Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2.1. 5-липоксигеназа: регуляция активности фермента в клетке и синтез лейкотриеноб 11
2.1.1. 5-Липоксигеназа:реакции 13
2.1.2. 5-LO: структура гена и регуляция экспрессии 14
2.1.3.Факторы, регулирующие активность 5-LO 16
2.1.3.1. Кальций 16
2.1.3.2-АТР 18
2.1.3.3- Фосфсшшиды 19
2.1.3.4 ЛипидЕые гидропсроксиды 20
2.1.3.5. Стимуляция клеточными белками 20
2.1.3.6. 5-1.0-актиБирующий белок (FLAP) 21
2.1.4 Внутриклеточное распределение 5-LO. Роль FLAP 22
2.1.5. Регуляция активности 5-LO в клетки 27
2.1.5.1. Активация 5-LO фосфорилированием 31
2.1.5.2. Эндогенные ингибиторы 5-лилоксигеиазного пути 34
2.1.5.3, Белковые взаимодействия 5-LO 37
2.1.6. Роль лейкотриенов в воспалительных процессах и пути подавления леикотрненового синтеза 39
2.1.6.1, Биологическое действие лейкотриенов 40
2.1.6.2. Направленное генетическое подавление 5-LO 41
2.1.6.3, Ингибиторы биосинтеза лейкотриенов 41
2.1.6.3.1, Ингибиторы FLAP 42
2.1.6.3.2. Прямые ингибиторы 5-LO 44
2.1.6.3.2.1. О кис лите ль но-восстановительные ингибиторы 44
2.1.6.3.2.2. Рс-лигандныс со слабыми окислительно-восстановитс лышми свойствами 44
2.1.6.3.2.3. «Не окислительно-восстановительные» конкурентные ингибиторы 5-LO 45
2.2 Сульфат холестерина: биосинтез и биологическая роль 48
2.2.1. СХ в плазме крови 49
2.2.2. Распределение СХ в тканях 50
2.2.3. Синтез и метаболизм СХ 51
2.2.4. Холестериновые сульфотрансферазы 52
2.2.5.Физиологическая значимость СХ 53
2.2.5.1. Синтез стероидов 53
2.2.5.2. Метаболизм липидов 54
2.2.5.3. Мембранные эффекты СХ 54
2.2.5.4. Участие СХ в регуляции ферментов 55
3. Исследование влияния холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов 5-липоксигеназой клеток млекопитающих 5Й
3.1 Действие холестерина и ею производных на сиптез иродукі ов 5-LO активности в нейтрофилах человека в суспензии и при взаимодействии с различными биологическими поверхностями. 59
3.1.1 Подавление синтеза лейкотриенов свободным холестерином и его производными и PMNL 60
3.1.2. Экзогенная АА нивелирует ингибирующее воздействие X н СХ на синтех лейкотриенов 62
3.1.3. СХ стимулирует адгезию PMNL к коллагену и эндотелию 64
3.1.4. Влияние СХ на доступность субстрата для 5-LO 68
3.1.4.1 СХ препятствует высвобождению АА в PMNL 69
3.1.4.2. СХ вытеспяет cPLA2 ш ядерной мембраны PMNL 70
3.1.5, СХпрспятсівуетіранслиКйцин 5-LO к ядерной мембране PMNL 71
3.1.6, СХ подавляет активность 5-LO в цитозольной фракции PMNL 72
3.1.7, Исследование роли отрицательного заряда эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов. 73
3.1.7.1. Синтез фосфата холестерина (ФХ) 74
3.1.7.2. Сравнение эффективности СХ и ФХ на разных типах клеток 74
3.1.8, Изучение кинетических закономерностей ингибировиния 5-LO иниопиыми производными холестерина 76
3.1.8.1, СХ и ФХ подавляют синтез LTs в суспензионных клетках и клеточных гомогенатах 76
3.1.8.2, Получение кинетических характеристик ингибирования 5-LO под действием ФХ 78
3.1.9 Синтез лийкотриснов зависит oi содержания холестерина в клеточных мембранах 81
3.1.9.1.. Холестерин и СХ оказывают кумулятивное воздействие на синтез лейкотриенов 82
3.1.9.2. Действие MJ3CD 83
3.1.9.2.1. MpCD увеличивает высвобождение А А из состава мембран 83
3.1.9.2.2. Подавление синтеза лейкотриенов под действием СХ снимается при помощи MpCD 84
3.1.9.3. Действие комплекса ПЭГ-холестерин 86
3.2 Эффект СХ чувствителен к ингибиторам эндоцитоза 87
3.3 Влияние эфиров холестерина на экспрессию 5-LO в различных клетках Гипотеза о роли ядерных рецепторов в регуляции экспрессии 5-LO на уровне транскрипции 90
3.3.1. СХ способен подавлять экспрессию 5-LO в PMNL 90
3.3.2. Гипотеза об участии ретиноидных ядерных рецепторов RORrtl в регулировании экспрессии 5-LO 91
4. Эксперименталъная часть 96
4.1.Реактивы и материалы 96
4.2. Методы исследовании. 98
- Сульфат холестерина: биосинтез и биологическая роль
- Экзогенная АА нивелирует ингибирующее воздействие X н СХ на синтех лейкотриенов
- Действие MJ3CD
- Гипотеза об участии ретиноидных ядерных рецепторов RORrtl в регулировании экспрессии 5-LO
Введение к работе
Лейкотриены (LTs) представляют собой группу физиологически актнвпых соединений, иірающих важную роль как в системе защиты организма, так и в развитии воспалительных процессов (рис 1). Установлено, что лейкотриены являются медиаторами таких заболеваний как аллергия, экзема, бронхиальная астма, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, псориаз и другие. Кроме того, лейкотриены используются лейкоцитами в качестве молекул межклеточного взаимодействия и влияния на функцию других клеток. Лейкотриены являются продуктами диоксигеїшромгшя арахидоновой кислоты (АА), В нейтрофилах человека (polymorphonuclear leukocytes, PMNL) ключевым ферментом синтеза лейкотриенов является 5-лшюксигеназа (5-LO, КФ 1.13Л1.34). Основными метаболитами АА в нейтрофилах являются лейкотриен В4 (LTB4) и 5-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (5-НЕТЕ). Как уже упоминалось, лейкотриеиы участвуют Б развитии множества заболеваний воспалительной природы. Так. роль лейко триенов в общей патофизиологии астмы характеризуется участием в развитии бронхоспазма, нарушении проницаемости сосудов, секреции слизи, жизнедеятельное ги воспалительных клеток. Лейкотриеньт являются одними из основных индукторов артритных воспалений, причем к настоящему времени установлена прочная взаимосвязь между воспалительными процессами при артрите различной этиологии и развитием сердечнососудистых заболеваний. Так, при ассоциации ревматоидного артрита с ДИСЛИШ1ДЄМІЇЄЙ. в анамнезе большой части пациентов наблюдается равнее развитие ишемической болезни сердца (ИБС), Один из основных продуктов метаболизма АА -лейкотриен В4 имеет существенное значение в развитии гнойного воспаления, и является мощным хемоаттрактантом.
Учитывая широкий спектр биологического действия лейко три ей ОБ, подробное изучение механизмов регуляции их синтеза является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.
При развитии атеросклероза сшпез лейкотриенов в лейкоцитах может модулироваться холесгерином, огромное значение которого в атерогенезе является общепризнанным- В атеро склеротических бляшках обнаружен также сульфат холестерина (СХ), однако его биологическая роль пока мало изучена. Исследование механизмов реіуляции активности 5-LO под действием холестерина и его эфиров особенно актуально в свете недавнего открытия того, что в атеросклеротических зонах резко повышена экспрессия 5-LO, В этой связи, исследование действия сульфата и других производных холестерина на синтез лейкотриснов представляет несомненный интерес.
Синтез лейкотриееов - процесс, осуществляемый целым набором ферментов и вспомогательных факторов. Информация о наиболее важных участниках синтеза лейкотриенов приводится в таблице 1,
Несмотря на ахшьные изыскания, к настоящему времени больших результатов в лечении воспалительных процессов путем подавления синтеза лейкотриснов или блокации их рецепторов пока не достигнуто. Обнадеживающие данные получены только по немногим областям, таким как лечение некоторых форм астмы, защита тканей сердца от последствий воздействия ионизирующего излучения при лучевой терапии и ряд других. Большинство известных ингибиторов 5-лнпоксигеназьт, хотя и многообещающие in vitro, оказываются неприменимыми in vivo. Чаще всего это происходит из-за высокой токсичности и ряда опасных побочных эффектов Цель работы состояла в изучении эффектов холестерина и его эфиров на активность 5-LO, определении основных закономерностей взаимодействия указанных веществ с этим ферментом и другими участниками метаболического каскада АА.
В данной работе для изучения подавления активности 5-LO и синтеза лейкотриснов были выбраны физиологичные соединения холестерин и єги эфиры. Использование холестерина позволило моделировать условия начальных стадий развития атеросклероза с использованием эндотелиалышх клеток и ттейтрофилов и именно в этих условиях изучать синтез лейкотриенов. Полученные данные выявили важную роль отрицательно заряженных эфиров холестерина в подавлении синтеза ЛЄЙКОТрИеНОБ, Б диссертационной работе впервые показано, что анионные производные холестерина являются регуляторами синтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека. Согласно полученным Б данной работе результатам, СХ действует на синтез лейкотриенов по нескольким механизмам.
СХ иншбировал высвобождение АА, т.е. снижал концентрацию субстрата для синтеза лейкотриенов. Показано; что СХ частично вытеснял cPLA2 из состава ядерных мембран. Кроме того, согласно данным иммуноблоттинга, СХ нншб провал транслокацию и связывание 5-LO с ядерной мембраной PMNL, что снижало активность фермента и синтез лейкотриенов в клетках.
Продемонстрирован прямой ингибирующий эффект сульфата и фосфата холестерина на 5-LO в гомогепатак клеток. На примере фосфата холестерина было показано, что анионные эфиры холестерина являются прямыми ингибиторами 5-LO, подавляющими активность фермента по неконкурентному механизму. Определена константа ингибирования К\ 5-LO фосфатом холестерина, составившая ПО мкМ. Омкрытое в данной работе свойство СХ подавлять синтез лейкотриенов указывает па возможную регуляторную роль сульфотрансфераз и сульфатаз в образовании 5-LO продуктов в организме.
Изучено влияние на синтез лейкотриенов, оказываемое различными агентами. регулирующими содержание холестерина и его эфир о в в клетке. Показано, что холестерин увеличивает ингибнрующий эффект СХ. Б то же время, агенты способные экстрширошть холестерин, такие как мешл-3-никло декстрин (MfSCD), значительно ослабляют ингибируюгцее действие холестерина и СХ, оказвівасмое ими на активность 5-Г.О и синтез лейкотриенов.
Обнаружено, что СХ подавляет экспрессию 5-LO в клетках ММ6, Предложена модель этого процесса, в коюрой экспрессия гена 5-LO контролируется на уровне транскрипции посредством связывания СХ с ретиноидными ядерными рецепторами RORcd.
Полученные в данной работе данные могут быть использованы при разработке новых методов диагностики и терапии воспалительных процессов.
Сульфат холестерина: биосинтез и биологическая роль
В данной работе мы обнаружили действие сульфата (СХ) и других анионных производных холестерина на активность 5-LO, синтез лейкотриенов и внутриклеточную локализаптю 5-1,0 и сРТ.А2. Учитывая, что СХ является природным соединением, в данном разделе необходимо уделить внимание месту этого вещества в организме и клетке, его роли и путям его метаболизма. Отметим, что сульфатированне биологических молекул является метаболическим путем большой значимости. Соединения, содержащие в своем составе сульфатную группу встречаются как среди макромолекул (глихо аминогликаны, секреторные и мембранные белки), так и среди малых внутриклеточных молекул, участников сигнальных каскадов, нейротрансмитгеров и гормонов [140]. Важнейшую роль играет сульфатировапие в метаболизме лекарственных средств и ксенобиотиков. Все эти соединения участвуют во множестве таких процессов как взаимодействие с белками экстраклеточного матрикса, адгезионными рецепторами, функционирование систем свертывания крови, ионный транспорт и многих, других [141], Особую роль сульфатировапие играет в биотрансформации низкомолекулярных внутриклеточных соединений, в том числе ка тех ол аминов, иодотиронинов, витамина С. Точно также, с помощью сульфатировадгия осуществляется модификация кислот желчи, витамина D, стероидов и, наконец, холестерина и его производных. На нем и остановимся подробнее. Хотя сульфатировапие стероидов было открыто еще в конне 1930-х годов, первое сообщение о сульфатной трансформации предшественника всех стероидов - холестерина, появилось гораздо позднее - только в 1964 году [142]. Тогда впервые удалось выделить сульфат холестерина из биологических объектов: адренальных гланд быка, а затем из различных органов и тканей человека. За обнаружением сульфата холестерина последовали попытки определить его биологические пути. Изначально СХ вызывал интерес как субстрат для синтеза сульфатированных стероидов. Только с течением времени СХ стал привлекать внимание как важное само но себе вещество- Особый интерес вызвало открытие, что СХ является регуляторной молекулой. Одной из наиболее изученных на настоящий момент функций СХ является его участие R дифферетлшровке кератиноцитов и развитии эпидерма ль ного барьера.
Теперь, прежде чем обратиться к рассмотрению метаболических путей и биологических функций СХ, необходимо понять, где и в каких количествах он распределен в организме. U .2.1 СХ R плазме крови При первом выделении из плазмы крови человека в 1965 году концентрация СХ была определена как 300 мкг/ЮОмл [ 142]. В более поздних экспериментах, использовавших большое число здоровых донороп, содержание СХ варьировало от 118 до 322 мкг/мл у мужчин и от 117 до 253 мкг мл у женщин [143-146]. В плазме СХ локализован в основном в линопротенннах низкой плотности (ЛПНЩ причем его количество может значительно возрастать при определенных патологиях, таких как цирроз печени, гиперхолестеринемия, гипотироидизм. При рецессивном Х-связанном ихтиозисе содержание СХ в клетках кожл может возрастать более чем на порядок величины [146, 147], Погашение плазматической концентрации СХ сопровождается ростом его концентрации и в стратум корпеум эпидермиса. Интересно, что эт изменения носят весьма специфический характер- Так, например, содержание второго наиболее распространенного сульфатированного стероида, сульфата дегидроэниаидростерона (DHEAS), в этих условиях не изменяется [146? 147]. Вообще, исследования показывают, что метаболические нуги эшх веществ весьма сильно различаются [147]. Существенным различием между ними является и тоэ что содержание DHEAS в организме с возрастом сокращается, в то время как уровень СХ, похоже, не зависит от возраста [143], Наконец, надо отметить, что концентрации СХ в плазме редко увеличивается во время беременности, однако причины и биологический смысл такого явления только исследуются ІЇ.2.2. Распределение СХ в тканях В человеческом организме СХ обнаруживается в крови, тканях, половых клетках, выделениях. Он присутствует в тромбоцитах и красных кровяных тельцах [143, 148, 149]. Среди тканей он наиболее распространен в клетках кожи, ногтей, аорты, надпочечников, печени, почек [150, 151]. В других организмах он также имеется в почках, селезенке, легких и особенно в гонадах. В кожных покровах СХ наиболее распространен в эпидермисе, іде как регуляторная молекула участвует в формировании барьера [152J. Он образуется в базальных и спиновых слоях эпидермиса, достигая наибольшей концентрации в гранулярном слое. Затем его количество постепенно убывает в стратум корне под действием сульфатам [152], Таким образом, холестерин сульфатируется в нижних слоях эпидермиса, затем выводится из клеточного цикла, инициирует процесс дифференцировки кератиноцитов и выводится во внешние слои живых эпидермальных клеток, где всегда находится его максимальная концентрация. Затем он гицролизустся в мертвом слое кожи, стратум корнеум, замыкая таким образом так называемый «эпидермальный цикл СХ» [153], В крови и гаетрошгтестииалыюм эпителии СХ является минорным компонентом и соотношение холестсрии/СХ равно 500:1. В стратум корнеум эта величина составляет 10:1 и даже 5:1. При развитии рецессивного Х-связанного ихтиозиса, который обусловлен дефицитом стероидных сульфатаз, соотношение холестерина и СХ вообще достигает 1:і [154]. Резкое увеличение содержания СХ при рецессивном Х-связашгом ихтиозясе также наблюдается в волосах и ногтях [155], П.2.3. Синтез и метаболизм СХ Целенаправленное определение скоростей образования СХ в организме не проводилось, но есть оценочные данные для двух здоровых доноров, составляющие 35 и 163 мг/день [156], Интересно, что аналогичная величина для DHEAS колеблется в диапазоне 45 мг/депь. Необходимо отметить, что СХ весьма медленно выводится из обращения, вследствие его способности легко связываться с белками плазмы, особенно с альбумином. Считается, что СХ образуется во многих тканях, при этом содержание СХ в различных тканях относительно суммарною уровня синтеза неизвестно.
Тем не менее, принимая во внимание размер кожного покрова и удельное содержание СХ в эпидермисе человеческого организма, можно с полным основанием считать, что основной объем СХ поступает именно из этого источника. СХ присутствует как в моче, так и в фекалиях, что говорит об использовании обоих выделительных путей для вывода его ю органшма. Совместно с биодеградацией в сіратум корнеум (объемы которой, несомненно, велики благодаря размерам кожного покрова) и отшелушиванием они составляют три основных средства для убыли СХ. ІІ.2.4. Холестериновые сульфотрапсферазы Цитозольные сулъфотрансферами (SUM1) составляют суперсемейстяо ферментов, катализирующих присоединение SG "-групп к сравнительно небольшим внутриклеточным молекулам, таким как гормоны, нейротрансмиттеры, ксенобиотики, лекарственные средства. Супер семейство SULT подразделяется на пять семейств, из которых SULT2 вовлечено как раз в процесс сульфоприсоединения к нейтральным стероидам и стеролам. Семейство человеческих SULT2 сосюит из двух подсемейств: SULT2A1 и SULT2B1 [157], В свою очередь, подсемейство SULT2B1 включает в себя две изоформы, называемые SULT2Bla и SULT2Blb. SULT2A1 в основном вовлечена в перенос сульфатной труппы на DHEA, хотя полный список ее субстратов достаточно велик- Интересно- что в экспериментах на печени именно для SULT2A1 была впервые показана способность сульфатировать холестерин. Только позднее было установлено, что SULT2Blb обладает в этом отношении гораздо большей активностью [158]. Субстратом последней изоформы, SUJLT2Bla? чаще всего является прегненолон и в метаболизме холестерина она практически не участвует. Интересно тт, ок иСХ. ЇЇІЦ. ПШЬішже широко гжшрсошруетея в раїдн ішж тканям &оіштеепшнно; наибольшие ко.шталва &ULf2B(b зиРНК обнаружены & тже. простір ттішт, в меньшей етелшш ІЗ желудіж. дачках, літких, ЩШОІШДІЯОЙ железе, тоншії шшке. Вероятно неслучайно, чт именно в ряле эхта оріанов гмшшешй ешлад бьшн обнаружены шіибшшнш ШЛИЧФЄТБЕІ СХ [І 59].
Экзогенная АА нивелирует ингибирующее воздействие X н СХ на синтех лейкотриенов
Добавление АА в&егш # кальциевым шиофором А23 \ %1 іювншет СЛШ Ї 5-1.0 цродуктов- Исследование сшітезп лдаотржт в присутствии ;жзогешюй АЛ выявило емшеш# шдшбируюшаО в шейсгвш X Ш СХ В о&шеть более ІШШІШХ кшцшхр&ций (рис 22). Рік 22 Зашшмоегь количества пролузеюв S-LO активности: от коттпрйщт ОХ. Щтсугхтте жзогснтРі АЛ трсбу г іімее шс&шс котшшр&пий СХ да шкімш&шк ЄЙМІГСТ Интересно, что Еірн увежченш концеїї фїіцнк жзоїшжш АА3 увеличение каішчеаш иродуочдв жгавноеш 5-L0 происходит в ікжшшм за счет 5-ЇІВТЕ. При эгом щщаді Ш} LTB4 л его шшФрой сдается ЇІОСТОЙЇШЬШ (рае 2Э). Сд&ауе? сттмепггь гта Э111 ДШІЇЗШ: бніш шлуашы па ююто ішв лишш RFIL-i (rat ЪшюрЫ1к кикешіа е#Ш 5- поез;ш№у высокие концешралш (60 мкМХ при шсуісгішк и шшубшишдай ср дс белков, токсичны для 1SMNL. Особенностью клеток ЇШЛ шшется m что они не зкеггрессируньт 1ТА4-пщжпщ, Т}занс:формируюііїую 1ЛА4 в LTB4, cfo tOMy наблюдается галько нефд шшшмое прейращешіе IJA4 & томеры L ffi4 i\ практичніш отсутствует СЛШТЇЛ самого ІЛ"В4. что хороню ізидда на реє; 23, И з п]- едетавлешых ш рис, 2.1 ртулт.татов по ШКОШІСНЬШ продуктом метабожша АЛ по -лшкжеш тттаму пут можно сделать выиод; гші с ростом шнщжрацш субстрат вторая стадет превразцешя АА, а именно, транеформшш 5-ИрПТЕ в LTA45 становятся скорость лимитирующей. Это приводит к накоплению 5-ЇІрЕТЕ, котрая, я ешю шередь, претерпевает нефермеш атшшс превращение в 5- IIIJ3, СХ стимулирует адгезию PMNL к коллагену и эндотелию Взаимодействие яигшдов с клеточной мембраной может приводить к штттт тг&жтвых рецептов и прикреплению иейтртфнлон к жтщжжючи. В организма адгезш и активация оейтрефидов ари ЇШИМОЛСЙСТВШ е эндотелием может вызывать дисфункцию эндотелия. Эффект СХ та адгезионные свойства лейтрофилое изучался на поверхностях, покрытых шллагевом, и на МОЙОСЛОС ЗВДОІСШШШШХ клеток, іжіувдшшх из иуиовмйиы с вен чслонеі&ї. Т&юш обрачпіц, были мод шрошны условии неповрежденного сосуда (отщотедай) ш поиреждшиого, когда открывается свободный достухг к экстрэкжточйому штриксу (комагш). СХ увеличивая адгезию дайтрофшюв к коллагену в 3 раны по срашшню с контрольными юіеткаша ([шо 2}. На жшосяое эндотелия СХ дсйстЕОвал еще зффе&тшпес (увсливдвше здтешй в 5 раз). Аді сзноеяьш вчшм&щШстнй бшш еиеішфи шшш и гіодшшіївюь В присутствие шноклона-шйш аігштад к адгезионным рецшторш (дшшьт ж показаны).
Для того ]1ш0ы дшшь, как СХ влияет ш ешпта Lis яри ешшодейегми РЭДМ. с т шагеиом и мдшшшем. мы стимулировали клетки кальциевым шшофоршя А23187 в тех же условиях, при которых исследовали адгезию к коллагену и эндотелию- В отсутствие ионофора СХ не стимулировал синтез LTs. При инкубациях на коллагене СХ подавлял стимулированный ионофором синтез LTs на 75-85%, а в инкубациях с эндотелием-на 81-90% (рис.246). Ранее было показано, что сульфатированные галактоцереброзиды - сульфатиды -ингибирутот синтез лейкотриенов и этот эффект значительно усиливается при взаимодействии нейтрофилов с поверхностями, покрытыми белками экстраклеточного матрикса - коллагеном и фибронектином [183]. Можно было предположить, что отрицательно заряженные лшшды являются специфическими эндогенными регуляторами синтеза LTs в нейтрофилах, и адгезия играет важную роль в такой регуляции. Исследование синтеза лейкотриенов в инкубациях нейтрофилов в суспензии и на коллагеновой подложке или на монослое эндотелия показало, что СХ ингибирует синтез лейкотриенов как в суспензии, так и на подложке. По-видимому, ингибирующее действие СХ сохраняется и в отсутствие адгезионных взаимодействий. Чтобы проверить это предположение более строго, мы провели специальный эксперимент. Известно, что адгезия сопровождается тотальний перестройкой цитоскелета, при которой происходит полимеризация/деполимеризации актина. Блокирование полимеризации/деполимеризации актина приводит и к подавлению адгезии. В нашем эксперименте мы использовали добавление актин-стабилизирующего агента jasplakinolide, ингибирующего адгезионные взаимодействия. Действительно, введение этого агента в инкубации снимало активирующее воздействие СХ на адгезию: в присутствии jasplakinolide адгезия нейтрофилов к коллагену составляла 2 і 0,5 %. Однако, ингибируютций эффект СХ на синтез лейкотриенов целиком сохранялся (рис» 25). Следующим этапом раиогы стало исследование действия СХ на высвобождение АА и на транслокацию 5-LO к ядру, Динамика виутриклеточного кальция не рассматривалась как лимитирующий фактор, поскольку в качестве стимула синтеза лейкотриенов в экспериментах был использован кальциевый ионофор А23187. Ш.І.4. Влияние СХиа доступность субстрата для 5-L0 Доступность субстрата - эффективный и самый простой способ регулирования многих процессов в клетке.
Если при стимуляции нейтрофилов кальциевым ионофором не добавлять экзогенную АА, то источником субстрата будет АА, высвобождаемая из липидных мембран. Если неитрофилы предварительно насытить радиоактивно меченой [4С-АА5 то суммарная метка в пиках АА и продуктов ее превращения будет отражать количество высвободившейся АА. Анализ хроматограмм по радиоактивности показал, что продуктами превращения АА в инкубациях с нейтрофилами были продукты активности 5-LO: 5-НЕТЕ и лейкотриены (рис. 27), промывались сначала 0.1% BSA в PBS, а затем чистым PBS для удаления не связавшейся радиоактивности. Синтез LTs инициировали ионофором А23187. Продукты 5-LO активности и высвобожденная АЛ детектировались по радиоактивное їй, В инкубациях с СХ высвобождение АА и ее дальнейший метаболизм были сильно и концентрациоино-зависимо подавлены (рис, 28). Интересно, что высвобождение 14С-АА ингибировалось как в присутствии, так и в отсутствии экзогенной 20 мкМ АА. На рис, 286 представлена сумма образовавшихся 5-LO продуктов. Клетки также как и в предыдущем случае инкубировались в присутствии С-АА и затем к части из них добавлялась немеченая 20 мкМ АА. Как видно, в присутствии экзогенной АА количество продуктов 5-LO активности зващтсдшо уштчттиш, одшшо штщюш т еояршястся. Тагам обрядам, СХ ооданшет сшггез жшштршмов. уий«ньтз1н Ш.ІИЧЇЗСТВО диступнога да$ 5-1,0 cyGci р&та. Выевобождеше ЛА происходит с участиш различных фосфояимз, Известно, что в ксйтрофшшх эту фувкщю выполняет еРІА2 [72]. Ядсршія локализации ЭТОГО фердані& машется шобходи&шм условием для его феруентатйюой жтт&ст f72. Ш]. В данной работе покаэано, что СХ шхосняст cPLA2 т ядерной мембраны. 1111,4,2. СХтттшт C.P1J2 тжкрпаіїмембраны РИМІ Чтобы пшшгь, кт вжжі СХ яаеРІАЗ, ищ мспозщ л метод тт:упо&.шггтт% прйпериіїк локализацию этого фермент Нштрофилы инкубировались 15 минут при л7 С в присутствии шт в Отсутствие СХ. Сиигез шшщшрошлся 2 мкМ йонофором Л23І87. Клетки яшжр&штсъ м фращишшровашсь на мерную вдм&ршедущ (М) и щтозолшую (С) фракцш и ан&ішшроішшсь методом SDS-PAGE, &жи О ншіутешшх гелш жр&ішшіжсь ш нитроцеялюлоотую мембрану, которая тікубиротаїшсь с антителами к cPLA2, Ироямгат осуществлялось после анкубщш со вторичными ішшшгами, ксщыогмровшныму сч щедочвой фосфатнжй. Таким образец шредеш_юсь в вдериой мамбршпюй и іштозольной фракциях нейтрофищж
Действие MJ3CD
Известно, что холестерин увеличивает жесткость и упругость мембран, повышает их устойчивость к лизису и нарушению целостности. Мы проверили, приводит ли снижение содержания холестерина или СХ в мембранах клетки к повышенному высвобождению АА и активации синтеза лейкотриенов. Нейтрофилы предварительно инкубировались в присутствии радиоактивно меченой С-АА, а затем промывались от не включенной метки. К половине клеток добавляла СХ. После этого в инкубацию вводился MpCD в концентрациях 0; 1 и 2 мМ. Синтез лейкотриенов ионофором А23187 не стимулировался. Анализ продуктов активности 5-LO прободался по УФ-поглощению, детекция не метаболизированной АА осуществлялась по радиоактивности. Результаты такого эксперимента представлены на рис. 40. Видно, что синтез лейкотриенов во всех инкубациях не достигал сколько-нибудь значительной величины. В то же время, введение 1 мМ MfiCD приводило к существенному высвобождению МС-ЛА в контрильных клетках. В клетках, к которым был введен СХ высвобождение АА все еще оставалось подавлено. В случае же 2 мМ MPCD наблюдалось дальнейшее увеличение высвобождения АА как в контрольных клетках, гак и в клетках, инкубировавшихся в присутствии СХ. Данный эксперимент показывает, что MpCD способствует флгощшации мембран и, возможно, активирует Са2+-независимые фосфолипазът, ттто облеггает связанные с ними процессы. Исходя из полученных данных, можно было ожидать, что при активации клеток ионофором А23187 введение в инкубацию JVipCD будет компенсировать ингибирующее действие СХ, оказываемое им на синтез лейкотриенов. Ш.П.2.2. Подавление синтеза лейкотриенов под действием СХ снимается при помощи MfSCD - и, В инкубациях с кальциевым ионофором количество высвобожденной С-АА резко возрастало (рис» 41) по сравнению с экспериментами в отсутствие ионофора A23187 (рис, 40), В этом случае следовало ожидать увеличения синтеза лсйкотриенов в пробах, содержащих СХ при добавлении в них MJ3CD. Действительно, введение в инкубацию M(5CD нивелировало ипгибиругащий эффект СХ и синтез лейкотриепов на 80% восстанавливался уже при концентрации MflCD 1 мМ (рис. 39). Можно предположить два пути, действия MpCD. Во-первых, JTO экстракция X н СХ непосредственно из клеточных мембран.
В этом случае восстановление синтеза лейкотриенов наблюдается за счет флюидизации мембран, увеличения доступности субстрата (АА), и стимуляции связывания 5-LO с ядерной мембраной. Во-вторых, взаимодействие MpCD с СХ возможно непосредственно в среде инкубации. В таком случае понижается действующая концентрация СХ и, соответственно, уменьшается его эффект. Вероятнее всего, на практике реализуются оба описанных механизма. Таким образом, в данной работе было обнаружено, что агенты, увеличивающие жесткость клеточных мембран, такие как X, увеличивают также и ингйбирующий эффект СХ. В то же время, агенты, способствующие флюидизации мембран, такие как MpCD и АА. способны значительно ослаблять ингибирующее действие СХ, оказываемое им на активность 5-LO и синтез лейкотриенов в целом. Сделанные выводы иллюстрирует следующая схема (рис. 42): Видно, что увеличение концентрации комплекса ПЭГ-холестерин не только не уменьшает количество продуктов 5-LO активности, но даже приводит к росту продукции LTB4. Общее количество продуктов активности 5-LO при этом практически не изменяется (данные не показаны). Эти данные позволяют предположить, что R ингибированнп синтеза лейкотриепов под действием холестерина играет роль липидпый обмен с внутренними мембранами клетки, например, мембранами эндоплазма шческої и реіикулума. ПІ П. 4. Эффект СХ чувствителен к ингибиторам эпдоцитоза Можно ли заблокировать перенос холестерина и ето эфиров внутрь клетки? Известно, что везикулярный транспорт чувствителен к амфифилышм аминам, таким как U18666A или хлорпромаэип (CPZ). Мы провели ряд экспериментов чтобы выяснить, окажут ли ингибиторы этого класса какое либо влияние на эффекты СХ. Действительно, эффекты СХ чувствительны к ингибиторам эндотпттоза - цнтохолазину Д (Cyto D) и хлорпромазину. Введение этих веществ в инкубацию нивелировало Эти результаты демонстрирую г, что эффекты СХ зависят от степени его интернэлизации. Известно, что включение холестерина в состав мембран увеличивает упорядоченность их структуры и снижает их проницаемость [193]. Отрицательный заряд эфирной группы СХ влияет на ориентацию положительно заряженных групп фосфатидилхолина и они локализуются ближе к внутренней части мембран из-за электростатического притяжения сульфатных групп СХ [194], Поэтому включение СХ стабилизирует мембраны и понижает ях текучесть и эластичность [195]. Недавно была предложена гипотеза о ключевой роли степени флтоидизаяші клеточных мембран в регугищии активности: 5-LO [181]. Полученные в пошей работе результаты хорошо согласуются с этим предположением. Необходимо отметить также, что изменение биофизических параметров мембран при их модификации СХ также способно оказывать негативное влияние на связывание с ними 5-LO, В результате пониженное содержание 5-LO в ядерной мембранной фракции дри активации клеток иоиофором в присутствии СХ (рис. 30), совместно с затруднением высвобождения АА (рис. 28) приводит к подавлению синтеза лейкотриееов.
Есть данные, что Л А способна сама по себе стимулировать транслокацию 5-LO к ядерной мембране и дальнейшее связывание с ней фермента [196], Такой взгляд объединяет эффекты СХ на дьтсъобождение АА и на связывание 5-LO с ядерной мембраной. Как было показано выше: СХ и ФХ оба проявили существенное ингибирующее воздействие на активацию 5-LO и синтез лейкотриенок в нейтрофилах. Существуют клеточные линии, например, ММб (клетки монощгарпо-макрофагалъной линии), в которых экспрессия белка 5-LO происходит под действием специально добавляемых факторов (витамин D3 и TGF-p). Следующим этапом нашей работы стало исследование влияния анионных производных холестерина на экспрессию 5-LO Б клетках ММб. Ill III L СХподавлет экспрессию 5-Ю в клетках ММ6 Было исследовано влияние СХ на синтез лейкотриенов в ММ6 после роста клеток Б его присутствии. Для этого СХ вводился в ростов среду RPMI-1460 и клетки культивировались обычным образом в течение 4 суток. За это время происходило увеличение клеточной массы ММ6 в 9-Ю раз. Исследования на ММ6 полностью подтвердили ингибирующее воздействие СХ на синтез LTs (рис. 45). Одновременно, методом иммуноблпттинга было покачано, что в клетках, культивировавшихся в среде, содержащей 25 мкг/мл СХ, количество 5-LO оралось значительно меньше, а уровень синтеза LTs - сниженным по сравнению с контрольными клетками, росшими R отсутствие СХ. Отсюда был сделай вывод, что СХ каким-то образом препятствует экспрессии 5-LO в клетках ММ6. Чтобы понять, является ли такое действие СХ универсальным, мы провели аналогичное исследование на клетках RBL-1. Было изучено влияние СХ и ФХ на экспрессию 5-I.O. После четырех дней роста, т.е. при увеличении клеточной массы примерно в 7-8 раз, проводился тест па синтез LTs и на содержание 5-L0. Как и в случае с ММ6, в клетках, культивировавшихся в среде, содержащей эфнры холестерина, уровень синтеза LTs был значительно ниже. Однако, иммуноблоггинг показал, что количество бегпш 5-LO оставалось при этом неизменным (рис. 46). Таким образом, ш шжгк&х, а которых иржутгшует ROR alpha 1. можно ожидать шд&шшіж ксирессміз 5-L0 на уриші# іраїшіфяшш. Кденш ММб жеирсешруют реціяп-ор ROR alpha 1 ІІ шешо в HEX МЫ наблюдали шдавлеішу жгпореат 5-1.0. В то же 0р«я. ідаїхй RBL-1 шшеоы ROR alpha 1 решігорз є з їшх іюдобшжс эффекта СХ/ФХ не шблюд&шсь. Мы р матршшзм ртелыиты этих :жшерішещг Б Кілько как косишоыс цішмрждш&я оашшвдш #шш мяшітяж ршудшш ошіресшл 5-L0 на уровне транезерипщш, Нтатшїшш, дня одиоїшчиога ошега ш ііхот даірос требуется более детальное пселсдошшие.
Гипотеза об участии ретиноидных ядерных рецепторов RORrtl в регулировании экспрессии 5-LO
Таким образом, ш шжгк&х, а которых иржутгшует ROR alpha 1. можно ожидать шд&шшіж ксирессміз 5-L0 на уриші# іраїшіфяшш. Кденш ММб жеирсешруют реціяп-ор ROR alpha 1 ІІ шешо в HEX МЫ наблюдали шдавлеішу жгпореат 5-1.0. В то же 0р«я. ідаїхй RBL-1 шшеоы ROR alpha 1 решігорз є з їшх іюдобшжс эффекта СХ/ФХ не шблюд&шсь. Мы р матршшзм ртелыиты этих :жшерішещг Б Кілько как косишоыс цішмрждш&я оашшвдш #шш мяшітяж ршудшш ошіресшл 5-L0 на уровне транезерипщш, Нтатшїшш, дня одиоїшчиога ошега ш ііхот даірос требуется более детальное пселсдошшие. В евзгш с этим яспбж)Д№0 сжажгь вдешіпжо слов о активаторах рецептора PPARy ш о сжш рецепшре, К настоящему йремшш Б орншігше телпк&а обнаружены 4 шоформы этого рецептора. Бжолопілеекая функции PJ ARy. являющегося фжюром транскрипции, заключается в регуляции таких процессов как пролиферация и дифференциация кератиноцитов, гомеостаз проницаемого эпидермального барьера. Исследования методом торможения в геле показали, что промоторная область (R.GRE) гена PPARy является участком связывания ROR alpha 1 и способна специфически с ним взаимодействовать [199]. Обратно, суперэкспрессия ROR alpha 1 приводит к 40-кратному увеличению активности промотора PPARy. Было показано, что агописты PPARy могут активировать ROR alpha 1 [199]- Суммируя описанные результаты, еще немногочисленные, следует отметить, что ROR aJpha 1 можно рассматривать как часть многофакторного механизма, контролирующего экспрессию PPARy. Одновременно, как было показано недавно, активаторы PPARy стимулируют экспрессию и увеличивают ферментативную активность сульфотрансферазы SULT2Blb в культивируемых кератшгоцитах человека [160]. Этот эффект, оказываемый на экспрессию гена на уровне транскрипции, весьма значителен. Под воздействием такого активатора PPARy как циглитазон, количество гаРНК SUI,T2Blb увеличивалось более чем в 26 раз. Наибольший эффект на экспрессию и ферментативную активность SULT2Blb оказывал циглитазон [160]. Этот результат, важный для нас уже сам по себе, становится особенно интересным, поскольку есть свидетельства, показывающие взаимосвязь и взаимодействие метаболических нуіей АА и PPARy. Ранее уже сообщалось о понижении жизнеспособности опухолевых клеток при б л окапи и в них 5-липоксигеназпого пути метаболизма АА [200], Так, ингибитор FLAP MK8S6, являющийся активатором экспрессии PPARy, эффективно подавлял клеточный рост я индуцировал развитие апоптоза в клетках рака молочной железы.
Интересно, что ингибиторы циклооксигеназного пути метаболизма АА не оказывали никакого действия в подобных экспериментах [200]. Авторами предложена методика подавления роста клеток рака легкого под действием малых диз MK8S6, циглитазона и 13-цис-ретиноевой кислоты [200]. Б данной работе впервые показано влияние активаторов PPARy па синтез лейкотриенов в PMNL при адгезии к поверхности, покрытой коллагеном (табл. 4), В экспериментах были использованы как селективные активаторы PPARa (Wy-14,643), PPARy (циглитазоп и троглитазоп). так и неселективный активатор семейства PPAR (безафибрат). Все перечисленные агенты были взяты в концентрации 10 мкМ. Как видно из результатов исследования, подавление синтеза лейкотриенов осуществлялось только под действием селективных активаторов PPARy - тшглитазона и троглитазопа. Вместе с тем, циглитазоп ОДНІЇ из всех использовавшихся агентов снижал ТЫГ-стимз тированнуш адгезию к коллагену. Таким образом, открывается потенциальная возможность посредством активации PPARy И ROR alpha 1 влиять на внутриклеточные уровни, активность SULT2Blb и количество СХ. В то же время, можно использовать взаимодействие СХ с ROR alpha 1 для подавления экспрессии 5-LO там, где это возможно. Подавление экспрессии 5-1,0 может быть актуальным в терапии как воспалительных, так и некоторых онкологических процессов. Конечно, эта оптимистическая стратегия неизбежно столкнется со многими трудностями, однако, попытка реализовать ее в будущем R ТОМ ИЛИ ИНОМ виде, несомненно, представляет интерес. Эндогенная регуляция под действием СХ, по-видимому, происходит во взаимодействии нейтрофилов с тромбоцитами. Известно, что СХ содержится в тромбоцитах крови [148]. В этих клетках экспрессируется сульфотрансфераза SULT2Bib и количество СХ достигает 566 пкмоль па \09 тромбоцитов. Введение донора сульфатной группы я реакциях сульфотрансфераз (PAPS), может приводить к 300-кратпому увеличению содержания СХ [201]. Показано, что при добавлении к PMNL физиологических количеств тромбоцитов, сиитез лейкотриенов в PMNL адгезионно-зависимо подавлялся [202]. После дегрануляции под действием тромбина, тромбоциты теряли эту ингибирующую активность [203]. Можно предположить, что тромбоциты способны предоставлять свой СХ нейтрофилам при аді\:зии и подавление синтеза лейкотриенов является следствием такого липидного обмена. Суммируя представленные результаты, можно сказать, что наши исследовании позволили обнаружить эффективные ингибиторы синтеза лейкотриснов, действующие на него с неско.тьких направлений.
Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем при разработке терапевтических подходов к лечению воспалительных процессов с помощью реіуляиии уровни холестерина и его конверсии в анионные производные. Реактивы: NaCl, КС1, MgCl2, СаС12 (Merck, Германия, или ОСЧ, Россия); EDTA, Tris-HCL, Tris-base, (NH4)2S20B (Fluka, Швейцария); акриламид, N.N -мєтиленбисакриламид (Serva, Германия); додецилсульфат натрия (SDS), дитиотреитол (DTT), КК№,№-тетра-метилэтилендиамин (TEMED), бромфеполошй сшшй (Iteanal, Венгрия); метанол, Tween 20, диметилформамид (DMF), HEPES (Fluka, Германия); раствор Ficoll-Paqne (Pharmacia, Швеция); кальциевый ионофор А23187, концентрат раствора Хэнкса (HBSS), NBT (nitroblue tetrazolium): BciP (5-bromo-4-ch]oro-3-indolylphosphate), PMSF (Sigma, ] ермания), моноклинальные антитела к 5-LO (Transduction Laboratories, США), вторичные антитела к мышиной сыворотке (IgG? коньюгированные с щелочной фосфатазой), фосфатидилхолин (лецитин), сульфат холестерина (Sigma, США); холестерин сульфат холестерина (Sigma, Германия); бычий сывороточный альбумин (BSA) (Calbiochem, США); коллаген (Sigma, Германия); хлорпромазин (Sigma, Германия); цитохолазин Д (Fluka, Швейцария); метил-р-циклодексірин (Sigma, Германия). Буферные растворы: Раствор Хэнкса (HBSS): 0.14 г/л СаС12, 0,4 г/л КС1, 0.06 г/л КН2Р04, 0.098 г/л MgS04, 8 г/л NaCl, 0.048 г/л Na2HP04, 1 г/л глюкозы, рН 7.4. Буфер PBS: 0.144 г/л КП2Р04, 9 г/л NaCl, 0.795 г/л Na2HP04x7H20, рН 7.4. Didbecco s PBS содержит помимо указанных солей 1 г/л глюкозы и 0.098 г/л MgS04,pH7.4. Буфер TBS: 50 мМ Tris-HCl, рН 7.4,100 мМ NaCl. Буфер КРВ-1: 50 мМ КН2Р04, 100 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ DTT. Буфер содержит следующие ингибиторы иротеииаз: 1 мМ PMSF, 2 мМ DFP (диизопропилфторфосфат), 10 цг/мл аоротинина и 10 цг/мл леупептина. DTT и ингибиторы добавляли непосредственно перед использованием. Буфер для нанесения на гель: 50 мМ Tris-HCl, -0,01 % бромфенолового синего, 50 мМ Р-меркаптоэтанола, 1% SDS, 10 % глицерина, рН 7.0. Буфер для переноса па мембрану: 25 тМ Tris-base, 192 іпМ глицина, 20% метанола. Буфер для блокирования иеспецифической сорбции: 50 г/л сухого обезжиренного молока, 0.1 % Tween-20, 50 г/л BSA, 0.144 г/л КН2Р04, 9 г/л NaCl, 0.795 г/л Na2IIP04x7TI20: рП 7Л (PBS). Ду#яр для детекции: 100 мМ Tris-Ъаяе. рП 8.25,100 мМШСІ, 50 мМ MgCL Субстратный буфер: 100 мМ Tris-base, рН 8.25, 100 мМ NaCI, 50 мМ MgCl2, 0.33 г/л NBT (раствор ь 70 % DMF), 1.7 г/л ВсіР (раствор в 100 % DMF). Подготовка рабочих препаратов: Были использованы запасные растворы сухих веществ в растворителях, указанных производителями. Сульфат и фосфат холестерина применялись в виде растворов в смеси EtOH/DMSO:l/3. При приготовлении указанных растворов сначала производилось суспепдировапие эфиров холестерина в ЕЮН, а затем добавлялся DMSO. Синтез фосфата холестерина Для синтеза фосфата холестерина в качестве исходного соединения использовался свободный холестерин, в качестве фосфорилируюшего агента -РОСІз- Реакцию проводили ъ абсолютном пиридине при комнатной температуре в течение 12 ч.
