Введение к работе
Актуальность проблемы. За прошедшее десятилетие сильно увеличился объем работ в области синтеза модифицированных аналогов олигонуклеотидов как в целях применения их в качестве потенциальных терапевтических средств^ для антисенс- и антиген-терапии, так и в молекулярно-биологических исследованиях. В сфере применения производных олигонуклеотидов для терапии вирусных заболеваний, злокачественных опухолей и др. болезней, связанных с изменениями генома, в последнее время наметился переход от исследований in vitro к непосредственно клиническому применению первых представителей этого класса - фосфоротиоатов. Развивается также комбинаториальный подход к синтезу высокоспецифических лигандов на основе синтетических олигодезокси- и рибонуклеотидов (т.н. аптамеры). Однако, несмотря на множество описанных модификаций структуры, остается весьма актуальной разработка новых аналогов олигонуклеотидов, обладающих набором требуемых свойств, как то: повышенная прочность связывания с комплементарной последовательностью при высокой специфичности, определяемой Уотсон-Криковскими взаимодействиями, устойчивость к спонтанной и ферментативной деградации, способность проникать через клеточную мембрану, низкая общая токсичность при доминировании сиквенс-специфической активности и т.д. Широкое использование обширного арсенала современного органического синтеза позволяет получать все более сложные и отдаленные структурные модели нуклеозидов, содержащие разнообразные заместители и гетероатомы, сильно расширяющие возможности межмолекулярного узнавания лиганда и мишени. Тем не менее, до сих пор можно говорить лишь об ограниченном соответствии существующих аналогов, в том числе переданных уже для клинических испытаний, перечисленным требованиям.
Замена природной фосфодиэфирной связи различными группировками, в частности, амидной связью различной пространственной ориентации, привела к получению электронейтральных полиамидных аналогов олигонуклеотидов. Одним из интереснейших представителей этого нового класса соединений, напоминающих природные пептиды, являются "пептидные нуклеиновые кислоты" или PNA, предложенные в 1991 г. группой П.Э.Нильсена (Дания). Природа PNA позволила широко использовать для их синтеза традиционные методы химии пептидов, что наряду с интересными свойствами этих соединений сделало их весьма перспективным средством для решения задач физико-химической биологии нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы явилась разработка эффективного метода синтеза как собственно полиамидных аналогов олигонуклеотидов (PNA), так и их конъюгатов с олигодезоксирибонуклеотидами. Такой метод должен отвечать требованиям твердофазного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов и включать эффективные способы получения защищенных мономеров для последующего наращивания цепи PNA твердофазным способом с использованием соответствующего полимерного носителя, что позволяет использовать автоматический синтезатор.
Научная новизна и практическая значимость. Разработан общий метод твердофазного синтеза полиамидных аналогов нуклеиновых кислот, полностью совместимый с условиями олигодезоксирибонуклеотидного синтеза и позволяющий получать олигомеры PNA, их аналоги и производные, в том числе конъюгаты с олигодезоксирибонуклеотидами, содержащие ДНКовую часть со свободной З'-гидроксильной группой, до последнего времени не описанные в литературе, путем последовательного твердофазного олигонуклеотияного и пептидного синтеза на одном полимерном носителе с одновременным деблокированием. Показано, что полученные таким' методом "химерные" олигомеры могут участвовать в ферментативных реакциях, характерных как для полиамидного, так и олигонуклеотияного фрагментов, что открывает перспективы их использования как новых инструментов молекулярно-биологических исследований (сильносвязываюшиеся праймеры для ПЦР, нерадиоактивно меченные зонды для картирования ДНК методом сканирующей электронной микроскопии и т.д.). Разработано семейство полимерных носителей для твердофазного органического синтеза на основе коммерчески доступного хроматографического сорбента TSK Gei Toyopearl, пригодных для эффективного синтеза как полиамидов, так и олигодезоксирибонуклеотидов. Предложен ряд новых реагентов для активации карбоновых кислот в синтезе амидов и сложных эфиров на основе аренсульфонатов, фосфониевых и иминиевых солей. Некоторые из предложенных реагентов могут найти применение в синтезе пептидов, в особенности содержащих остатки пространственно затрудненных аминокислот, входящих в состав природных антибиотиков полипептидной структуры из семейства пептаиболов. Предложен также новый тип активированных эфиров карбоновых кислот - производных
доступного //-гидрокси-3,4,5,6-тетрахлорфталимида - для быстрой пептидной
конденсации в мягких условиях
Полученные при выполнении данной работы результаты были использованы при проведении различных исследований, выполняемых в лаборатории структуры и функций генов человека ИБХ РАН и лаборатории биофизики ИМГ РАН.
Апробация работы. Результаты работы были опубликованы в четырех печатных работах, еще одна готовится к печати. По итогам работы был подготовлен стендовый доклад на III Международном симпозиуме по биоорганической химии 17-23 сентября 1995 г. в Дагомысе (Россия).
Объем работы и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах печатного текста, включая 10 рисунков, 47 схем, 5 таблиц и список цитируемой литературы из 276 наименований, и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальная часть (материалы и методы), выводы, список литературы.
Конкретный личный вклад диссертанта. Экспериментальные результаты получены лично автором либо при его непосредственном участии. Начальный этап работы был выполнен совместно с к.х.н. С. В. Веселовской, продолжение работы - совместно с Е. Н. Лубяко. Молекулярно-биологические эксперименты были проведены к.б.н. Т. Л. Ажпкиной, при этом автор принимал участие в постановке задачи, а также в обсуждении и интерпретации результатов.
