Введение к работе
Актуальность исследования:
Механизмы врожденного иммунитета представляют первую
филогенетически наиболее древнюю линию защиты организма от различных патогенов. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы.
В течение последнего десятилетия активно изучаются биология, структура и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета - противомикробных пептидов (ПМП).
ПМП представляют собой обширную группу небольших катионных белков, способных поражать различные микроорганизмы, среди которых вирусы, бактерии, грибы и простейшие.
Противомикробные пептиды, являясь естественными эндогенными антибиотиками, осуществляют функцию так называемого мгновенного иммунитета - «instant immunity». С другой стороны они являются сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы регуляции и активации клеток иммунной системы и репарации тканей. ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций.
Полифункциональность ПМП в значительной степени определяет эффективность иммунных процессов, протекающих при воспалении, урогенитальных инфекциях (УГИ), септическом шоке и др.
В настоящее время урогенитальная инфекция рассматривается как одна из основных причин развития хронических простатитов, бесплодия, патологии беременности, таких как внутриутробное инфицирование плода, невынашивание, неразвивающаяся беременность и др. Однако остается неясным, почему одни и те же инфекционные агенты в одних случаях
вызывают реализацию внутриутробной инфекции и преждевременные роды, а в других - практически не влияют на течение беременности. Это вызывает необходимость поиска новых подходов к изучению роли механизмов врожденного иммунитета при урогенитальной инфекции, разработки новых диагностических критериев.
Исследование экспрессии Р-дефенсинов клетками слизистой урогенитального тракта и а-дефенсинов в плазме и в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых доноров, больных с патологиями инфекционного генеза (урогенитальные инфекции, внутриутробное инфицирование, хронический простатит и другие) представляется актуальным так, как дает возможность понять роль противомикробных пептидов в защите репродуктивной системы от воздействия различных патогенов, широко представленных в урогенитальном тракте. Анализ дефенсинов на уровне экспрессии генов и синтеза белка позволит понять механизм нарушений в системе противомикробной защиты при урогенитальной инфекции, сепсисе, а также определить возможные маркеры прогноза течения данных заболеваний и эффективности проводимого лечения.
Цель работы: комплексное исследование противомикробных пептидов (дефенсинов) в биологических средах организма в норме и при инфекциях.
Задачи исследования:
Разработать лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1.
Определить уровень экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой урогенитального тракта мужчин и женщин в норме и при урогенитальной инфекции.
Оценить экспрессию HBD-1 в слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с урогенитальной инфекцией.
Определить уровень нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови здоровых женщин и при патологии беременности инфекционного генеза.
Исследовать динамику экспрессии гена и выработки пептида (а-дефенсина HNP-1) нейтрофилами периферической крови беременных с урогенитальной инфекцией и у больных сепсисом в сравнении с группой здоровых доноров.
Научная новизна работы
Разработан комплексный подход к оценке противомикробных пептидов у человека, основанный на изучении ПМП в различных средах организма. Анализ а-дефенсинов проведен на уровне экспрессии гена и синтеза молекулы пептида.
С помощью разработанных систем ПЦР в реальном времени исследован количественный уровень экспрессии генов Р-дефенсина 1 (HBD-1) и а-дефенсина 1 (HNP-1) у здоровых доноров и пациентов с урогенитальной инфекцией. Особую значимость представляют полученные данные об экспрессии генов ПМП в слизистой цервикального канала и в нейтро филах крови при физиологически развивающейся беременности и при патологии беременности инфекционного генеза (внутриутробное инфицирование, неразвивающаяся беременность). При реализации внутриутробной инфекции наблюдается снижение экспрессии HBD-1 в клетках слизистой цервикального, что свидетельствует о нарушении противомикробной защиты слизистой репродуктивного тракта. Снижение концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови при неразвивающейся беременности может служить маркером для ранней диагностики данной патологии.
Определена роль противомикробных пептидов в развитии
иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе
данных о снижении уровня экспрессии гена Р-дефенсина - HBD-1 в эпителиальных клетках уретры и снижения концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в секрете простаты.
Получены новые данные о нарушении экспрессии HNP-1 в нейтрофилах больных сепсисом. Высокий уровень экспрессии гена HNP-1 сопровождается резким снижением выработки этого пептида.
Практическая значимость работы
Выявленные изменения в экспрессии и продукции ПМП у больных УГИ помогают уточнить патогенез данной патологии, а при беременности могут служить прогностическими маркерами течения беременности.
Положения, выносимые на защиту:
Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1 и гена «домашнего хозяйства» - Р-актина.
С использованием разработанных систем были получены данные, свидетельствующие о том, что слизистая урогенитального тракта в норме защищена противомикробными пептидами. При урогенитальной инфекции происходит уменьшение экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой уретры и цервикального канала.
Физиологическое течение беременности сопровождается активацией системы противомикробных пептидов, что проявляется в увеличении экспрессии гена НЕЮ-1 в слизистой цервикального канала и концентрации HNP1-3 в периферической крови.
Разработанные тест-системы позволили выявить нарушения в системе противомикробных пептидов: на уровне экспрессии гена HNP-1 и
выработки молекулы данного пептида при урогенитальной инфекции и сепсисе.
Внедрение результатов исследования
Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов противомикробных пептидов ( Р" дефенсина 1 (HBD-1) и а-дефенсина 1 (HNP-1).
С использованием разработанных систем определены маркеры развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования.
Получено положительное решение по заявке №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов»
Результаты исследования используются в практической работе родильного отделения ГКБ№8 и родильного дома №10 г. Москвы.
Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр иммунологии и акушерства и гинекологии РГМУ.
Апробация.
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции кафедры иммунологии, отдела иммунологии и кафедры эндокринологии лечебного факультета ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава» от 24 июня 2010 года.
Материалы диссертации представлены на II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2007; Конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 2007; XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 6-10 апреля 2009 г.; III Международном конгрессе по репродуктивной медицине, 2009г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 статей в центральной печати и патент №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов» Структура и объем диссертационной работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 93 отечественных и 124 зарубежных источников. Работа выполнена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 37 рисунками.
