Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Моллюски и бактерии как экологические компоненты природно-биологических ресурсов водных экосистем 11
1.2. Экологические факторы среды и их влияние на биологические ресурсы (моллюски) водных экосистем 14
1.2.1. Механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к абиотическим факторам среды 14
1.2.2. Механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к биотическим факторам среды 1б
1.2.3.Биохимические механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к антропогенным факторам среды 20
1.3. Лизоцим как молекулярно-биологический ресурс гидробионтов и его участие в жизнедеятельности организмов 27
1.3.1. Распространение лизоцима в природе 27
1.3.2.Роль лизоцима как биологического фактора адаптации 33
2. Объект и методы исследования 37
2.1. Характеристика объекта и места отбора проб 37
2.2. Определение литической активности моллюсков 39
2.3. Выделение и очистка лизоцима моллюсков Anodonta cygnea 40
2.4. Электрофоретическое исследование препаратов лизоцима Anodonta cygnea 41
2.5. Определение численности сапрофитных бактерий 42
2.6. Опреление спектра антимикробного действия лизоцима 42
2.7. Моделирование экосистемы для оценки влияния токсикантов на лизоцимную активность двустворчатых моллюсков 44
2.8. Методы определения тяжелых металлов в исследуемых объектах 46
2.9. Статистическая обработка результатов 46
3. Экологическая характеристика гидробио ценозов среднего течения р. урал 47
3.1. Гидрофизическая и гидрохимическая характеристика биоценозов среднего течения реки Урал 47
3.2. Характеристика малакофауны как компоненты биологических ресурсов среднего течения реки Урал 51
3.3. Характеристика микробиоценоза среднего течения реки Урал 55
4. Лизоцим двустворчатых моллюсков родов zjnio и anodonta в системе управления бактериоресурсным потенциалом водных экосистем 63
4.1. Бактериолитическая активность двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta 63
4.2. Роль лизоцимной активности двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta в регуляции бактериоре-сурсного потенциала водоемов 69
5. Влияние тяжелых металлов на лизоцим- ную активность двустворчатых моллюсков родов 78
5.1. Микроэлементный состав мягких тканей двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta 79
5.2. Реакция лизоцимной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta на токсическое воздействие ионов свинца и кадмия 84
6. Характеристика лизоцима двустворчатых моллюсков 98
6.1. Выделение и очистка антибактериального фактора пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea 98
6.2. Электрофоретическое подтверждение лизоцимной природы антибактериального фактора пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea 103
6.3. Сравнительная характеристика физико-химических свойств препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea 106
6.4. Характеристика спектра антибактериальной активности препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea 111
Заключение 116
Выводы 129
- Экологические факторы среды и их влияние на биологические ресурсы (моллюски) водных экосистем
- Определение литической активности моллюсков
- Характеристика малакофауны как компоненты биологических ресурсов среднего течения реки Урал
- Реакция лизоцимной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta на токсическое воздействие ионов свинца и кадмия
Введение к работе
Двустворчатые моллюски по своим физиологическим особенностям являются естественными фильтраторами водной среды (Догель В.А., 1975; Скоп-цова Г.Н., 1984), основным компонентом «рациона» которых служит бактерио-планктон (Жадин В.И., 1954; Сорокин Ю.И., 1971). Следовательно, будучи трофически связанными с бактериями, они участвуют в формировании бакте-риоресурсной компоненты водоемов (Бульон В.В., 2002).
При анализе биотических связей между гидробионтами и бактериями установлено, что среди антибактериальных факторов особое место принадлежит лизоциму - важнейшему ферменту естественной резистентности, который, гид-ролизуя гликозидные связи полисахаридных комплексов стенок бактерий, вызывает нарушение муреинового слоя и лизис их клеток и, тем самым, элиминирует их из биоресурсов (Кокряков В.Н., 1999).
Принимая во внимание имеющиеся литературные данные о лизоциме, как о факторе, участвующем в формировании гидробиоценозов (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998; Устинова Г.М., 2004), можно рассматривать данный фермент и как один из возможных показателей адаптации двустворчатых моллюсков к условиям антропогенного загрязнения водной среды. Однако, двустворчатые моллюски, несмотря на их особую роль в водоеме, связанную с фильтрационно-окисляющей способностью, в этом отношении мало изучены (Ломакин М.С, 1990). В доступной литературе нет сведений о роли лизоцима моллюсков в процессах формирования бактериальной компоненты биологических ресурсов, а также о лизоциме как о факторе адаптации этих организмов к среде обитания.
Все сказанное свидетельствует об актуальности проведения данного исследования.
Цель работы — изучение биоразнообразия и динамики развития моллюсков и бактерий; выделение, характеристика и оценка роли лизоцимного фактора пресноводных двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta в механиз мах формирования бактериоресурсного потенциала и охране от антропогенного загрязнения р. Урал.
Задачи исследования:
1. Исследовать биоразнообразие и динамику развития малакофауны и бактерий в составе биологических ресурсов р. Урал.
2. Оценить бактериолитическую активность двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta.
3. Изучить роль лизоцимной активности моллюсков в механизмах регуляции бактериоресурсным потенциалом водоемов.
4. Выделить, очистить и охарактеризовать физико-химические свойства лизоцима - как молекулярно-генетического ресурса двустворчатого моллюска Anodonta cygnea.
5. Выявить спектр антибактериальной активности препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea.
6. Исследовать влияние антропогенного загрязнения среды тяжелыми металлами на продукцию лизоцима моллюсками Unio pictorum и Anodonta cygnea как биологического показателя устойчивости к токсикантам.
Научная новизна. Выявлены дигрессивные сукцессионные изменения в малакофауне р. Урал, характеризующиеся обеднением биоразнообразия двустворчатых моллюсков, исчезновением ранее господствующих видов Sphaeriastrum rivicola, Euglesa supina и заменой их - видом Unio pictorum. В бактериоресурсах р. Урал прослежена динамика в смене автохтонной микрофлоры на аллохтонную.
Во всех тканях моллюсков обнаружена лизоцимная активность; наивысшая активность лизоцима выявлена в экстрактах жаберной ткани, достигающая 1,7 - 4,1 ед./мг белка, при этом активность фермента у Anodonta cygnea в 4,7 -6,5 раз ниже по сравнению с моллюсками Unio pictorum. Исследована сезонная динамика изменения лизоцимной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков.
Впервые выявлены прямая корреляционная зависимость между численностью сапрофитов в воде и уровнем лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков (Ккорр.= 0,99) и обратная между бактериальной обсемененностью воды и обсемененностью жабр моллюсков (Ккорр. = - 0,88); показана обратная корреляция между уровнем лизоцимной активности жаберной ткани и количеством сапрофитов на них (ККОрр. = - 0,93). Выявленные закономерности позволили обосновать существование системы управления микроборесурсным потенциалом пресных водоемов, основанной на сопряженном взаимодействии «уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков = уровня численности бактерий в водоеме».
Показано, что токсическое действие металлов на лизоцимную активность моллюсков подчиняется теории стресса, но зависимость «доза-эффект» по металлу для каждого вида моллюсков является видоспецифической.
Получен препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea и исследованы его физико-химические и антибактериальные свойства. Показано, что препараты лизоцима моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea действуют на широкий спектр грамположительных и грамотрица-тельных бактерий, но в отношении последних они в 2 - 4 раза активнее яичного лизоцима.
Теоретическая и практическая значимость работы. Расширены представления о биоресурсном потенциале моллюсков и бактерий р. Урал.
Получены данные о распространении, физико-химических и антибактериальных свойствах лизоцима среди пресноводных двустворчатых моллюсков и его роли в трофических взаимоотношениях с бактериями. Обоснована система управления процессами регуляции микробиоценозами водных экосистем.
Выявлен неодинаковый дозовый эффект тяжелых металлов на лизоцимную активность разных видов моллюсков. Предложены методические подходы к охране водных ресурсов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами (положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 20 января 2005 на заявку № 2003126248/13 (028088)).
Реализация результатов исследования. Результаты исследования используются в системе вузовского образования студентов на кафедре химии и методики преподавания химии и кафедре зоологии ГОУ ВПО «Оренбургский государственный педагогический университет» (акты внедрения от 05.05.2005 г.); на кафедре биохимии с курсом физической и коллоидной химии ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава» (акт внедрения от 10.03.2005 г).
«Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» внедрен в работу Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от 18.04.2005), лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 21.03.05).
Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; II Международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий», Оренбург, 2002; Региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, г. Оренбург, 2003, 2004, 2005; Межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство», г. Оренбург, 2003; конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биоэлементы», г. Оренбург, 2004; II Всероссийской конференции «Экосистемы малых рек: биоразнообразие, экология, охрана», ИБВВ РАН, п. Борок, 2004; Областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2005»
Оренбург, 2005; Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ - 2005», Москва, 2005.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 журнальные статьи, получено положительное решение на изобретение «Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» от 20 января 2005 на заявку №2003126248/13 (028088).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Указатель литературы содержит 152 отечественных и 50 зарубежных источников литературы. Текст иллюстрирован 16 таблицами, 29 рисунками и 16 фотографиями.
Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование выполнено в ГОУ ВПО «Оренбургской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в соответствии с открытым планом научно-исследовательской работы (государственный регистрационный номер темы 01.2.00316166).
Положения, выносимые к защите:
1. Биологическое разнообразие малакофауны и бактерий в системе биологических ресурсов р. Урал.
2. В управлении микроборесурсным потенциалом пресных водоемов существует система, основанная на взаимодействии «уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков = уровня численности бактерий в водоеме».
3. Лизоцимы пресноводных двустворчатых моллюсков вида U. pictorum и вида A. cygnea - новые представители семейства лизоцимов беспозвоночных, проявляющие высокую антимикробную активность в отношении грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий.
Экологические факторы среды и их влияние на биологические ресурсы (моллюски) водных экосистем
Процессы обмена веществ в живом организме находятся под постоянным воздействием комплекса факторов среды обитания. Выживание организмов и поддержание биологического разнообразия в колеблющихся условиях внешней среды невозможно без специальных адаптации (Одум Ю., 1986). 1.2.1. Механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к абиотическим факторам среды Адаптации двустворчатых моллюсков к абиотическим факторам среды, среди которых наибольшее значение имеют течение воды, соленость и кислотность (рН) среды, а также температурный фактор можно отнести к морфологическим адаптациям, основанным на изменении структурных особенностей организма, сформировавшихся в процессе эволюционного развития (Шилов И.А., 2001). Течение воды. Течение воды представляет собой важный экологический фактор, обуславливающий деление двустворчатых моллюсков на 2 группы: - реофилов, обитателей текучей воды; - стагнофилов, обитателей стоячих водоемов. Течение воды не является изолированно действующим фактором, оно несет с собой кислород и питательные вещества, удаляет продукты жизнедеятельности, выравнивает температуру воды. У всех речных видов, как правило, наблюдается большее потребление кислорода, чем у видов, обитающих в стоячей воде. Пища моллюсков реофиль-ных видов также существенно отличается от пищи стагнофильных моллюсков. В то время как у речных двустворок в пище преобладает неоформленный органический детрит, двустворчатые моллюски стоячих вод получают в качестве пищи или планктон, или более оформленные остатки придонных организмов, а также иловые частицы. Наиболее распространенными обитателями рек являются виды U. picto-гит и 13. tumidus, обитающие, преимущественно, в прибрежной зоне на песча-но-иловатом грунте с замедленным течением. К представителям стоячих водоемов с заиленным дном относят вид A. cygnea (Жадин В.И., 1952). Соленость среды. Фактор солености воды является ведущим при разграничении гидробионтов на морских, солоноватоводных и пресноводных организмов. Двустворчатые моллюски семейства Unionidae относятся к типично пресноводным видам. Моллюски вида A. cygnea были изучены в отношении солевой резистентности.
Было установлено, что беззубка только в совершенно пресной или слегка солоноватой воде (общая соленость не выше 2%о) ведет себя нормально. В этих условиях пресноводные двустворчатые моллюски нормально дышат, потребляя значительное количество кислорода. При резком повышении солености в местах обитания до 5 - 7 %о моллюски закрывают раковину и потребление кислорода резко уменьшается. При солености 9%о большинство моллюсков погибают (Шкорбатов Г.Л., Старобогатов Я.И., 1990). Кислотность среды. Активная реакция среды, о которой судят по величине рН, также представляет собой фактор, регулирующий активность организмов. Оптимальные значения рН среды для жизни большинства видов пресноводных двустворчатых моллюсков лежит в пределах рН 6,0 - 8,0. При повышении или понижении рН от указанного диапазона моллюски, как правило, впадают в оцепение и при рН 10,0 погибают (Жадин В.И., Герд СВ., 1961). Температура среды. Температура воды - очень переменный фактор. Река Урал, как и большинство водоемов, испытывает сильные сезонные колебания температуры воды. Известно, что гидробионты обладают более выраженной стенотермно-стью, чем наземные животные: 4-25 С — температурный интервал, в котором могут существовать двустворчатые моллюски. При повышении температуры до 30С наблюдается массовая гибель моллюсков (Рамад Ф., 1981; Смирнова Н.Ф., 1974). Температурный фактор оказывает большое влияние на процессы жизнедеятельности моллюсков, в частности на процессы размножения и темп роста организмов. Рост моллюсков начинается весной, когда температура воды постепенно растет от зимнего минимума к летнему максимуму, летом достигает оптимального значения. При наступлении осеннего похолодания моллюски стремятся уйти вглубь водоема, зарываются в грунт и впадают в оцепенение (Жадин В.И., 1954). Температурные условия оказывают влияние на режим потребления моллюсками кислорода. У широко распространенных моллюсков семейства Un-ionidae при оптимальной температуре 18 - 20С наблюдается значительное потребление кислорода - 0,023 см3 в 1 час на 1 г веса. В то время как при снижении температуры воды до 0,5С потребление кислорода почти прекращается (Константинов А.С., 1986). Практически все авторы указывают, что температура воды в значительной степени влияет на физиологическую, в том числе и фильтрационную, активность двустворчатых моллюсков и, как следствие, на эффективность аккумуляции ими бактерий из окружающей среды (Говорин И.А., 2000) и, следовательно, на самоочищение водоема в целом (Нефедова Е.М., 2001). 1. 2. 2. Механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к биотическим факторам среды Биотические факторы включают все воздействия со стороны живых организмов, ввиду этого, правильнее говорить о биотических взаимодействиях организмов между собой. Эти связи, в первую очередь, состоят в прямых трофических взаимоотношениях (Рамад Ф., 1981). В качестве пищи двустворчатые моллюски используют бактерии, грибки и ткани водорослей и высших растений, а также продукты разрушения организмов, находящиеся в той или иной фазе разложения (Шкорбатов Г.Л., Старо- богатов Я.И., 1990; Говорин И.А., 1991). Однако, как уже отмечалось, в зависимости от особенностей мест обитания моллюски могут потреблять различную пищу. Бактерии играют видную роль в питании двустворок. Через тело двустворчатых моллюсков в процессе питания проходит весьма значительное количество воды, при этом подавляющая часть бактерий, взвешенных в ней, остается в теле моллюсков. Принимая во внимание данные о «фильтрационном» типе питания этих гидробионтов, хотелось бы сделать акцент на трофических взаимоотношениях двустворчатых моллюсков с микробным сообществом водной среды. Данные о степени удержания двустворчатыми моллюсками различных микроорганизмов неоднозначны, а иногда и противоречивы.
С одной стороны, в настоящее время не вызывает никаких сомнений присутствие в организмах моллюсков, вследствие загрязнения воды, разнообразной аллохтонной микрофлоры, включая санитарно-показательные и патогенные бактерии кишечной группы — Bacterium coil, Salmonella и Shigella spp., Vibrio cholerae, V. para-haemolyticus (Castelli J., 1966; Нижегородова Л.Е., Нидзвецкая Л.М., 1980; Пу-ченкова С.Г., 1987; Castro A. et ah, 1990). С другой стороны, непосредственный механизм удержания бактерий двустворчатыми моллюсками, его эффективность, а главное дальнейшая "судьба" захваченных бактериальных клеток остаются до сих пор мало изученными (Говорин И.А., 2000). Лабораторные измерения фильтрации естественного морского бактерио-планктона моллюсками М. arenaria позволяют сделать вывод, что они наиболее эффективно отфильтровывают бактерии размером более 0.5 мкм (Wright et ah, 1982). Моллюски Venus verrucosa в условиях эксперимента поглощают около 60% меченных - 14С и добавленных в нативную морскую среду бактериальных клеток. При этом больше всего меченых бактерий зафиксировано в висцеральной ткани, жабрах и мантии. При пересчете на единицу сухой массы тканей больше всего бактерий содержится в жабрах (Amouroux J.-M., 1984). Черноморские мидии Mytilus galloprovincialis в условиях эксперимента способны отфильтровывать из нативной морской воды, искусственно загрязненной добавлением коммунально-бытовых стоков, значительное количество аллохтонных бактерий. При оптимальных для фильтрационной активности данных моллюсков температуре и солености (18С, 15 - 16%о), а также при интенсивном водообмене скорость фильтрования бактериальной взвеси животными составляла 6,4 х 10 - 2,0 х 107 кл/(экз. ч). При этом моллюски элиминировали из поступающей в них водной взвеси 54,5-71,0% гетеротрофных бактерий и 68,0-76,0% бактерий кишечной группы (Говорин И.А., 1991). Следует признать, что для таких фильтраторов, как двустворчатые моллюски, большое значение в удержании микроорганизмов из окружающей среды имеет не только концентрация бактериальных клеток, но и степень их агрегированное. Так, в работах Сорокина Ю.И. (1970, 1972) было показано, что 30 -40% клеток естественного бактериопланктона объединены в агрегаты размером более 4 мкм, а в агрегированной форме они улавливаются значительно легче. Экспериментальными работами (Говорин И.А., Адобовский В.В. 1992; Говорин И.А., 2000) было также показано, что уровень адсорбции бактериальных клеток находится в прямой зависимости от вида моллюска и температуры окружающей среды.
Определение литической активности моллюсков
Метод приготовления экстрактов тканей моллюсков. Экстракты моллюсков готовили путем растирания их тканей в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,2) с кварцевым песком на холоду в фарфоровой ступке с добавлением ингибитора протеаз - фенилметилсульфонилфторида 300 мкг/мл (Остерман Л.А., 1981). Полученные гомогенаты подвергали многократному замораживанию и оттаиванию. Центрифугировали при 9000g в течение 15 минут. Осадок отбрасывали. В полученных экстрактах определяли литическую активность спектро-фотометрическим методом. Спектрофотометрический метод определения лизоцимной активности гидробионтов. О лизоцимной активности полученных препаратов судили по изменению светопропускания опытной взвеси микрококка по сравнению с исходной. Лизоцимную активность экстрактов и элюатов определяли в суспензиях тест-культуры М. lysodeikticus (штамм № 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича) с исходной оптической плотностью D540 = 0,3 - 0,32 при 27С и длине оптического пути 10 мм на спектрофотометре СФ-46 (Thammasirirak S. et. al., 2001). Для опыта использовали лиофилизированную культуры М. lysodeikticus. IOOJLLI клеток живой культуры М. lysodeikticus с исходной плотностью 0, 15, разведенной в 10 раз, вносили в жидкую питательную среду (МПБ) и выращивали при 27 С па ротационном шейкере УМТВ - 12 - 250 при перемешивании 100 — 150 об/мин. На 11-ом часу культивирования культуру снимали с шейкера. Выращенную жидкую культуру вносили в ампулы по 1,5 мл. Лиофилизацию осуществляли в лабораторном сублиматоре ОЕ - 960 (Венгрия). Лиофилизирован-ную культуру разводили 0,1М ацетатным буфером рН 5,0 - 5,2 до оптической плотности 0,3 - 0,32 при длине волны 540 нм в кювете с длиной светового пути 10 мм. Удельную литическую активность выражали в условных единицах на мг белка (Е (уд. акт.), ед./мг белка), приняв в этом случае за единицу литической активности экстракта (элюата) такое его количество, которое вызывало снижение величины исходной оптической плотности раствора на 0,001 за 1 минуту. Определение белка в экстрактах и элюатах. Содержание белка в экстрактах тканей и элюатах исследуемых препаратов определяли по методу Брэдфорда (Досон Р. и др., 1991). К 200ц1 (ІООцІ для микроанализа) исследуемого образца добавляют 2 мл (1 мл) реагента-красителя Кумасси G-250 и хорошо перемешивают.
Не ранее чем через 5 мин, и не позднее, чем через 1 час, измеряют поглощение при 595 нм - относительно чистого реагента-красителя. Концентрацию белка находят по градуировочному графику, построенному с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА). 2. 3. Выделение и очистка лизоцима моллюсков Anodonta cygnea Методика выделения препарата. Процесс выделения лизоцима моллюсков A. cygnea проводился в два этапа: 1. Этап рН обработки, проводимый в целях освобождения от балластных белков: отделенный от тканей супернатант обрабатывали 0ДМ ацетатом аммония рН 4,5, инкубацию проводили при 4С в течении 17 часов, затем раствор центрифугировали при 13000g 10 минут. Осадок отбрасывали. 2. Этап катионообменной хроматографии. Для хроматографии использовали колонку (2,5 х 5 см), заполненную сорбентом карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ - 52) («Reanal»), уравновешенную 0,1М ацето-аммонийным буфером (рН 5,8) и соединенную с перистальтическим насосом со скоростью прбт йШШі Мідкости через колонку 0,1 мл/мин. На колонку наносили 10 мл очищенного экстракта, нейтрализованного до рН 5,8. Колонку промывали 30 мл ОДМ ацетата аммония — для освобождения от сопутствующих несвязавшихся белков. Лизоцим десор- бировали 0,8М ацетатом аммония рН 4,5. Собирали фракции объемом 1 мл (20 - 21 фракция), во всех фракциях определяли лизоцимную активность; для даль нейших исследований отбирали наиболее активные. Методика очистки и концентрирования препарата. Наиболее активные фракции объединяли и подвергали рехроматографии с использованием катио-нообменой хроматографии. Препарат фермента объемом 8 мл наносили на колонку (1,5 х 10 см), заполненную сорбентом Sourse S-30 («Amersham»), уравновешенную 0,02М натрий-фосфатным буфером рН 7,0 и соединенную с перистальтическим насосом со скоростью протекания жидкости через колонку 1 мл/мин. Колонку промывали этим же буфером объемом 24 мл. Лизоцим элюи-ровали линейным градиентом хлорида натрия концентрацией от 0 до ЇМ в 0,02М натрий-фосфатном буфере рН 7,0. Во всех 15-ти фракциях объемом 1 мл определяли лизоцимную активность. Для освобождения от солей проводили диализ собранных фракций в бидистиллированной воде. Десорбция и диализ препарата приводят к существенному разведению фермента, поэтому для его концентрирования и еще более полной очистки от примесей использовали ультрафильтрующие системы Centricon-30 и Centricon-10 фирмьі«Атісоп». 2.4. Электрофоретическое исследование препаратов лизоцима Anodonta cygnea Метод электрофореза в ПААГ.
Для оценки гетерогенности полученного препарата лизоцима и выявления антибактериальной активности фракций препарата непосредственно в геле проводили электрофорез с мочевиной в 5%-ной уксусной кислоте по методу «gel overlay» (Lehrer R.I. et aL, 1991). Гель после завершения электрофореза двукратно промывали в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 15 минут и разрезали на две части. Одну половину окрашивали для выявления локализации белковых фракций, а вторую половину заливали 25 мл 0,8%-ной агарозы, в которую было внесено 20jxl бульонной культуры М. lysodeikticus с оптической плотностью по ФЭК (А.=540 нм) равной 0,15 разведенной в 10 раз. Инкубировали в течение 36 ч. Появление зоны лизиса тест-культуры свидетельствовало о локализации в данном участке геля белковой фракции, обладающей литической активностью. Предварительно для электрофореза по методу Lehrer R.I. et al. (1991) полученный препарат дополнительно очищали и концентрировали на ультрафильтрующих системах Centriplus YM-Ъ («Millipore»). 2.5. Определение численности сапрофитных бактерий Определение общего числа сапрофитных бактерий в воде. Пробы воды отбирались в стерильную стеклянную посуду. Посев производился глубинным способом. На дно чашки Петри помещали 1мл пробы воды соответствующего разведения. Пробу заливали 15 мл агаровой среды (1,5% МПА). Чашки инкубировали в термостате 24 часа при температуре 37С, после чего производили подсчет выросших колоний. Определение видового состава микроорганизмов. Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили до вида, а в некоторых случаях до рода, общепринятыми методами на основании морфологических, тинкто-риальных, культуральных и биохимических свойств. В качестве руководства по идентификации бактерий использовался Определитель бактерий Берджи (Хоулт Дж., 1997). При определении биохимических свойств выделенных микроорганизмов .использовали коммерческие тест-системы фирмы LACHEMA (Чехия): «ENTEROtest» (1 и 2), «NEFERMtest», «STAPHYtest». 2.6. Определение спектра антимикробного действия лизоцима Спектр антибактериальной активности полученного препарата определяли в отношении культур микроорганизмов, список которых приведен в таблице 2.
Характеристика малакофауны как компоненты биологических ресурсов среднего течения реки Урал
Литература, посвященная изучению фауны моллюсков Оренбургского края, весьма ограничена. Как указывает Воронцовский П.А. (1922), к началу века можно отметить лишь две небольшие статьи, посвященные этому вопросу (Linholm, 1903; Воронцовский П.А., 1912). Первая статья - результат обработки 16-ти форм моллюсков, собранных Якобсоном Г.Г. и Шмидтом Р.Г. в 1899 г. -не является глубоким исследованием местной малакофауны. Более детальным оказалось второе исследование, предпринятое в 1911 году Воронцовским П.А., затронувшее реку Урал в районе Оренбурга, озера, болота и луга форштадтских казаков. В ходе него были выявлены многочисленные формы брюхоногих и двустворчатых моллюсков (всего 25 форм), некоторые из них явились редкими для данного района: Pisidium amnicum Mull., Planorbis marginatus Drap., Succina pfeiferi Rossm (Воронцовский П.А., 1912). Через одиннадцать лет П.А. Воронцовским был повторно исследован тот же район. В результате число известных форм моллюсков "из окрестностей Оренбурга" возросло до 37 форм. Исследователь приводит следующие виды двустворчатых моллюсков как типичные для реки Урала: Unio pictorum Linn., Unio tumidus Nils., Unio crassus Lm., а также род Anodonta, в основном представленный в крупных озерах. Воронцовский (1922) отмечает многочисленность сфереид: Sphaerium solidum, Sph. corneum, Sph. draparnandi, Sph. rivicolum {Sphaeriastrum rivicold). Изучение бентоса среднего течения Урала отчасти проводилось Беннин-гом А.Л. (1938), но моллюски не являлись его главным объектом. Последние данные о составе малакофауны изучаемого участка реки относятся к 1974 году. Кононова В.М., Мартынова Е.Г. и Никитина Л.П. приводят список, содержащий 38 видов моллюсков, из них 17 видов двустворчатых, 3 из которых они рассматривают как типичные для среднего течения Урала. По этим данным наиболее распространенными на исследуемом участке были Unio tumidus, Euglesa supina и Shpaeriastrum rivicola. Авторы отмечают Unio pictorum как часто встречающийся, но немногочисленный вид. За истекший почти тридцатилетний период состав малакофауны мог измениться, поэтому нами была предпринята попытка изучения малакофауны среднего течения Урала с целью выявления доминирующих видов двустворчатых моллюсков. На исследуемом участке нами было выделено три основных типа биоценоза, обусловленных особенностями грунта и по-разному заселенных моллюсками: песчаный, галечно-песчаный, илистый.
Большие скопления моллюсков были обнаружены на сильно заиленных песчаных отмелях в прибрежной зоне. Здесь численность двустворок колебалась от 12 до 30 экз/м ; на галечно-песчаном грунте моллюски встречались реже — 1-2 экз/м . В данных биотопах русла Урала присутствовали двустворчатые моллюски семейства Unionidae (рис.3.). Причем, род Unio (Перловицы) был представлен обильнее и качественно и количественно в отличие от рода Anodonta (Беззубки). Постоянно встречались Unio pictorum и Unio tumidus, на некоторых участках присутствовали Unio crassus. Соотношение видов на разных станциях отличалось. Так, в районе "Водозабора" Unio pictorum соседствовали с мелкими формами Anodonta cygnea. Руководящую роль в малакофауне данного биотопа играли моллюски U pictorum (7-10 экз/м ), представители рода Anodonta были немногочислен-ны (2-3 экз/м ). На станции "Ж/д мост" U. pictorum и U tumidus присутствовали в равных соотношениях (10 - 15 экз/м ), кроме названных видов перловиц появлялись U. crassus; беззубки отсутствовали. Ни на одном из участков мы не обнаружили Sphaeriastrum rivicola, многочисленность которых отмечали Во-ронцовский П.А. (1922), Мартынова Е.Г., Никитина Л.П. (1974); в пробах отсутствовали также моллюски Euglesa supina. Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что: - в составе фауны двустворчатых моллюсков среднего течения р. Урал лидируют роды Unio и Anodonta из семейства Unionidae, которые представлены 4-мя видами: Unio pictorum, Unio tumidus, Unio crassus и Anodonta cygnea; - сравнивая результаты исследований малакофауны среднего течения р. Урал за период с 1922 по 1974 год и собственные исследования, прослеживаются дигрессивные сукцессионные изменения, заключающиеся в упрощении структуры биоценоза, вызванного, в частности, обеднением видового разнообразия моллюсков. Об этом свидетельствует установление факта уменьшения видов. Так, если в 1974 году малакофауна в биоресурсах р. Урал была представлена 38 видами моллюсков, из которых 17 видов принадлежали к двустворчатым, то в сегодняшних биоценозах р. Урал обнаружено всего 4 вида двустворчатых моллюсков. Одновременно произошла и смена господствующих видов, что подтверждает закон «экологического дублирования»: наиболее многочисленные виды Euglesa supina u Shpaeriastrum rivicola исчезли, а, встречающийся в то время немногочисленный вид Unio pictorum, стал господствующим. Вопрос о качественном составе чистых и незагрязненных вод всегда был спорным. Разумов А.С. (1962) считает, что в незагрязненных органическими веществами водоемах преобладают кокковые формы. Исследования, проведенные на Неве Родиной А.Г. и Кузьмицкой Н.К. (1968) показали, что преобладающими в составе бактериальных ценозов чистых вод являются мелкие неспороносные палочки и кокки. Они же считают, что наличие в составе бактери-опланктона спороносных, образующих нити бактерий, является одним из признаков загрязнения. Кроме того, исследованиями Кузнецова СИ. (1985) было определено количество сапрофитных водных бактерий по отношению к окраске по Граму. Так, количество грамотрицательных палочек варьирует от 19,3% до 95,5%, грамположительных соответственно от 3,8% до 47,4% и коков от 0,7% до 33,3%. В ходе работ по изучению микробиоценозов реки Урал, проведенных Фа-барисовой Л.Г. (2000) выявлено, что доминирующими формами бактерий р. Урал являются палочки различной величины и морфологии. Размеры клеток колеблются от 1 х 0,4 мкм до 7 х 0,1 мкм (рис. 4). Наиболее распространены короткие палочки размером 1,6 х 0,6 мкм. Кокковая микрофлора в воде р. Урал отмечена в значительно меньшем количестве. Кокки встречаются только в августе, диаметр клеток составляет 0,4 - 0,9 мкм (рис. 4).
Преобладание палочковидных и очень небольшое количество кокковидных форм бактерий свидетельствует о высоком содержании легкодоступного органического вещества и начальных этапах его минерализации. Отличительной особенностью бактериопланктона р. Урал является его высокая агрегированность: бактерии образую микроколонии на дентрите и водорослях (рис. 5). В значительном количестве в бактериопланктоне р. Урал присутствуют нитчатые формы бактерий, особенно многочисленные в июле и августе. Длина нитей составляет от 5 до 14 мкм, толщина 0,2 - 0,4 мкм. Присутствие нитчатых форм свидетельствует о загрязненности воды органическими веществами (Родина А.Г., Кузьмицкая Н.К., 1968; Лаптева Н.А., 1986). Показано также, что особенно широко в микробиоценозах среднего течения р. Урал представлены бактерии родов Caulobacter (Caulobacter subvi-brioides, Caulobacter bacteroides) и Artrobacter (Artrobacter globiformis) (Фаба-рисова Л.Г., 2000). Бактерии этих родов являются типичными представителями автохтонной микрофлоры пресных водоемов. Микрофлора, благодаря короткому жизненному циклу, является наиболее лабильным компонентом экосистемы, чутко и быстро реагирующим на все виды воздействий. Все это делает микроорганизмы хорошими индикаторами состояния экосистемы. По мнению известного микробиолога В.И. Романенко (1979) микробиологическая индикация превосходит по чувствительности многие физические и химические методы, и именно ей принадлежит будущее. Антропогенное воздействие на среду нередко оказывается неблагоприятным. Оно изменяет гидробиологический режим, и в том числе состояние микробиоценозов. Замечено, что под влиянием разного рода антропогенного воздействия происходит повышение концентрации в воде патогенных и условно-патогенных бактерий, пребывающих на стадии сапрофитизма (Булашов Ф.Я., 1974; Мисетов И.А., 1999), что говорит об их аллохтонном происхождении.
Реакция лизоцимной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta на токсическое воздействие ионов свинца и кадмия
Группу тяжелых металлов можно отнести к микроэлементам, в этом ряду одни крайне необходимы для жизнеобеспечения живых организмов, другие вызывают противоположный эффект и, попадая в организм, приводят к его отравлению или гибели. Специалистами по охране окружающей среды среди ме- таллов-токсикантов выделена приоритетная группа, в которую входят кадмий, медь, мышьяк, никель, ртуть, свинец, цинк и хром как опасные для живых организмов; из них ртуть, свинец и кадмий - наиболее токсичны (Небел Б., 1993; «Экологические проблемы Верхней Волги», 2001). Как уже отмечалось, при действии токсических веществ гибель организмов наступает, как правило, не мгновенно. Развитие стресса сопровождается закономерными фазными изменениями ряда физиологических и биохимических показателей организма. Поэтому вопрос биохимической индикации состояния гидробионтов чрезвычайно актуален. К настоящему времени накоплен достаточно большой материал о реакции различных биохимических показателей, а также о чувствительности ферментных систем, на изменения тех или иных условий окружающей среды или на присутствие токсических факторов (Немова Н.Н., Сидоров B.C., 1990; Цветков И.Л., 1997; Ротт Г.М. и др., 1999; Виселина Т.Н., Лукьянова О.Н., 2000; Попов В.В., 2002). В ряде исследований отмечено участие факторов иммунитета гидробионтов в ответных реакциях на антропогенные воздействия (Балабанова Л.В., За-боткина Е.А., 1988; Микряков В.Р., 1990). Известно, что от функционального состояния механизмов иммунитета зависят биологическое постоянство внутренней среды, структурная целостность организма и степень устойчивости гидробионтов к микроорганизмам (Лукьяненко В.И., 1971; Купер Э., 1980; Микряков В.Р., 1977, 1997), причем существенная роль в этом принадлежит лизо-циму. Однако действие лизоцима в организме животных не сводится лишь к защитной функции: имеются данные о том, что лизоцим является именно тем фактором гуморального иммунитета, на котором любые стрессовые воздействия могут отразиться в наибольшей мере (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974). В работах последних лет (Лапирова Т.Б., 2000) было показано, что при воздействии на рыб, токсических факторов, в частности сублетальных концентраций кадмия, меди и ртути, интенсивность образования и активность лизоцима изменяется. Все выше сказанное определило интерес к изучению динамики лизоцим-ной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков видов U. pictorum и A. cygnea при действии различных концентраций ионов свинца и кадмия. В экспериментах использовали концентрации токсикантов соответствующие значениям ПДК, 10 ПДК, 100 ПДК для вод открытых водоемов (Новиков Ю.В., 1990). Опытных животных каждого вида разделяли на 3 группы по 24 особи в каждой.
Первая группа животных служила контролем и содержалась в аквариуме с водопроводной водой, вторая группа — была помещена в аквариум, содержащий ионы свинца, третья группа - ионы кадмия. Ответная реакция моллюсков вида U. pictorum на действие токсикантов Экспозиция двустворчатых моллюсков вида U. pictorum в воде, содержащей ионы свинца и кадмия, даже при концентрации ионов превышающих ПДК в 100 раз, не сопровождалась гибелью организмов. Результаты исследований показали, что в данных условиях эксперимента наблюдаются закономерные фазные изменения лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков (табл.11). Как видно из табл. 11, в контроле активность лизоцима изменялась, было отмечено понижение активности на 8-ые сутки с 3,1 до 1,98 ед./мг белка. Но на протяжении всего остального времени отмечалась тенденция к постепенному повышению активности с 2,8 на 12-ые сутки до 5,95 на 24 сутки. Колебания ли-зоцимной активности у моллюсков, подвергающихся воздействию ионов кадмия и свинца в концентрации на уровне ПДК были сходными. Снижение активности фермента наблюдалось на 3-й сутки после начала эксперимента: ионы свинца снижали активность с 2,47 до 1,36 ед./мг белка, а ионы кадмия - с 2,47 до 1,8 едю/мг белка. Затем наблюдалось постепенное плавное повышение активности с 2,43 до 5,2 и с 2,74 до 5,93 ед./мг белка соответственно (рис. 18). В дальнейшем мы использовали иной методический подход к описанию результатов (Попов В.В., 2002): удельную лизоцимную активность выражали в процентах от контроля, на основании вычисленных данных строились кривые зависимости «доза - эффект» для обоих токсикантов, что наиболее точно отражает особенности реакции ферментных систем тест-объекта на токсическое воздействие. Увеличение концентрации токсикантов приводило к нарушениям в характере ответной реакции. Были отмечены более резкие колебания значений удельной активности (табл. 11). Изменение исследуемого показателя имело вид волнообразной кривой, с тенденцией повышение лизоцимной активности с начала эксперимента сверх нормального уровня на 8-ые сутки с затухающей амплитудой к 24-ым суткам экспозиции (рис.19). При концентрации ионов металлов превышающих ПДК в 100 раз изменение лизоцимной активности жаберной ткани характеризовалось более выраженными фазами снижения и повышения активности (табл. 15), что отличалось от кривой зависимости «доза - эффект» при концентрации токсикантов 10 ПДК, т.к. на 3-й сутки отмечалось снижение лизоцимной активности. Затем происходили волнообразные изменения активности фермента с более выраженным эффектом затухания амплитуды соответствующего показателя (рис. 20). Изменение лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков A. cygnea при концентрации ионов токсикантов превышающих ПДК в 10 раз была сходной с таковой для моллюсков U. pictorum при концентрации ионов превышающих ПДК в 100 раз (рис.22). Это свидетельствует о том, что зависимость «доза - эффект» для каждого вида моллюсков видоспецифична: так, если для моллюсков A. cygnea дозой, дающей эффект оказалось превышение ПДК по металлам в 10 раз, то для вида U. pictorum аналогичный эффект наблюдался при дозе токсиканта, превышающей ПДК в 100 раз, чем вероятно, можно объяснить господствующее положение вида U. pictorum в малакофауне р. Урал. Экспозиция двустворчатых моллюсков вида A. cygnea в среде, содержащей ионы свинца и кадмия в концентрации превышающих ПДК в 100 раз сопровождалось достоверным снижением показателя с последующей гибелью организмов на 16-ые сутки в аквариуме с ионами свинца и на 12-ые - с ионами кадмия (рис. 23), а это указывает на то, что такая концентрация металлов для данного вида моллюсков является летальной.
Развитие «классического» стресса сопровождается закономерными фазными изменениями биохимических показателей организма (Селье Г., 1960; Строганов Н.С., 1979; Вьючинский К.К., Щербаков Ю.А., 1983; Самуилов В.Д., 2000). Динамика большинства биохимических процессов при стрессе проходит три основные закономерные фазы («тревоги», «стимуляции», «депрессии»), описываемые S-образной кривой (Строганов Н.С., 1979). Для всех используемых концентраций тяжелых металлов в наших исследованиях кривая зависимости лизоцимной активности от силы (концентрации) воздействия имеет форму синусоиды, признанную в практике токсикологии в качестве стандартной и имеющую строго теоретическое обоснование с точки зрения биологических процессов адаптации (Бергер В.Я., 1987; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988). Снижение ферментативной активности на начальных этапах интоксикации, что мы наблюдали при действии металлов в концентрации 10 ПДК на моллюсков A. cygnea и концентрации токсикантов 100 ПДК на моллюсков U. picto-гит и A. cygnea, соответствует первой фазе адаптивного ответа организма на стрессовое воздействие, известный как «эффект затаивания». В это время происходит временное подавление взаимосвязанных процессов синтеза ДНК, РНК и белков и падение всех физиологических и биохимических процессов (Clegg I.S., 1994). Приспособительный смысл этого этапа адаптации заключается в попытке путем снижения уровня обмена веществ и, соответственно, контакта животного с внешней средой, уменьшить количество поступающего из вне токсиканта и, таким образом, избежать его повреждающего действия и сохранить биохимический гомеостаз (Бергер В.Я., 1987; Голиков А.Н., Голиков Н.В., 1987).
