Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время значительное внимание
уделяется поиску в растениях органических веществ, обладающих
биологической активностью, при этом основной упор делается на
соединения, проявляющие бактерицидную или фунгицидную активность.
Среди таких соединений наиболее представлены различные полифенолы,
фенольные гликозиды, сапонины, ненасыщенные лактоны, диены, пигменты,
а также белки и пептиды. Кроме того, остается открытым вопрос о
возможности их применения в защите культурных растений от болезней,
поскольку все они являются низкомолекулярными вторичными
метаболитами, и внедрение их в будущем может привести всего лишь к
замещению используемых в настоящее время пестицидов на аналогичные.
На этом фоне наиболее актуальными становятся проблемы поиска и изучения защитных пептидов растений, к которым относят антимикробные пептиды (АМП) и ингибиторы гидролаз насекомых. Эти молекулы, являясь компонентами иммунитета растений, способны действовать против патогенов в достаточно низких концентрациях, что часто коррелирует с их небольшим содержанием в растениях. Подобные пептиды могут образовывать семейства гомологичных молекул.
Важным направлением исследований в данной области является изучение АМП, выделенных из культурных и дикорастущих (в том числе сорных) растений с использованием методов протеомики и геномики. В настоящее время считается, что относительная степень устойчивости дикорастущих растений к фитопатогенам обусловлена наличием АМП со специфическими структурами, которые могут действовать как индивидуально, так и в комплексе. Молекулярные и клеточные механизмы действия АМП растений также являются предметом активного изучения (Fant et al., 2000; van der Weerden et al, 2008; 2010; Lay et al, 2012).
АМП с широким спектром активности являются ключевыми факторами, обеспечивающими реализацию иммунной системы растений. Эти молекулы способны активно действовать в ответ на внедрение патогенного
микроорганизма в растение. Семена являются богатым источником различных пептидов, в том числе антимикробных. АМП растений представляют особый большой интерес для создания устойчивых к патогенам форм растений, поскольку их гены могут быть непосредственно встроены в геном с использованием методов генетической трансформации. Помимо этого, АМП рассматриваются в качестве альтернативы используемым пестицидам, что в перспективе может позволить сократить количество обработок агрохимикатами. Кроме того, применение таких соединений может способствовать активному подавлению патогенных организмов, обладающих резистентностью к используемым химическим средствам защиты растений.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выделении и структурно-функциональном исследовании ряда новых антимикробных пептидов семян ежовника {Echinochloa crus-galli).
В процессе данной работы были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Оптимизировать метод выделения АМП из семян ежовника.
-
Выделить и установить структуры новых антимикробных пептидов семян ежовника.
3. Проверить наличие антимикробной активности выделенных
соединений.
4. Изучить взаимодействие АМП семян ежовника с фитопатогенным
микроорганизмом на клеточном уровне.
Научная новизна. Предложен метод выделения антимикробных пептидов из семян ежовника, сочетающий их кислотную экстракцию с последующим фракционированием методами жидкостной хроматографии. Впервые из семян растения семейства Злаковые выделены дефензины, обладающие антифунгальной активностью на широкий спектр видов фитопатогенов, определены их полные первичные структуры. Показано, что
единственная замена Ala на His в С-концевом фрагменте молекулы дефензина достоверно приводит к снижению антифунгальной активности. Из семян ежовника выделен новый пептид с уникальным расположением остатков цистеина, обладающий антифунгальной активностью широкого спектра. Для полученного пептида установлена пространственная структура, представляющая собой новый тип укладки полипептидной цепи растительных антимикробных пептидов. Изучено взаимодействие пептида с фитопатогенным грибом на клеточном уровне и показано, что данная молекула обладает фунгистатическим действием и способна связываться с оболочкой спор гриба с последующей интернализацией в цитоплазму без нарушения целостности плазматической мембраны.
Практическая значимость. Выделенные в данной работе АМП семян ежовника могут быть использованы в для получения генетических конструкций с целью создания культурных растений с трансформированным геномом, обладающих повышенной устойчивостью к грибным фитопатогенам.
Апробация работы и публикации. Результаты данной работы представлены на VIII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2008), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), V Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009), XIV школе-
конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, 2011). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 машинописных страницах, состоит из введения, частей "Литературный обзор", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", выводов, библиографического списка, состоящего из 310 источников, из которых 302 - на иностранном языке. Работа включает 16 рисунков и 2 таблицы.
