Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Сохранение и рациональное использование генетических ресурсов
1.1. Обзор литературы 9
1.1.1. Сохранение генетических ресурсов 9
1.1.2 Общая характеристика овцебыков (Ovibos moschatus)
1.1.3. Общая характеристика яков (Bos mutus) 13
1.1.4. Общая характеристика сайгаков (Saiga tatarica) 15
1.1.5. Сперматозоиды животных 17
1.1.6. Воспроизводительная функция у кроликов 19
1.1.7. Воспроизводительные особенности у кроликов 20
1.1.8. Биотехника воспроизведения кроликов 22
1.1.9. Криоконсервация семени кроликов 24
1.2. Материалы и методы исследований 32
1.3. Результаты исследований и обсуждение 38
1. 3.1 Усовершенствование технологии криоконсервации семени кролика
1.3.1.1. Совершенствование криопротективной среды 39
1.3.1.2. Оптимизация режима замораживания семени 40
1.3.1.3. Выбор способа замораживания семени 43
1.3. 1.4 Усовершенствование инструментария для искусственного осеменения крольчих.
Усовершенствование технологии криоконсервации эпидидимального семени как метода
1.3.2. сохранения и рационального использования 45
генетических ресурсов редких и исчезающих
видов животных
Односторонняя кастрация самцов как метод
1.3.2.1. сохранения и рационального использования генетических ресурсов47
13 3 Создание банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных
1.3.3.1. Банк семени трансгенных кроликов 50
1.3.3.2. Банк семени трансгенных баранов 54
1.3.3.3. Банк семени трансгенных хряков 55
1.3.3.4. Банк семени овцебыков 56
1.3.3.5. Банк семени яков 58
1.3.3.6. Банк семени сайгаков 59
Изучение морфологических и гистологических
1.3.4. особенностей гонад и видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных 61
1.3.4.1. Биологические особенности гонад овцебыка 61
13 411 ИзУчение гистологических особенностей разных е,-
органов овцебыка
1.3.4.2. Биологические особенности гонад яка 68
1.3.4.3. Биологические особенности гонад сайгака 72
13 5 Сравнительный анализ сперматозоидов 74
различных видов животных
1.3.6. Внутритрубное осеменение свиней 78
13 61 Изучение возможности получения трансгенных g,|
свиней после многолетнего хранения семени
1.4. Заключение 89
Глава 2 Новые подходы к генетической трансформации животных
2.1. Обзор литературы 93
2.1.1. Трансгенные животные 93
2.1.2. Методы получения трансгенных животных 95
2.1.3. Ретровирусные векторы. 97
2.1.4. Использование половых клеток семенников 98 t 2.1.5. Связывание чужеродной ДНК сперматозоидами 100
2 16 Влияние отдельных факторов на процесс ^е
связывания чДНК сперматозоидами
2 -| 7 Возможность проникновения чДНК в ядра сперматозоидов
2.1.8. Строения ДНК сперматозоидов 110
2.1.9. Нуклеазы семени - как фактор защиты от чДНК 116
2.2. Материалы и методы исследований 118
2.3. Результаты исследований и обсуждение 122
2 3 1 Использование сперматозоидов в качестве естественного вектора для переноса чДНК
23 2 Введение ретровирусных конструкции в семенники животных
2 3 3 Оптимизация технологии временного блокирования сперматогенеза у кроликов
2.4. Заключение 145
Глава 3 Цитогенетические исследования в сохранении генетических ресурсов
3.1. Обзор литературы 152
3.1.1. Цитогенетические различия и видовая изоляция 152
3.1.2. Проявление хромосомного дисбаланса у животных 157
3.1.3. Нарушения в кариотипе при трансгенезе 161
3.2. Материалы и методы исследований 164
Усовершенствование метода кариотипирования
3.3.1. различных видов животных с использованием прикладных компьютерных программ
3.3.1.1. Этапы цитогенетического анализа 167
3.3.1.2. Анализ препаратов 168
3.3.1.3. Подсчет и измерение хромосом 170
3.3.1.4. Кариотипирование 171
3 3 2 Изучение и сравнительный анализ кариотипов крупного рогатого скота, овцебыка и овец
3 3 3 Анализ хромосомных аберраций у трансгенных животных
3 3 3 1 Цитогенетическое обследование трансгенных кроликов
3 3 32 Изучение влияния чДН К на стабильность кариотипа трансгенных кроликов
3 3 33 Цитогенетическое обследование трансгенных свиней
3 3 3 4 Изучение влияния чДНК на стабильность кариотипа трансгенных свиней
3.4. Заключение 190
4. Выводы 193
5. Практические предложения 196
6. Список литературы 197
7. Список сокращений 245
Введение к работе
Актуальность темы. Сохранение генетических ресурсов и рациональное использования животных является неотъемлемой частью биотехнологической и сельскохозяйственной науки. Из 6200 пород животных, относящихся к 40 видам, внесенных в банк данных ФАО/ЕАЖ, более 30% мировых генетических ресурсов домашних животных находятся на грани вымирания (Shend, 1997; Sherf, 2000).
Впервые проблему сохранения генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных поднял А-С. Серебровский (1928) и ввел термин «генофонд». Автор подчеркивал, что «в лице генофонда мы имеем такое же национальное богатство, как в виде нефти, золота, угля, сокрытых в наших недрах». Рассматривая эту проблему, Ю.П. Алтухов с соавторами (1996) ввели термин «природоохранная генетика», который употребим и для популяций сельскохозяйственных животных, поскольку породы - это не что иное, как неотъемлемая часть животного мира.
Одним из выдающихся достижений отечественной науки XX столетия явилась разработка биотехнологического метода искусственного осеменения, позволяющего тиражировать ценные генотипы в сотни и даже тысячи раз, увеличивая их распространение в популяциях и вытесняя при этом малоценные генотипы.
Открытие Миловановым В.К., Соколовской И.И., Смирновым И.В. (1947) возможности длительного сохранения семени животных в глубокоохлажденном состоянии явилось основой для создания криобанка генетических ресурсов высокопродуктивных, редких, уникальных и исчезающих видов животных.
Криобанк семени перед традиционными методами сохранения видов имеет такие преимущества, как возможность транспортировки на большие расстояния; легкость обмена генетического материала между популяциями; высокая степень надежности; сведение до минимума эффекта генетического дрейфа и инбридинга; обеспечение сохранения видов в случае эпидемий, экологических и социальных катастроф; использование отдаленной гибридизации с целью совершенствования животноводства; создание коллекции биологических материалов для различных исследований.
Генетический материал, сохраняемый в криобанке, может быть использован не только для восстановления исчезающих видов, но и для обмена генетическим материалом между популяциями, разводимыми в неволе; для обогащения резерва наследственной изменчивости свобод ножи вущих популяций, находящихся под угрозой исчезновения ввиду их малой численности; при разведении животных носителей уникальных генов, полученных в процессе трансгенеза (Эрнст Л.К. и др., 1994; Эрнст Л.К., 2004).
Существование вида, его способность выжить в данной среде зависит от сохранности генома, которой вносит сперматозоид в ооцит при оплодотворении. Совокупность механизмов обеспечивающих защиту генома в половых клетках самцов, подвергающихся сложным трансформациям в ходе сперматогенеза, является одним из условий, обеспечивающих существование вида.
Цель и задачи исследований.
Целью диссертационной работы являлась разработка и усовершенствование технологий и методик сохранения и рационального использования генетических ресурсов различных видов животных с использованием биотехнологических методов.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
• Усовершенствовать технологию криоконсервации семени кроликов.
• Разработать технологию криоконсервации эпидидимального семени животных.
• Создать банк семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.
• Изучить морфологические и гистологические особенности гонад и выполнить сравнительный анализ видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных.
• Разработать методологию рационального использования генетических ресурсов.
• Изучить возможность получения трансгенных свиней после многолетнего хранения семени.
• Изучить возможность использования сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в ооциты кролика.
• Усовершенствовать методику кариотипирования с использованием прикладных компьютерных программ и провести цитогенетический анализ животных разных видов.
Научная новизна.
В ходе выполнения диссертационной работы была усовершенствована технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая улучшить биологическую сохранность сперматозоидов, получить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов и повысить многоплодие в сравнении с прототипом.
Впервые была разработана технология криоконсервации семени овцебыка, сайгака, яка как метод сохранения редких и исчезающих видов животных. Предложен метод внутритрубного осеменения для размножения трансгенных свиней при наличии ограниченных количеств глубокозамороженного семени.
Изучены видовые особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков. Доказано, что в процессе криоконсервации семени, сперматозоиды способны связываться с чужеродной ДНК и переносить ее в ооциты при оплодотворении. Изучено влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомной изменчивости у трансгенных свиней и кроликов.
Практическая значимость.
Предложена усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, на основе которой создан банк семени трансгенных кроликов. Разработана технология криоконсервации эпидидимального семени разных видов животных, с использованием которой создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных (овцебыков, сайгаков, яков). Создан банк семени трансгенных хряков 6-ти поколений (F2, F3, F4, F5, F6 F7). Доказано, что глубокозамороженное семя трансгенных хряков, хранящееся в жидком азоте более 10 лет, может быть использовано для получения потомства и возобновления трансгенной линии. Разработана методика кариотипирования на основе прикладных компьютерных программ, позволяющая повысить эффективность цитогенетического анализа животных.
Положения, выносимые на защиту.
• Усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая повысить сохранность, оплодотворяющую способность сперматозоидов и многоплодие.
• Технология криоконсервации эпидидимального семени как метод сохранения и рационального использования генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных.
• Биологическая полноценность семени трансгенных хряков, хранившегося более 10 лет в криобанке.
• Метод внутритрубного осеменения как способ тиражирования уникальных генотипов при ограниченном запасе семени.
• Морфологические и гистологические особенности семенников яков, сайгаков, овцебыков.
• Морфологические и гистохимические особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков.
• Новая методика кариотипирования на основе использования прикладных программ как способ характеристики генетических ресурсов животных.
• Влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомных нарушений и физиологические показатели у животных.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 12 научных конференциях (Москва, Дубровицы, Боровск, Санкт-Петербург, Гаага, Рим), на заседаниях ученого совета ВИЖа. По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе в центральных журналах - 8, книг - 6, методических рекомендаций - 3, в зарубежных изданиях - 2.
Объем работы. Диссертация изложена на 235 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 73 рисунка, 5 графиков, 3 схемы. Библиографический список содержит 375 источников, в том числе 177 на иностранных языках.
Сохранение генетических ресурсов
Биологическое разнообразие животных является необходимым элементом для нашей планеты. Сохранение генетических ресурсов должно являться неотъемлемой частью биотехнологической и сельскохозяйственной науки. (Эрнст Л.К. и др., 2004; Багиров В.А. и др. 2003, 2004).
В 20-е годы прошлого столетия выдающимся генетиком Николаем Ивановичем Вавиловым была сформулирована задача мобилизации генофонда для нужд селекции. Под его руководством была создана уникальная коллекция семян культурных и диких представителей флоры, собранная из различных районов мира (Столповский, 1997; Саморуков и Марзанов, 2002).
Огромный вклад в сохранение генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных внес отечественный генетик Александр Сергеевич Серебровский.
В 1978 г. Б.Н. Вепринцев выступил с докладом на XIV Генеральной Ассамблее Международного союза охраны природы, в котором обосновал необходимость создания генетических криобанков и использования методов биологии развития для сохранения биоразнообразия (Veprintsev и Rott, 1979).
Анализ банка данных FAO/EAAP указывают, что более 30% генетических ресурсов домашних животных мира находятся на грани вымирания. По данным FAO каждую неделю исчезает одна порода домашних животных. Из 19 локальных пород КРС Содружества только 6 в нормальном (по численности) состоянии (Столповский, 1997).
Овцебык - последний представитель так называемой мамонтовой фауны, сохранившийся к настоящему времени. Он населял тундростепи Евразии, проникнув затем и в Северную Америку. В период расцвета мамонтовой фауны тундростепи занимали большую часть территории Европы, Северной Азии и больше половины материка Северной Америки. После этого в результате сильного потепления, размораживания Полярного бассейна, повышения уровня океана, заболачивания почв, деградации грунтовых льдов, усиления снегопадов, появление настов и гололеда и др. - мамонтовая фауна стала быстро деградировать и вымирать (Верещагин, 1959).
На севере Таймыра, долгое время оставалась небольшая выжившая популяция. Тем не менее, в голоцене мускусного быка не стало на всей северной части Евразии. Последняя небольшая популяция этого вида исчезла на севере Таймыра около 3000 лет назад (Якушкин, 1998, Царев, 1999).
По предположению Н.К. Верещагина (1979) главной причиной ее исчезновения был не человек, а крайне неблагоприятные природные условия. Можно сказать, овцебыки чудом сохранились лишь на небольших участках наиболее континентальной высокоширотной Канадской Арктики - на островах и материке, а затем, при последующих похолоданиях, распространились здесь и в Гренландии.
Трансгенные животные
В настоящее время достигнуты большие успехи в области генной инженерии, получены трансгенные микроорганизмы, растения и животные. Созданы организмы с принципиально новыми качествами, которые практически невозможно получить традиционными методами селекции.
Возможность комбинирования генов, независимо от генеалогического положения организма, во много раз увеличило возможности селекции (Эрнст, 2002).
Трансгенными, называют животных, в геноме которых присутствует, введенная искусственно, дополнительная генетическая информация, называемая трансгеном. Таким образом, трансген - это ген, чужеродный для данного вида и встроенный в его геном для изменения некоторых свойств организма, представляющих интерес для человека. Продукт этого гена - белок, является трансгенным или рекомбинантным продуктом. Трансген может передаваться по наследству, и привнесенные им новые генотип и фенотип наследуются в последующих поколениях по законам Менделя. На основе этого с помощью селекции возможно создание гомозиготных трансгенных линий животных. Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии (Brem G. et а!., 1985; Hammer R.E. et al., 1985).
Получение таких животных с новыми генетически запрограммированными свойствами имеет большое значение с теоретической и практической точки зрения. На современном этапе развитии биотехнологии перспектива за трансгенными животными, обладающими заданными продуктивными и биологическими свойствами или продуцирующими биологически активные вещества и фармакологические препараты и.т.д. (Багиров.1998, 2003).
Успехи современной биотехнологии открывают для животноводства новые перспективы, так как появляется возможность работать на генном уровне (выделение, секвенирование, рекомбинация и перенос отдельных генов). Применение методов генной инженерии в животноводстве дает основание прогнозировать, что традиционные методы разведения животных будут дополнены и даже заменены новыми технологиями.
В последние годы интенсивно ведутся исследования, направленные на выяснение возможности трансплантации органов и тканей животных человеку (ксенотрансплантация). Принимая во внимание анатомо-физиологические сходства и соразмерность некоторых органов свиньи (сердце, почки, и др.) с органами человека исследователи склонны считать, что при определенном генетическом вмешательстве в иммунные процессы органы трансгенных свиней могут быть использованы для ксенотрансплантации их человеку (Рябых, 2002).
Целью трансгенеза в животноводстве является получение и использование генетически трансформированных животных для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения.
Цитогенетические различия и видовая изоляция
Со времен Ч. Дарвина наши знания о предках домашних животных не претерпели существенных изменений. Решение этого вопроса возможно только на комплексной основе с использованием как данных археологических и палеобиологических исследований, так и методов современной генетики и молекулярной биологии (Орлов и Булатова, 1983; Кленовицкий П.М. и др., 2004)..
Определенную информацию в этом плане может дать изучение особенностей организации кариотипа у различных видов и их предковых форм. Однако эти данные, как свидетельствуют приведенные ниже материалы, позволяют, как правило, оценить лишь характерные особенности хромосомной дивергенции в пределах различных родов.
По отношению к основному критерию видовой самостоятельности у животных - репродуктивной изоляции, или нескрещиваемости в природе, все таксономические признаки, в пределах рода или даже семейства, можно отнести к двум неравным группам. К первой, не связанной с репродуктивной изоляцией, относятся практически все морфологические, биохимические, физиологические и генные признаки. Непосредственно судить о возможности репродуктивной изолированности форм можно судить по немногим признакам, в том числе с довольно высокой степенью достоверности на основании особенностей организации кариотипа: числу хромосом, их морфологии и тонкой организации (Графодатский и др., 1981; Аниськин и др.,1996).
Если две формы различаются числом хромосом, их морфологией, то гибриды могут быть в различной степени бесплодными, в результате нарушения нормальной сегрегации хромосом, приводящей к генетическому дисбалансу. В большинстве случаев, особенно при значительных различиях в организации кариотипа, например лошадь и домашний осел, этот критерий объективно отражает репродуктивную изоляцию сравниваемых групп.
Однако кариотипические параметры не являются абсолютным критерием видовой изоляции. В качестве примера приведем два рода Ovis и Bos семейства Bovidae. Представители рода Ovis, несмотря на существование определенных различий в числе и морфологии хромосом, дают при скрещивании плодовитое потомство. В тоже время гибридные самцы двух представителей рода Bos яка и крупного рогатого скота бесплодны, хотя их кариотипы практически идентичны. Тоже справедливо и для других представителей подсемейства. В его рамках плодовиты лишь гибриды зебу с крупным рогатым скотом и зубра с бизоном. Но, вместе с тем, в пределах вида В. taurus L. кариотипические различия, обусловленные центрическими слияниями, не сопровождаются бесплодием. Аналогичная картина наблюдается и в популяциях дикого кабана (Орлов и Булатова, 1983).
Наиболее наглядным примером изолирующего действия хромосомных различий является существование в семействах многих отрядов млекопитающих видов-двойников, т.е. видов морфологически трудно различимых, но отвечающих основному критерию видовой самостоятельности. Впервые виды-двойники (sibling-species) были обнаружены при цитогенетическом обследовании представителей класса Insecta (Майр, 1968).
