к появлению инфекционной гипотезы этиологии и патогенеза некоторых гастритов и язвенной болезни. Затем гипотеза была подтверждена научным экспериментом - самозаражением Барри Маршалла, продемонстрировавшим справедливость постулатов Генле-Коха применительно к инфекции [104, 127].
Сегодня известно, что бактерии H.pylori являются главной причиной гастрита у людей, и это заключение легло в основу разработки классификации гастритов, получившей название "Сиднейская система". Гастриты являются важным фактором риска в развитии язвенной болезни 12-перстной кишки и рака желудка [35, 120, 135].
Признание роли HP в развитии гастрита и язвенной болезни привело к необходимости пересмотра ранее принятых принципов лечения. В настоящее время приняты «Стандарты (протоколы) диагностики и лечения болезней органов пищеварения» [3], предусматривающие эрадикацию HP при обнаружении его в случае гастритов и язвенной болезни. Только уничтожение HP ведет к излечению гастритов и в значительной степени снижает вероятность возникновения язвенной болезни.
Свойства Helicobacter pylori
Таким образом, сегодня известно, что Helicobacter pylori — это микроорганизмы преимущественно S-образной формы длиной 2,5 — 4 мкм, шириной 0,5 мкм. На одном полюсе — 4-5-7 жгутиков длиной 5-10 мкм, которые обеспечивают бактерии возможность активно передвигаться Ш (Рисунки 1 и 2 [99]). Жгутики покрыты чехлами, достигающими толщиной 30 нм и заканчиваются колбовидными утолщениями. Вегетативные спиралевидные формы HP, имеющие жгутики, могут трансформироваться в овоидные и кокковые формы (Рисунок 3). Это происходит чаще в более старых культурах или в неблагоприятных условиях [32].
Естественной средой для HP является слизь желудка. Часто они находятся глубоко в желудочных ямках, концентрируясь в межклеточных соединениях (Рисунок 4). Helicobacter pylori может также адгезироваться на клетки слизистой оболочки. HP адгезируется только на пилорический эпителий желудка, но не на участки кишечной метаплазии. Однако она может заселять участки желудочной метаплазии в пищеводе или 12-перстной кишке. Биохимические исследования показали, что HP продуцирует большое количество фермента уреазы, который расщепляет мочевину, входящую в состав почти всех пищевых продуктов, на аммиак и СОг [112, 128]. За счет этих процессов вокруг бактерий создается защитное микроокружение в виде «облака» ионов аммония, связывающих ионы и таким образом " нейтрализующих вредное воздействие на бактерию НС1 желудочного сока.
Кроме того, как пишет Л.И.Аруин [11], «образующийся с помощью уреазы H.pylori аммиак создает щелочное окружение вокруг H.pylori, соединяясь с гидрохлорной кислотой (НОСІ), генерируемой нейтрофилами, вырабатывает ряд цитотоксических продуктов, в том числе гидроксиламин (NH2OH) и монохлорамин (NH2C1)». Эти продукты вызывают повреждение эпителия.
Объекты и методы исследования
Определение рН биоптата слизистой оболочки антрального отдела желудка проводилось методом, разработанным Е.А.Корниенко и В.Е.Милейко [43]. Тест для измерения рН биоптата был изготовлен нами на твердом пористом гигроскопичном носителе, аналогичном использованному в ХЕЛПИЛ-тесте (см. Главу 4). Тест для исследования рН содержал индикатор бромтимоловый синий, но не содержал мочевины.
Нами была подготовлена эталонная шкала изменения цвета тест-билета в диапазоне рН от 6,2 до 8, 0 (рис.2). Для этого были приготовлены фосфатные буферные растворы (система 1/15 М КН2РО4 и Na2HP04 2H20) с интервалом по величине рН в 0,2 единицы. По 0,01 мл каждого из растворов наносилось на тест-билет, получавшийся при этом цвет тест-билета воспроизводился с помощью смешивавшихся желтой и синей гуашевых красок. Проверка точности воспроизведения цвета проводилась путем сравнения цвета тест-билета с цветом эталона на шкале при помощи их сканирования (сканер Mustek 1200) и оценки цвета компьютерной программой Adobe Photoshop 6.0.
Исследованию подвергалась образцы, полученные в ходе фиброэндогастродуоденоскопического исследования (ФЭГДС) детей и взрослых пациентов с помощью эндоскопов фирмы «Olympus ХР20» по общепринятой методике взятия биоптатов без премедикации. Биоптаты брались в соответствии с рекомендациями Стандартов из антрального отдела и тела желудка. У одного взрослого пациента бралось 1-5 образцов, у детей — 1-3, чаще — 1 образец. Пробы брались у пациентов натощак, на пустой желудок.
Объем биоптата — 1-3 мм . Температура при проведении исследования 25±5С.
Для проведения исследования биоптат СОЖ помещался на тест-билет. Через 3 минуты биоптат удалялся с тест-билета. Цвет теста оценивался визуально путем сравнения с эталонной шкалой (рис. 2) или путем сканирования тест-билета и определения цвета с помощью компьютерной программы. При этом биоптат может быть исследован другими методами, например, гистологическим или микробиологическим.
Методика определения уреазной активности биологического материала
Определение уреазной активности биоптата проводилось нами с помощью ХЕЛПИЛ-теста (см. главу 4), разработка которого и являлась целью данной работы.
Апробацию тестов для определения уреазной активности in vitro, а также их клинические испытания проводили на пробах биологического материала (чаще всего биоптатов СОЖ), отбираемых в ходе
фиброэндогастродуоденоскопического исследования (ФЭГДС) взрослых пациентов и детей с помощью эндоскопов фирмы «Olympus ХР20» по общепринятой методике взятия биоптатов без премедикации. Во время ФЭГДС проводили биопсию слизистой оболочки антрального отдела желудка (1-2 биоптата), у части пациентов при наличии показаний — антрального отдела, тела желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки.
У одного взрослого пациента бралось 1-5 образцов, у детей — 1-3, чаще - 1 образец. Пробы брались у пациентов натощак, на пустой желудок.
Объем отбираемого биоптата— 1-3 мм .
Температура при проведении исследования 25±5С.
Для оценки уреазной активности биоптат СОЖ (или другой биологический материал) помещался на ХЕЛПИЛ-тест.
Затем регистрировалось время появления и интенсивность окраски синего пятна на желтом фоне тест-билета, а также размер изменившего цвет пятна. При этом биоптат удалялся с поверхности ХЕЛПИЛ-теста и при необходимости направлялся на дальнейшее обследование.
Если время появления синего пятна меньше одной минуты, то это свидетельствует о высокой УА биоптата (НР++);
если 1-3 минуты, то это свидетельствует о наличии у данного биоптата уреазной активности (НР+);
если в течение 3 минут тест не изменил своего цвета, то это свидетельствует об отсутствии УА у данного образца (НР-).
Кинетика ферментативного гидролиза карбамида
Реакция ферментативного гидролиза карбамида, несомненно, является самой важной стадией биохимического определения HP. Изучение механизма этого процесса позволяет понять его сущность, оптимизировать условия протекания и тем самым улучшить характеристики метода анализа.
Термин «механизм процесса» для разных систем может иметь различное толкование. В рамках химико-кинетического подхода под механизмом реакции обычно понимают последовательность молекулярных трансформаций исходных веществ в конечные продукты [16, 17]. Как правило, механизмы химических и биохимических реакций достаточно сложны и включают в себя образование лабильных и высокореакционных соединений.
Рассмотрим коротко основные положения кинетики ферментативного катализа.
Основные положения биокатализа были сформулированы еще в начале прошлого, XX века в работах Брауна и Анри и позднее были развиты Михаэлисом и Ментен, а также Бриггсом и Холденом [53]. Согласно их представлениям, механизм каталитического действия ферментов состоит в общем случае в образовании между ферментом и субстратом промежуточных соединений, претерпевающих в ходе реакции последовательные превращения вплоть до образования конечных продуктов и регенерации фермента.
Действительно, в простейшем случае описание кинетики ферментативной реакции укладывается в рамки так называемой двухстадийной схемы:
P - конечный продукт, kit к.!і к2 — соответствующие константы скорости.
Для сравнения кинетических свойств традиционно применяются величины Кт и Vmax :
Произведение к2ф[Е]о, имеющее размерность скорости реакции, обычно называют максимальной скоростью ферментативной реакции и обозначают Vmax, так как при избытке субстрата по сравнению с константой Михаэлиса, т.е. [S] » Кт , начальная скорость ферментативной реакции максимальна, v = Vmax. При этом порядок реакции по субстрату будет нулевой. т.е. константа Михаэлиса Кт численно равна той концентрации субстрата, при которой начальная скорость реакции равна половине предельной скорости.
В действительности механизм ферментативных реакций оказывается много сложнее и неодинаков у разных ферментов. Поэтому величины Кт и Vmax могут не иметь реального физического содержания. Традиция характеризовать кинетические свойства с их помощью многократно критиковалась, делались попытки заменить Кт и Vmax величинами, имеющими более конкретный физический смысл (например, константами элементарных стадий или составными константами), но до сих пор эти попытки не увенчались успехом. Биохимики повсеместно используют величины Кт и Vmax , тем более что они позволяют сравнивать кинетические свойства ферментов вне зависимости от степени изученности стадий процессов.
На кинетику фермент-субстратного взаимодействия оказывают влияние такие факторы, как температура, рН среды, присутствие в реакционной среде эффекторов, т.е. веществ, ускоряющих или замедляющих ход реакции.
Рассматривая механизм гидролитических реакций, необходимо учитывать, что в действительности реакции ферментативного гидролиза являются двухсубстратными, в качестве второго субстрата выступает вода [21]. При этом реакция протекает при большом постоянном ее избытке, и в силу этого имеет кажущийся односубстратный характер. Тем не менее механизм реакции определяют все участвующие в ней компоненты, и детальное рассмотрение необходимо проводить с учетом двух субстратов.
Анализ механизмов двухсубстратных реакций, в частности, исследование зависимостей скорости реакции от концентрации обоих субстратов позволяет дискриминировать механизмы и получить определенную информацию о возможной последовательности стадий.
Участников событий в случае с ферментативной реакции с двумя субстратами три: активный центр фермента Е, субстрат Si и субстрат S2. Возможны два принципиально различных сценария развития событий:
