Содержание к диссертации
Введение
Аналитический обзор 9
1. Энтомопатогенные грибы как биоресурс контроля численности насекомых - фитофагов
2. Биологические особенности монилиевых грибов и их продуктивность
3. Влияние факторов окружающей среды на энтомопатогенные грибы
4. Использование грибных препаратов в защите растений как реализация биологического ресурса энтомопатогенных грибов
Объекты и методы иследований
1. Объекты исследований 33
2. Методы исследований 34
2.1. Культивирование энтомопатогенного гриба М. anisopliae 34
2.2. Методы селекции гриба М. anisopliae 37
2.3. Методы определения вирулентности гриба М. anisopliae
2.4. Изучение ферментативной активности гриба М. anisopliae 38
2.5. Изучение влияния ультрафиолетового света на выживаемость конидий гриба М. anisopliae
2.6. Методика определения сохранности гриба М. anisopliae при различных режимах хранения
2.7. Методы полевых экспериментов 43
Результаты исследований 45
1. Факторы вирулентности энтомопатогенного гриба metarhizium anisopliae, определяющие его биологический ресурс
1.1. Выделение первичных спонтанных изолятов и изучение их морфологии
1.2. Ферментативная активность изолятов 57
1.3. Влияние абиотических факторов на жизнеспособность культуры гриба М. anisopliae
1.3.1. Жизнеспособность культуры гриба при хранении в жидком и сухом виде
1.3.2. Выживаемость спор гриба под действием УФ-облучения 66
2. Воспроизводство и рациональное использование энтомопатогенного гриба metarhizium anisopliae как агента регуляции численности фитофагов сельскохозяйственных растений
2.1. Оптимизация наработки биомассы гриба как основы биологического препарата
2.2. Оценка инсектицидной активности природных штаммов и морфоваров М. anisopliae
2.3. Полевые испытания 81
Обсуждение результатов исследований 91
Выводы 94
Список использованной литературы 97
Приложение 121
- Биологические особенности монилиевых грибов и их продуктивность
- Использование грибных препаратов в защите растений как реализация биологического ресурса энтомопатогенных грибов
- Культивирование энтомопатогенного гриба М. anisopliae
- Влияние абиотических факторов на жизнеспособность культуры гриба М. anisopliae
Введение к работе
Актуальность темы. Среди природных ресурсов регуляции
численности вредных видов насекомых, повреждающих
сельскохозяйственные и лесные культуры, особого внимания заслуживают энтомопатогенные грибы. Они обитают в почве, на растениях, в телах насекомых. Периодически эти биологические агенты вызывают вспышки массовых заболеваний насекомых, что приводит к резкому подавлению их численности, сохраняя урожай. Однако возникновение эпизоотии в большой степени зависит от абиотических и биотических факторов внешней среды и случается не столь часто, как это требуется для подавления численности насекомых-фитофагов, являющихся конкурентами человека в потреблении растительной пищи. Поэтому более важна интродукция выделенных из природы энтомопатогенных грибов в агроценозы с целью сохранения урожая от фитофагов. Первым в мире энтомопатогенный гриб Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. выделил из природы и предложил размножить для внесения в агроценозы известный российский ученый И.И.Мечников (1902). Этим было положено начало микробиологическому методу регуляции численности насекомых, распространившемуся по всему миру. Впоследствии энтомопатогенные грибы, относящиеся к отделам Deuteromycota и Zygomycota, стали основой биопрепаратов, предложенных для биологического контроля насекомых в разных странах. На основе природных штаммов энтомопатогенных грибов в нашей стране были разработаны биопрепараты Боверин на основе гриба Beauveria bassiana Bals. Vuil., Вертициллин на основе Verticillium lecanii Nees. (Lecanicillium sp.), Пириформин на основе Entomophthora piriformis (Petch) Hall et Bell (Conidiobolus thromboides) и другие.
Таким образом, энтомопатогенные грибы являются биологическим ресурсом, вовлекаемым в хозяйственную деятельность, поддерживающим биосферный баланс и имеющим оздоровительное значение (замена
5 токсичных синтетических инсектицидов на биологические, основанные на изъятых из природы агентов). Современная трактовка понятия «биологические ресурсы» ставит задачи расширения биоресурсной базы и развития биотехнологий, оптимизирующих управление ресурсами природных и искусственно созданных биосистем.
Что касается препарата на основе гриба Metarhizium anisopliae, предложенного И.И.Мечниковым, то его производство было прекращено в начале XX в. и с тех пор в России нет энтомопатогенного препарата на основе этого гриба. К возможным причинам неудач при разработке и применении препарата относятся недооценка изменчивости штаммов, отсутствие методов повышения биоресурса гриба как путем усиления вирулентности, так и преодоления негативного влияния факторов окружающей среды. В то же время реализация биологического ресурса Metarhizium anisopliae актуальна для подавления численности особо опасных вредителей сельского хозяйства. Среди особо опасных фитофагов в последние годы в Сибири широкое распространение получил колорадский жук. Подавление численности этого вредителя биологическими препаратами, безопасными для окружающей среды, является чрезвычайно актуальной задачей. Поэтому исследования по биоресурсному потенциалу гриба, включающие селекцию природных штаммов, оценку вирулентности гриба и его продуктивности, необходимы для разработки биопрепарата на его основе.
Цель работы - изучить возможности повышения биоресурсного потенциала гриба Metarhizium anisopliae и его рационального использования как основы для разработки биопрепарата, подавляющего численность колорадского жука.
Задачи исследований:
Изучить гетерогенность популяций природных штаммов гриба Metarhizium anisopliae по культуральным, морфологическим, биохимическим и вирулентным признакам.
Оценить вирулентность природных и полученных методом селекции на основе спонтанной изменчивости штаммов гриба по отношению к насекомым.
Определить продуктивность штаммов в разных условиях выращивания биомассы.
Оценить устойчивость исходных штаммов и морфоваров гриба к абиотическим факторам (температуре и ультрафиолетовому облучению)^
Выявить защитный эффект антиоксидантов при хранении и ультрафиолетовом облучении гриба М. anisopliae.
Определить эффективность энтомопатогенного гриба в подавлении численности колорадского жука в полевых условиях.
Защищаемые положения:
Наличие спонтанной изменчивости природных изолятов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae позволяет получать высокоактивные и стабильные формы гриба путем отбора по признакам вирулентности и ферментативной активности.
Повышение биоресурса гриба обеспечивается методами его селекции, оптимизации условий культивирования, учетом влияния абиотических факторов, в первую очередь ультрафиолетового облучения.
Штамм гриба М. anisopliae р-72-1, обладающий наиболее высокими показателями протеазной, эстеразной, липазной, амилазной и хитиназной активностей и наибольшей биологической активностью может быть использован в качестве основы препарата для биологического контроля колорадского жука.
Научная новизна. Впервые детально изучено влияние спонтанной изменчивости природных штаммов энтомопатогенного гриба M.anisopliae, выделенных из двух видов насекомых: колорадского жука {Leptinotarsa decemlineata Say.) и реликтового усача {Callipogon relictiis Saw.), на морфологические (структура, скорость роста колоний, размер конидий) и биохимические (ферментативная активность) признаки. Наличие спонтанной изменчивости у природных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р служит базовым фактором управления их биоресурсом. Установлены критерии оценки высоковирулентных и продуктивных штаммов, основанные на биотестах и определении их ферментативной активности. Определено влияние абиотических факторов -температуры и ультрафиолетового света — на сохранность и биологическую эффективность штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов в процессе длительного хранения биомассы. Продемонстрировано негативное влияние ультрафиолетового облучения на биоресурс гриба М. anisopliae. Разработана технология производства биомассы энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (штаммов р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов) с целью дальнейшего использования биологического ресурса гриба в открытых экосистемах в качестве агента регуляции численности насекомых-фитофагов. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку - опасному вредителю картофеля.
Практическая значимость. Для селекции высокоактивных и стабильных форм из естественной популяции гриба М. anisopliae предложен метод ступенчатого отбора из моноспоровых рассевов энтомопатогена. Отбор штамма по морфологическим и биохимическим критериям позволяет повысить биологический ресурс гриба как агента биологической регуляции
8 насекомых. Рекомендуется использовать штамм Metarhizium anisopliae р-72-1 как основу биопрепарата для биологического контроля колорадского жука.
Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены: на Международной научно-практической конференции молодых ученых, (Новосибирск, 2006); на Международной научно-практической конференции (Костинброд, Болгария, 2006); на 40 коллоквиуме по патологии насекомых и микробному контролю (Квебек, Канада, 2007); на Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции (Краснодар, 2008).
Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, собственных исследований, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 128 страницах, содержит 14 рисунков, 15 таблиц. Список литературы включает 200 источников, из них 105 - на иностранном языке.
Биологические особенности монилиевых грибов и их продуктивность
Использование биологического ресурса энтомопатогенных грибов наиболее ярко проявилось на примере моноваилиевых грибов (Deuteromycotina: Moniliales). Порядок Moniliales является самым многочисленным по количеству патогенных для насекомых видов. В этом порядке наибольший интерес представляют рода, в которых сосредоточено наибольшее количество энтомопатогенных видов: Beauveria, Paecilomyces (Isaria), Metarhizium, Verticillium (Lecanicillium), Aspergillus, Fusarium (Ячевский, 1917; Штейнхауз, 1952; Вейзер, 1972; Кальвиш, 1973; Евлахова, 1974; Коваль, 1974; Павлюшин, 1979; Огарков, 1990). Широкое распространение грибов из указанных родов позволило им занять различные экологические ниши, где они вступают в разнообразные отношения с насекомыми. Отличительным признаком большинства видов этих родов является способность поражать насекомых из многих отрядов. Одновременно с паразитированием они способны развиваться сапрофитно, что определяет их широкую специализацию по биотопам (Огарков, Огаркова, 2000).
В порядке Moniliales наиболее известными можно считать грибы из родов Metarhizium, Beauveria, Paecilomyces - возбудители мускардинозов насекомых. Энтомопатогенный гриб Metarhizium anisopliae, первоначально названный Entomophthora anisopliae, относится к отряду Hyphomycetes, поражает более 200 видов насекомых и поэтому является перспективным для защиты растений от вредных насекомых (Огарков, Огаркова, 2000). Гриб был впервые использован в качестве биологического агента для контроля численности насекомых в 1879 г. И.И. Мечниковым, который выделил его из хлебного жука — кузьки Anisopliae austriaca. Гриб поражает около 200 видов насекомых и других членистоногих. Колонии гриба на питательных средах отражают его макроморфологические особенности: цвет колоний меняется от желто-зеленых до оливково-темно-желтых или более темных оттенков зеленого цвета, колонии растут довольно медленно, достигая диаметра 2 см через 2 недели. Из микроморфологических характеристик следует отметить септированные бесцветные гифы. Гриб образует удлиненные, одноклеточные, сухие, почти бесцветные фиалоконидии (3,5-9x2,5-4,5 мкм), сгруппированные в цепочки и колонки, в массе дают зеленую окраску. Цепочки конидий слипаются друг с другом, образуя крупные массы (Борисов и др., 2001).
С точки зрения биоресурсов представляет интерес энтомопатогенный гриб Beauveria bassiana, поражающий до 190 видов вредных насекомых (Алешина и др., 1978; Ugine et al., 2007). Широкая распространенность в природе данного вида энтомопатогена обусловлена его способностью развиваться не только на живых насекомых, но и на растительных остатках. По данным М.В. Суздальской (1958), В. bassiana может сохраняться в лесной подстилке без потери вирулентности. Одни авторы (Шарапов, Кузьмин, 1970) считают почву естественной средой обитания грибов рода Beauveria, другие (Гукасян, 1961) утверждают, что основной экологической средой, которая оказывает влияние на биологическую активность энтомопатогенных грибов, является насекомое — хозяин. Некоторыми авторами было отмечено сапрофитное существование энтомопатогенных грибов (Жуковский, 1946; Поспелов, 1950; Огарков и др., 1976).
Грибы рода Paecilomyces (Isaria) также были выделены не только с трупов погибших насекомых, но и с растительных остатков. В процессе исследований (Огарков, Огаркова, 2000) оказалось, что большая часть штаммов грибов рода Paecilomyces была обнаружена на погибших насекомых в смешанных культурах с Beauveria.
Среди других родов монилиевых, имеющих значение в ограничении численности вредных насекомых, следует отметить грибы рода Lecanicillium (Verticillium). Грибы этого рода широко распространены в субтропических районах России, где они поражают многие виды ложнощитовок из подсемейства Lecaninae (Огарков, Огаркова, 2000). Этот род энтомопатогена отмечен и в других климатических зонах (Куликов, 1977). Особое значение имеет Lecanicillium (Verticillium) lecanii, который обнаружен на личинках и имаго тепличной белокрылки и некоторых видах тлей, в частности, вредителя хризантем персиковой тли M.persicae (Соловей, 1980; Огарков, Огаркова, 1985; Исакова, 1991; Митина, 1992; Hall, Burges, 1979).
Грибы рода Verticillium отличаются более строгой специализацией паразитирования на насекомых, нежели Beauveria. Так, V. lefroyi, маловирулентный в отношении G. mellonella, способен поражать в экспериментальных условиях 4 вида нестадных саранчовых, L. lecanii активно поражает белокрылку Т. vaporariorum. В то же время грибы рода Verticillium встречаются на довольно широком круге хозяев.
Особую группу патогенов составляют грибы рода Aspergillus, способные при определенных условиях развиваться в тканях ослабленных насекомых (Евлахова, 1974). Грибы рода Fusarium в природных условиях (Евлахова, 1974; Лавренюк, 1974; Билай, 1977; Куликов, 1977; Lynch, Lewis, 1978) способны вызывать как специфические заболевания вредных насекомых, так и их массовую гибель. К категории энтомопатогенных видов следует также отнести некоторые виды из рода Penicillium, Sporotrichum, Scopulariopsis (Полтев и др., 1969; Коваль, 1974; Евлахова, 1974; Лавренюк, 1974).
Приведенные данные говорят о широком распространении монилиевых энтомопатогенных грибов в лесном и агробиоценозах, и о больших потенциальных возможностях монилиевых грибов как биологического ресурса контроля численности вредных насекомых.
Постоянная циркуляция энтомопатогенных грибов в лесном и агробиоценозах создает действующие микроочаги заразного начала, поддерживая их численность и вирулентность на уровне, достаточном для некоторой регуляции численности фитофагов. Однако для управления биологическим ресурсом энтомопатогенных грибов целесообразно выявление возможностей сохранения и увеличения биологической активности и продуктивности культур грибов, используемых в качестве микробиологических инсектицидов.
Массовое размножение энтомопатогенных грибов на искусственных питательных средах связано с частыми пересевами, и, как следствие, со снижением такого важного свойства как вирулентность (Roy et al., 2006).
Под вирулентностью понимают совокупность свойств микроорганизма вызывать инфекцию какого - либо хозяина в определенных условиях, которые могут быть измерены количественно, в связи с чем вирулентность часто определяют как количественную меру патогенности. При измерении вирулентности часто пользуются таким термином, как летальная доза -количество пропагул патогена, вызывающее гибель определенной части популяции (Борисов и др., 2001).
Вирулентность энтомопатогенных грибов напрямую связана с инвазивностыо, т.е. способностью микроорганизма преодолевать защитные барьеры хозяина, проникать в него и размножаться. Процесс инвазии обеспечивается преимущественно комплексом ферментов, разрушающих кутикулу насекомого. Поскольку главными компонентами ее являются хитин, белки и липиды, основное внимание исследователи уделяют изучению комплекса грибных хитиназ, протеаз и липаз (Борисов и др., 2001; Kuranda, 1981; Pegg,Young, 1982; Coudron et al. 1984; St. Leger et al., 1986a; 1986b; 1993; El-Sayed et al., 1989; Samuels et al., 1989; Havukkala et al., 1993; Andersen et al., 1995; Kang et al., 1999)
Использование грибных препаратов в защите растений как реализация биологического ресурса энтомопатогенных грибов
Препаратами на основе энтомопатогенных грибов достаточно надежно контролируются разные виды тлей, наносящие ущерб овощным культурам в теплицах. Для сдерживания численности бахчевой, оранжерейной и других видов тлей рекомендован ассортимент биопрепаратов на основе таких грибов, как Lecanicillium (Verticillium) lecanii, Conidiobolus obscurus, С. thromboides, В. bassiana и др. (Гулий и др., 1982; Кальвиш, 1985; Огарков, 1985).
Несмотря на перспективность многих известных энтомопатогенных грибов в качестве агентов биологического контроля численности популяций вредных насекомых, большинство из них находятся на стадии научных исследований или небольших полевых испытаний. Кроме того, потенциал энтомопатогенных грибов использован недостаточно: в прикладных биотехнологических работах по созданию микоинсектицидов задействованы некоторые виды из родов Beauveria, Tolypocladium, Metarhizium, Verticillium, Aschersonia, Entomophthora (Евлахова, 1974; Коваль, 1974; Штерншис, 1991; Goettel et al., 1995).
Первым биологическим препаратом, действующим началом которого является энтомопатогенный гриб, зарегистрированным в бывшем СССР, был Боверин, содержащий конидиоспоры мускардинного гриба В. bassiana (в 1 г препарата содержится 2 млрд. спор). Препарат был рекомендован против колорадского жука, соснового подкорного клопа, оранжерейной тли и тепличной белокрылки, саранчовых, гусениц яблонной плодожорки, трипсов, вредителей комнатных растений в виде суспензий (Карабаш, 1967; Велицкая, 1969; Винокурова, Огарков, 1987). Боверин обладает высокой биологической эффективностью в отношении табачного трипса. Предложенное Б.Н. Огарковым поэтапное применение боверина в условиях защищенного грунта Иркутской области апробировано также в теплицах Новосибирской области (Штерншис, Андреева, 1995). В последнее время в теплицах России распространяется карантинный вредитель западный цветочный трипе. Этот вредитель восприимчив к энтомопатогенным грибам М. anisopliae, Р. fumosoroseus, В. bassiana, L. lecanii (Миронова, 1996). Так, М. anisopliae при внесении в почву снижал численность популяции трипса на 72%, а В. bassiana - на 47%. Эффективность боверина во многих случаях применения была недостаточной, что отчасти объясняется сильной зависимостью гриба В. bassiana от влажности.
Помимо Боверина существует множество экспериментально отработанных технологий получения энтомопатогенных препаратов с использованием гриба В. bassiana различных авторских штаммов и технологий. А.П. Третьяков с соавторами (1995) применяли препарат на основе данного энтомопатогена для регуляции численности табачного трипса в защищенном грунте с эффективностью 90%, Д. Райт с соавторами (1998) использовали В. bassiana для получения энтомопатогенного препарата, который давал в процессе проведения экспериментов 80-90% гибель хлопкового долгоносика, белянки сладкого картофеля и хлопкового слепняка в течение 3-10 дней применения. А.И. Пахтуев с соавторами (2001) установили, что биологическая активность культуральной жидкости штамма В. bassiana ВКМ F-3732D при внесении с кормом, определяемая по гибели личинок саранчи, составляет 72-92%, а при внесении в почву - гибель кубышек саранчи составляет 69-92%). В.А. Ярошенко с соавторами (2007) использовали культуру энтомопатогенного гриба В. bassiana F-65 для борьбы с личинками жуков-щелкунов. Применение биопрепаратов возможно также при хранении запасов сельскохозяйственной продукции. Установлено, что боверин оказывает патогенное действие на комплекс вредителей хлебных запасов (гибель составляла 60-98%). Аналогичные данные получены (Lord, 2001) для жуков - вредителей запасов зерновых.
Среди всего многообразия энтомопатогенных грибов особый интерес представляют энтомофторовые грибы в плане разработки биопрепаратов на основе покоящихся спор. Многие виды грибов при культивировании на средах образуют недостаточное количество покоящих спор для наработки биопрепарата, при этом споры имеют весьма низкий процент прорастания. Штамм гриба Entomophthora pyriformis (Conidiobolus thromboides) активен против сосущих вредителей - различных видов тлей, паутинных клещей, табачного трипса: вызывает массовое заболевание при заражении покоящихся спорами и конидиями (Махова, Ракшаина, 1994). Некоторые авторы предлагают использовать смесь штаммов различных видов энтомопатогенных грибов. Например, Э.Г. Воронина и др. (1995) разработали экспериментальный препарат, состоящий из смеси таких видов энтомофторовых грибов, как E.thaxteriana, E.pyriformis, E.exitialis, E.virulenta. Эти же авторы апробировали технологию производства и применения энтомопатогенного препарата, активного в отношении тли, табачного трипса и паутинных клещей в открытом и защищенном грунте, используя штамм Е. thaxteriana 18. Биологическая эффективность такого препарата составила 80-90% при использовании 0,25-0,5% суспензии культуральной жидкости, включающей в себя биомассу гриба, а также выделенные им в процессе роста эндотоксины.
Сотрудниками ВИЗР Э.Г. Ворониной и Т.Ю. Мукамоловой (1998) была разработана и внедрена в полупромышленных масштабах технология производства и применения инсектицидного препарата "ЭНТОКС", действующим началом которого являлся гриб Е. thaxteriana и его токсины. Еще одним вариантом препарата с использованием Entomophthora thaxteriana у этих авторов (Воронина, Мукамолова, 2000) стал препарат Микоафидин Т, инсектицидная активность 90-100%) гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте. Перспективным направлением является биологическое подавление саранчовых энтомопатогенными грибами. Продемонстрирована возможность использования против нестадных саранчовых и некоторых видов кобылок препаратов энтомопатогенных грибов, из которых наиболее перспективны В. bassiana, Paecilomyces sp., Verticillium sp. (Огарков, Огаркова, 2000). Предложено совместное использование грибов В. bassiana и М. flavoviride для преодоления влияния высоких и низких температур на энтомопатогенный эффект гифомицетов против саранчовых (Inglis et al., 1997).
Г.В. Митина с соавторами (1994) разработали и провели испытания биопрепарата, использовав в качестве энтомопатогенного биоагента гриб V. lecanii. Биопрепарат, полученный авторами, обладал высокой активностью в отношении оранжерейной белокрылки, (эффективность 0,5% экстракта -91,7%) и персиковой тли. Гибель 60% тлей наблюдалась при концентрации рабочей эмульсии 0,1%. А.П. Третьяков с соавторами (1995) также использовали данный вид микромицета в качестве основы для препарата против оранжерейной белокрылки. Биологическая эффективность штамма РУ 4 на личинках оранжерейной белокрылки составляла 80-95%. И.В. Андреева с соавторами (1995) применяли штамм гриба V. lecanii F-8 в защищенном грунте, при этом биологическая эффективность препарата против паутинного клеща достигает 87 - 98% на 14 сутки, а против тепличной белокрылки 100% на 6 сутки.
На Дальнем Востоке вредителем, сравнимым по значимости с колорадским жуком, является 28-точечная картофельная коровка. Б.Н. Огарковым на основе выделенного из погибших особей коровки гриба Paecilomyces sp. разработан препарат пециломин. При 2 - 3-кратной обработке этим препаратом удалось защитить растения от картофельной коровки (Огарков, 1990).
Культивирование энтомопатогенного гриба М. anisopliae
Схема культивирования энтомопатогенного гриба М. anisopliae штаммов р-72 и 85-69р была выбрана согласно методическим указаниям (Евлахова, Велицкая, 1961) и включала в себя следующие стадии: 1. получение исходной культуры штаммов из музейных пробирок; 2. наработка посевного материала штаммов; 3. получение биомассы штаммов; 4. контроль качества полученной биомассы по отобранным критериям. В процессе культивирования использовали следующее технологическое оборудование и материалы: 1. Автоклав ВК-75. 2. Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру 30 С—100 С с отклонением до 1 С от заданной. 3. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг для взвешивания реактивов. 4. Шкаф сушильный. 5. Термостаты электрические для выращивания культур грибов с автоматическим терморегулятором до температуры 35 С и с ценой деления 0,2 С. 6. Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678. 7. Центрифуга. 8. Шейкер лабораторный на 6 колб. 9. Электроплита по ГОСТ 14919. 10. Микроскоп световой биологический с увеличением в 900х— 1000х раз. П. рН-метр с пределом допускаемой погрешности не более 0,05 ед.рН. 12. Дистиллятор. 13. Термометры жидкостные стеклянные с диапазоном температуры 0 С — 50 С и 50 С — 100 С по ГОСТ 28498 с пределом допускаемой погрешности ±0,5 С с ценой деления шкалы 0,5 С. 14. Шпатель 1-3 по ГОСТ 9147. 15. Штативы для пробирок. 16. Пинцеты по ГОСТ 21241. 17. Чашки ЧБН-2 по ГОСТ 25336. 18. Стекла предметные по ГОСТ 9284. 19. Стекла покровные по ГОСТ 6672. 20. Ступка 1,2 по ГОСТ 9147. 21. Спиртовка СЛ-К2 по ГОСТ 25336. 22. Пестик 1-2 по ГОСТ 9147. 23. Пипетки по НТД. Музейная культура М. anisopliae штаммов р-72 и 85-69р хранилась на скошенной агаризованной питательной среде Сабуро следующего состава (на 1 дм дистиллированной воды): пептон мясной ферментативный - 10 г, глюкоза кристаллическая моногидрат - 40 г, дрожжевой экстракт - 0,5 г, агар микробиологический — 20 г, рН 6,5 до стерилизации.
На первом этапе технологического процесса культивирование осуществлялось размножением музейных культур путем поэтапного пересева спорово-мицелиальной массы на ряд последовательных пробирок со скошенной плотной питательной средой Сабуро.
На втором этапе осуществлялось получение посевного материала путем смыва спорово-мицелиальной массы с маточных пробирок стерильным физиологическим раствором в колбы вместимостью 50 см . Полученную таким образом суспензию использовали для инокулирования флаконов со стерильной смесью пшена и отрубей. Флаконы инкубировали в термостате при температуре (25+1) С, ежедневно встряхивая. Культивирование проводили до полной переработки питательного субстрата в споровую биомассу. По окончании культивирования содержимое флаконов переносили на пергаментную бумагу, сушили на открытом воздухе и перемалывали на лабораторной мельнице. Полученный порошок служил готовой препаративной формой.
Наработка жидкой препаративной формы осуществлялась следующим образом: аналогично наработке сухой формы сначала получали посевной материал путем смыва спорово-мицелиальной массы с маточных пробирок стерильным физиологическим раствором в колбы вместимостью 50 см . Полученную таким образом суспензию использовали для инокулирования колб вместимостью 500 см , содержащих 250 см жидкой среды Сабуро. Культивирование проводили в лабораторном шейкере в течение 4 суток при температуре (25+1) С. По окончании времени культивирования биомассу асептично переносили в стерильные флаконы вместимостью 10 и 250 см , закрывали резиновыми пробками, закатывали алюминиевыми колпачками и хранили в холодильнике при температуре (6+0,1) С для дальнейшего использования.
Технологический процесс наработки сухой культуры занимал 12 суток, жидкой - 6 суток. Для селекции гриба использовали явление спонтанной изменчивости. При изучении спонтанной изменчивости штаммов в культуре использовали набор питательных сред, с помощью которых оценивали гетерогенность моноконидиальных изолятов по морфологии и культуральным свойствам. Кроме этого, в качестве показателей изменчивости изучали показатели ферментативной активности полученных морфологических вариантов и их вирулентность.
Для выделения моноспоровых изолятов проводили рассевы суспензии смытых с поверхности агаризованной питательной среды конидий гриба, далее отбирали выросшие колонии, отсевали их в чашки Петри и оценивали морфологию в сравнении с родительскими штаммами. Сходные по морфологии колонии объединяли в морфологические группы. Для оценки стабильности морфоваров их культивировали в течение пяти вегетативных пассажей на наборе питательных сред. Согласно методике, все выделенные варианты во всех пассажах перевивали с каждой среды на ту же среду из используемого набора. При выявлении стабильных групп морфоваров проводили сравнение их биохимических свойств и вирулентности. Морфологию вновь полученных изолятов оценивали по окраске и форме колоний, размерам колоний и скорости роста мицелия на разных искусственных питательных средах.
Влияние абиотических факторов на жизнеспособность культуры гриба М. anisopliae
Энтомопатогенные грибы, являясь компонентом природных биоценозов, подвергаются влиянию различных абиотических факторов окружающей среды (температуры, влажности, солнечной радиации и др.). Для повышения биологического ресурса микроорганизмов, используемых в качестве регуляторов численности насекомых, необходимо защищать их от отрицательного влияния факторов окружающей среды, таких, как солнечное излучение и окислительные процессы (Ignoffo,1992; Alves et al., 1998). Признанным фактором отрицательного влияния является солнечная радиация (ультрафиолетовое облучение), действие которой приводит к снижению жизнеспособности и вирулентности спор (Inglis et al., 1997). Проблема сохранности микроорганизмов в течении длительного времени может быть связана и с токсическим действием кислорода, главным образом, его активных метаболитов (Фут, 1979; Штерншис, 1995).
Вопрос об изменениях, происходящих с энтомопатогенными грибами при их хранении, освещен недостаточно. Большинство исследователей указывают на снижение их активности в процессе хранения. В то же время есть данные, что при определенных условиях энтомопатогенные грибы и бактерии могут храниться в течение нескольких лет без изменений. Для ряда микроорганизмов на первый план выступает взаимодействие патогена с кислородом воздуха (Штерншис, 1995). Окислительный процесс, разрушающий основные биополимеры клеточных мембран, сопровождается образованием свободных радикалов (Абрамова, Оксенгендлер, 1985). Добавление антиоксидантов, блокирующих свободные радикалы, тормозит процесс окисления и сохраняет биологическую активность препаратов полностью или частично, в зависимости от условий окисления, типа антиоксиданта и его концентрации. Это подтверждено на примере ряда культур микроорганизмов, в том числе для гриба Beauveria bassiana (Кирсанова, 1968).
Нами была предпринята попытка изучения сохранности культур гриба в жидком и сухом виде при различных температурных условиях с применением антиоксидантов. Для этого был взят морфологический вариант р-72-1, показавший наибольшую ферментативную активность.
Учитывая отсутствие постоянных оптимальных температур в полевых условиях для выживания энтомопатогенного гриба М. anisopliae при изучении сохранности в лабораторном эксперименте были взяты граничные положительные и отрицательные температурные значения +20 С и -20 С, а также промежуточная средняя температура +6 С. В качестве контроля использовали жидкую и сухую культуру гриба, размноженную на питательных средах. Общий срок хранения культур при заданных температурах составил 20 месяцев. В течение каждого месяца производили вскрытие одного флакона с культурой, заложенной на хранение, после чего делали высевы на питательный агар Сабуро с целью установления титра. В качестве веществ, защищающих культуру гриба от окислительных процессов, использовали антиоксиданты ионол и тирозол в трех концентрациях каждый. Контролем служил образец культуры гриба без добавления антиоксидантов. Результаты представлены в таблицах 8 и 9. При хранении суспензии при — 20 (таблица 8) титр в контроле в первые 3 месяца снизился почти в-300 раз, а-к концу 20 месяца примерно на 3; порядка.по сравнению с;исходным.титром;до хранения; Добавление ионола и, тирозола (0,15-0,30%) позволило сохранить жизнеспособность спор через 3 месяца хранения почти на. исходном уровне. Через 20 месяцев жизнеспособность спор снизилась, в контроле, почти на 3 ; порядка, с добавлением антиоксидантов: в этих, же концентрациях уменьшение произошло лишь в 2-3 раза. . За весь период хранения при температуре. 6 С жизнеспособность спор, практически не изменилась, поэтому добавление антиоксидантов не изменило картину.наблю дений.: При хранении суспензии при + 20 С за 14 месяцев исходный титр снизился: в зоо. раз в. контроле. Добавление антиоксидантов обеспечило частичную сохранность, жизнеспособных спор в некоторых концентрациях. Почти полное сохранение исходного уровня наблюдали при добавлении ионола в концентрации? 0,15% и тирозола в концентрации 0,30%. За 20 месяцев в контроле жизнеспособность снизилась почти на 3; порядка, а при; введении тирозола (0,30%) снижение произошло лишь в Ъ- раза. Меньшие: концентрации антиоксиданта были недостаточны для защитного эффекта:
Полученные данные позволяют сделать вывод о равной эффективности ионола и- тирозола в концентрациях 0Д5 И 0-30% в качестве веществ, позволяющих сохранить жизнеспособность спор гриба М: anisopliae ъ суспензии в условиях низких отрицательных температур (-20 С), и поэтому перспективных для использования в этих целях.. При хранении суспензии спор гриба в условиях комнатной (+20 С) температуры наиболее эффективным: для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30%. .
Таким образом, изученные нами добавки; антиоксидантов ионола. и тирозола в количестве 0,15% и 0 30% позволяют увеличить срок хранения культуры гриба в суспензии в диапазоне температур от +20 до -20 С до 20 месяцев с незначительной потерей жизнеспособности. Поскольку тирозол в концентрации 0,30% позволяет сохранить количество жизнеспособных спор без потери, то добавление этого антиоксиданта в указанной концентрации можно считать наиболее оптимальным и эффективным для сохранения гриба М. anisopliae в суспензии.
Представленные в таблице 9 данные свидетельствуют о том, что, в отличие от жидкой препаративной формы, споры в сухом виде имеют гораздо большую жизнеспособность. При - 20 С за 20 месяцев в контрольном варианте титр все же снизился более чем на порядок. Добавление антиоксидантов при этом сохранило жизнеспособность спор почти на исходном уровне. При хранении препаратов при температуре +6 С выживаемость спор оставалась на одном уровне в контроле и опытных вариантах. В связи с этим следует сделать вывод о нецелесообразности добавления антиоксидантов, если препарат предполагается хранить при указанной температуре в сухом виде. При + 20 С лишь к концу хранения титр спор снизился, но добавление тирозола в концентрациях 0,08 и 0,15% сохранило жизнеспособность спор почти на исходном уровне.
Похожие диссертации на Использование биологического ресурса энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. для регуляции численности колорадского жука
