Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ БОТАНИЧЕСКОГО РЕСУРСОВЕДЕНИЯ
1.1. Теоретические и практические аспекты ботанического ресурсоведения
1.2. Методология биохимических исследований лекарственных растений
1.3. Изученность ресурсов лекарственных растений на 20 европейском северо-востоке России
1.4. Изученность мировой флоры на содержание фитоэкдистероидов
1.5. Физиологическая активность фитоэкдистероидов и перспективы их использования в медицине
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ 3
2.1. Выборочный скрининг растений на содержание экдистероидов
2.2. Выявление местообитаний экдистероидсодержащих растений и изучение внутривидовой биохимической изменчивости растений. Методика отбора образцов растений для анализа.
2.3. Определение продуктивности ценопопуляций смо- 34 левки татарской {Silene tatarica (L.) Pers.)
2.4. Культивирование растений 35
2.5 Выращивание каллусных и суспензионных культур клеток Serratula coronata
Глава 3. ВЫБОРОЧНЫЙ СКРИНИНГ РАСТЕНИЙ НА СОДЕРЖАНИЕ ЭКДИСТЕРОИДОВ 36
Глава 4. СОСТАВ И ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ В РАСТЕНИЯХ В ЕСТЕСТВЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ И В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (РЕСПУБЛИКА КОМИ)
4.1. Смолевка татарская {Silene tatarica (L.) Pers.)
4.1.1. Эколого-ценотическая характеристика, продуктивность и накопление гидроксиэкдизона в надземной части растений смолевки татарской {Silene
tatarica) в природных популяциях (европейский северо-восток России)
4.1.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в растениях смолевки татарской {Silene tatarica)
4.2. Смолевка ползучая {Silene repens Patrin) 67
4.2.1. Местообитания смолевки ползучей {S. repens) 69
4.2.2. Состав и распределение экдистероидов в растениях 70
смолевки ползучей (S. repens)
4.3. Смолевка обыкновенная (Obema behen (L.) Ikonn.) 70
4.4.1. Серпуха венценосная {Serratula coronata L.) Местообитния серпухи венценосной {Serratula сого- 76 nata)
4.4.2. Внутривидовая биохимическая изменчивость растений серпухи {Serratula coronata )
4.5. Серпуха красильная {Serratula tinctoria L.) 85
4.5.1. Местообитания серпухи красильной {Serratula tinctoНа)
4.5.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в растениях серпухи красильной {Serratula tinctoria)
4.6. Серпуха Гмелина {Serratula gmelinii Tausch) 91
4.61. Местообитания серпухи Гмелина {Serratula gmelinii) 91
4.6.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в растениях серпухи Гмелина {Serratula gmelinii)
4.7. Серпуха лучевая {Serratula radiata Waldst. & Kit.) 94
4.7.1. Местообитания серпухи лучевой {Serratula radiata) 97
4.7.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в ра тениях серпухи лучевой {Serratula radiata)
4.8. Серпуха пятилистная {Serratula quinquefolia Bieb. ex 98 Willd.)
4.8.1. Местообитания серпухи пятилистной {Serratula quin quefolia)
4.8.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в растениях серпухи пятилистной {Serratula quinquefolia)
4.9. Экдистероиды в других видах рода Serratula ПО
4.10. Стеммаканта серпуховидная {Stemmacantha serratu-hides (Georgi) M. Dittrich)
4.10.1 Местообитания стеммаканты серпуховидной {Stem- macantha serratuloides (Georgi) M. Dittrich) 4.11 Общие замечания 115
Глава 5. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕ- 119
НИЯ ФИТОЭКДИСТЕРОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
5.1. Оценка пригодности сырья серпухи венценосной для технологической переработки
5.2. Научные основы технология получения экдистероидов из растительного сырья
5.3. Культуры растительных клеток в качестве альтернативного источника фитоэкдистероидов
5.3.1. Анализ длительно культивируемых каллусных культур Serratula coronata на содержание экдистероидов
5.3.2. Особенности выделения экдистероидов из клеточной биомассы
Глава 6. 145РЕЗУЛЬТАТЫ ДОКЛИЬІИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭК-ДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕЙ СУБСТАНЦИИ «СЕРПИ-СТЕН»
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 148
ВЫВОДЫ 152
ЛИТЕРАТУРА 154
ПРИЛОЖЕНИЯ 167
Введение к работе
Актуальность темы. Совершенствование традиционных технологий переработки растительного сырья, разработка принципиально новых технологий «живых систем», возвращение интереса к фитотерапии и опыту народной медицины вызвали новую волну исследований растений как источников ценных биологически активных веществ. На обширной территории европейского северо-востока России, на которой расположена Республика Коми, произрастает более 1200 видов сосудистых растений, среди которых более 100 видов применяется в официальной медицине Российской Федерации (Мартыненко и др., 1994). В настоящее время большой интерес к использованию в качестве растительного сырья для получения новых адаптогенных лекарственных препаратов, тонизирующих пищевых добавок, косметических композиций представляют экдистероидсодержащие растения. С момента обнаружения экдистероидов в растениях в 60-х годах XX века - полигидрокси-лированных стеринов, структурно идентичных или близких по структуре истинным гормонам линьки членистоногих, известно уже более 150 различных по структуре соединений этого типа. (Dinan, 1998; Лафон, 1998; Фитоэкди-стероиды, 2003). Они обнаружены у представителей более 100 семейств покрытосеменных растений. Следует, однако, отметить, что лишь очень немногие виды растений, для которых характерно высокое содержание экдистероидов (до 1-3%), пригодны для практического использования в технологиях получения фитоэкдистероидов (Володин, 1999; Lafont, Dinan, 2003). В связи с этим актуальными направлениями исследований являются поиск новых растительных источников с высоким содержанием экдистероидов и разработка научных основ технологий получения экдистероидов из растительного сырья и клеточных культур.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института биологии Коми НЦ УрО РАН по теме: «Структурное многообразие и биологическая активность стероидов растений и клеточных культур» (Гос. per. N 01.2.00
107253) и была поддержана грантами Целевой программы сотрудничества ученых УрО и ДвО РАН «Сравнительное исследование экдистероидсодер-жащих растений географически удаленных флор: Урал, Дальний Восток» и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине Урала» «Разработка экдистероидсодержащих биологически активных добавок и лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний у жителей Крайнего Севера».
Целью настоящей работы является выявление экдистероидсодержащих видов растений в географически удаленных флорах, оценка возможности практического использования перспективных видов по качественным и количественным показателям состава и содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений, разработка научных основ технологий получения экдистероидов из новых растительных источников и клеточных культур.
Задачи работы:
- выборочный скрининг растений географически удаленных флор на содержание экдистероидов, выявление местообитаний экдистероидсодержащих видов растений, эколого-ценотическая характеристика сообществ с их участием, определение продуктивности некоторых видов растений и оценка возможности заготовки экдистероидсодержащего растительного сырья в природных популяциях;
- сравнительное исследование состава и динамики содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений некоторых представителей родов Silene (сем. Caryophyllaceae), Serratula и Stemmacantha (сем. Aseraceae);
- разработка научных основ технологии получения фитоэкдистероидов из новых растительных источников и клеточных культур;
- доклинические исследования новой экдистероидсодержащей субстанции «Серпистен», полученной из надземной части растений Serratula coronata L.
Научная новизна.
Проведен выборочный скрининг растений географически удаленных флор: европейская часть России, Урал, Северный Кавказ, Украина, Российский Дальний Восток и Китай, позволивший существенно расширить сведения о распространении экдистероидов в мировой флоре. Впервые экдисте-роиды найдены в папоротниках Athyrium sinense, Aleuritopteris argentea, Cal-lipteris esculenta и Selenodesmium obscurum. Среди покрытосеменных растений экдистероиды впервые обнаружены в четырех видах рода Serratula (Aseraceae): S. cardunculus, S. coriaceae, S. radiata и S. gmelinii; Stemmacantha serratuloides (Asteraceae); двух представителях семейства Caryophyllaceae: Si-lene jundzillii и Oberna cserei; трех представителях семейства Ranunculaceae: Helleborus caucasicum, Hepatica insularis и Clematis fusca; а также Bupleurum triradiatum (Apiaceae); Iris uniflora (Iridaceae).
Дана эколого-ценотическая характеристика сообществ с участием ресурсного экдистероидсодержащего вида растений смолевки татарской (Silene tatarica); определены продуктивность ценопопуляций и выход 20-гидроксиэкдизона из надземной части растений (европейский северо-восток России).
Установлено, что для десяти исследованных видов рода Serratula характерными экдистероидами являются 20Е, инокостерон, и экдизон, которые можно считать хемотаксономическими маркерами рода. Кроме них, растения различных видов и популяций содержат специфический набор других минорных экдистероидов. Впервые показано влияние эколого-географических факторов на соотношение основных и минорных экдистероидов в растениях этого рода. Впервые показано, что в условиях культуры на Севере в листьях растений S. quinquefolia доминирующим экдистероидом является инокостерон, а не 20-гидоксиэкдизон, являющийся основным экдистероидом растений в естественных местообитаниях (Северный Кавказ), что, как показано, связано с различным уровнем освещенности в естественных местообитаниях (полог леса) и при выращивании на открытых делянках.
Показана штаммовая специфичность каллусных культур клеток Serratula coronata по составу и содержанию экдистероидов. Выявлен штамм СШ 1.2. - продуцент инокостерона.
Практическое значение.
Выявлен ряд практически важных видов растений с повышенным содержанием экдистероидов. В целях интродукции рекомендованы следующие виды: Chenopodium bonus-henricus - как пищевое и кормовое растение; Silene tatarica, Serratula radiate, Stemmacantha serratuloides — продуценты 20E; Serratula quinquefolia - продуцент инокостерона в условиях высокой освещенности; Serratula gmelinii - продуцент структурно модифицированных экдистероидов. Для получения клеточных культур рекомендованы редкие виды растений и растения южных широтных групп: папоротник Polypodium vulgare (редкий охраняемый вид на европейском северо-востоке России) и Helleborus caucasicum (флора Северного Кавказа).
На основании сравнительных данных по динамике содержания экдистероидов в онтогенезе растений разработаны рекомендации по заготовке растительного сырья с высоким содержанием целевых веществ.
Разработаны научные основы технологии получения экдистероидов из растительного сырья и клеточных культур Serratula coronata. Получены опытные партии субстанции для организации доклинических исследований. На субстанцию «Серпистен» адаптогенного действия получен товарный знак.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены или представлены на Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000), Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000), Международном симпозиуме «Биотехнологические подходы к использованию и сохранению растительных ресурсов» (Ялта, 2002), Международной конференции «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), V Международном симпозиуме «Новые и нетрадицион
ные растения и перспективы их использования» (Москва, 2003), III Международном конгрессе по лекарственным и ароматическим растениям (Таиланд, 2003).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в соавторстве в монографии «Фитоэкдистероиды» (СПб: Наука, 2003). По материалам диссертации опубликованы 10 статей и тезисы 10 докладов на конференциях, получено 2 патента РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 194 стр., содержит 8 таблиц, 34 рисунка и 5 приложений. Состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов. Библиография включает 123 наименования (в том числе 40 на иностранных языках).
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. В.А. Мартыненко, а также к.х.н. В.Г. Лукше за консультации методам выделения природных соединений, к.б.н. И. Ф. Чадину за многолетнее творческое сотрудничество, к.б.н. Л.Д. Пчеленко за совместную работу по изучению физиологической активности субстанции «Серпистен», д.б.н. А.Р. Ишбирдину за помощь в организации экспедиции по Южному Уралу, доктору Лоуренсу Дайнану (Великобритания) за проведение биотеста растительных образцов, к.б.н. В.А. Каневу за сбор образцов и определение видов растений, к.б.н. К.Г. Ткаченко за сотрудничество и интерес к данной работе и ведущему инженеру А.П. Турышевой за помощь в подготовке многочисленных образцов для ВЭЖХ-анализа.
