Содержание к диссертации
Введение
I. Синтез аналогов пиримидиновых нуклеозидов со связью C-N в З'-положении . 7
1. Синтез З'-азидо- и З'-аминоаналогов пиримидиновых нуклеозидов. 7
1.1. Азидоаналоги. 7
1.2. Аминоаналоги. 15
2. Синтез З'-алкиламиноаналогов пиримидиновых нуклеозидов. 26
2.1. Алкиламиноаналоги тимидина. 26
2.2. Алкиламиноаналоги уридина. 29
3. Синтез З'-ІМ-ацильньїх аналогов пиримидиновых нуклеозидов . 35
4. Синтез З'-сульфамидных аналогов тимидина. 39
5. Синтез З'-изоциано-З'-дезокситимидина. 40
6. Синтез аналогов тимидина, несущих по З'-положению электрофильные группы. 42
7. Синтез производных пиримидиновых нуклеозидов, содержащих по З'-положению гетероциклы . 45
8. Синтез З'-гидроксиламинопроизводных пиримидиновых нуклеозидов. 54
9. Синтез З'-нитроаналогов тимидина. 59
10. Прочие аналоги пиримидиновых нуклеозидов со связью C-N в З'-положении. 63
10.1. Синтез З'-уреидных аналогов тимидина. 63
10.2. Синтез аналогов уридина с гидразильной и гуанидиновой группами. 64
10.3. Синтез З'-фосфорамидатного аналога цитидина. 64
11. Синтез цитидиновых аналогов из производных уридина. 66
II. Биологическая активность пиримидиновых нуклеозидов со связью C-N в З'-положении . 70
1. Биологическая активность З'-амино- и З'-азидоаналогов пиримидиновых нуклеозидов. 70
2. Биологическая активность З'-алкиламиноаналогов пиримидиновых нуклеозидов. 74
3. Биологическая активность 3'-!\1-ацильных аналогов пиримидиновых нуклеозидов. 76
4. Биологическая активность З'-сульфамидоаналогов тимидина. 77
5. Биологическая активность аналогов тимидина с электрофильными группами в З'-положении 77
6. Биологическая активность пиримидиновых нуклеозидов, содержащих по З'-положению гетероциклический заместитель . 79
7. Биологическая активность З'-гидроксиламино- и З'-нитроаналогов пиримидиновых нуклеозидов. 82
Результаты работы и их обсуждение 87
Введение. 87
1. Эффективный синтез З'-амино-З'-дезокситимидина. 90
2. Синтез 3'-1Ч-алкильных производных З'-амино-З'-дезокситимидина. 93
3. Синтез 3'-1М-ацильных производных З'-амино-З'-дезокситимидина. 98
4. Синтез З'-изотиоциано-З'-дезокситимидина и его производных. 104
5. Синтез З'-уреидных и З'-тиоуреидных производных З'-амино-З'-дезокситимидина. 107
6. Синтез З'-М-нитрозопроизводного З'-амино-З'-дезокситимидина. 111
7. Синтез производного З'-амино-З'-дезокситимидина, содержащего гидразидную функцию по 3'- положению . 114
Экспериментальная часть 118
Выводы 133
Список литературы 134
Благодарности 146
- Синтез З'-ІМ-ацильньїх аналогов пиримидиновых нуклеозидов
- Синтез производных пиримидиновых нуклеозидов, содержащих по З'-положению гетероциклы
- Биологическая активность пиримидиновых нуклеозидов, содержащих по З'-положению гетероциклический заместитель
- Синтез производного З'-амино-З'-дезокситимидина, содержащего гидразидную функцию по 3'- положению
Введение к работе
Сегодня весьма остро стоят проблемы борьбы с многочисленными вирусными и онкологическими заболеваниями. Основным направлением в решении этих проблем является поиск высокоэффективных биологически активных агентов среди соединений различных классов. В ряду этих соединений важное место занимают нуклеозид-ные аналоги различной структуры. В настоящее время синтезировано и изучено большое число разнообразных нуклеозидных аналогов, некоторые из которых уже используются в качестве лекарственных препаратов, направленных на борьбу с различными вирусами или тормозящих развитие разных форм злокачественных новообразований. К таким нуклеозидам относятся, например, З -азидо-З -дезокси-тимидин (ретровир, АЗТ), 2 ,3 -дидезокси-3 -тио-1-рибоцитозин (ламивудин), которые давно применяются для лечения СПИДа как ингибиторы RT HIV, 1-N-(pn6o-фуранозил-1-ил)-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (рибавирин), который обладает широким спектром противовирусной активности, арабиноцитозин (цитарабин), который применяется при лечении лейкемии, и многие другие. К сожалению, лечение подобными препаратами сопряжено часто с рядом побочных эффектов, которые ограничивают их применение. Например, длительное лечение ретровиром вызывает угнетение деятельности костного мозга, приводящее к анемии, а также оказывает отрицательное воздействие на печень. Подобные побочные эффекты являются следствием недостаточной для эффективного лечения селективности действия этих препаратов. Другой проблемой при использовании противовирусных агентов является развитие вирусной резистентности, которая может полностью подавить лечебный эффект активного соединения. Среди противоопухолевых препаратов проблема селективности также является очень актуальной. Хорошо известно, что проведение курсов химиотерапии до сих пор может быть сопряжено с рядом тяжелых побочных эффектов, обусловленных именно низкой селективностью цитотоксического действия препаратов. Несмотря на все эти недостатки, во многих случаях нуклеозидные аналоги являются очень эффективными. С другой стороны, структура нуклеозида позволяет проводить множество различных модификаций, тонко варьировать биологическую активность соединения и, таким образом, решать многие проблемы, обнаруживаемые при применении нуклеозидных препаратов. Все это делает поиск новых эффективных биологически активных соединений в ряду нуклеозидных аналогов и разработку новых подходов к их синтезу актуальной задачей и перспективным направлением научных исследований.
Синтез З'-ІМ-ацильньїх аналогов пиримидиновых нуклеозидов
Hummel и Carty [19] повторили этот эксперимент, используя только 2 эквивалента NH4N3. Они выделили не только З -азидоарабинопродукт (33а), но и его 2 -ксилоизомер (ЗЗЬ). Если же поменять растворитель на ДМФА, то реакция будет протекать независимо о количества азидирующего агента с образованием смеси 3 - и 2 -региоизомеров в соотношении 3,6:1. Perlman et al. [16] повторили эти эксперименты и объяснили причину изменения региоселективности. Они предположили, что атака по 2 -положению протекает по механизму, близкому к SN1, а по З -положению - по механизму, близкому к SN2. Изменение количества нуклеофила или природы растворителя может облегчать или затруднять протекание нуклеофильного замещения по одному или другому механизму, влияя, таким образом, на региоселективность раскрытия цикла.
Hollenberg et al. [15] использовали аналогичное 2 ,3 -ангидроликсонуклеозидное производное (35) (сх. 9) для синтеза З -азидо-З -дезоксиарабиноцитидина (36). 2 ,3 -Ангидро-2 ,3 -дидезоксиликсоцитидин (35, R=H) был получен ими по методике, описанной в патенте Kanai [20]. Азидирование проводили в тех же условиях, что и с уридиновым аналогом, с помощью NH4N3 в кипящем этаноле. Реакция протекала почти с исключительным образованием арабиноизомера с выходом 76%. Присутствие ксилоизомера было обнаружено в минимальном количестве, судя по результатам тех.
Аналогичную методику применили Webb et al. [21]. Цитидиновое производное (35, R=DMTr) было получено из цитидина по методике Kanai и Ichimo [22] с выходом 30%. Затем 5 -0-ОМТг-защитную группу удаляли водной уксусной кислотой и полученный незащищенный продукт азидировали с помощью №N3 в водном ацетоне с выходом целевого нуклеозида (36) 90%. Lin et al. [23] и Lavandera et al. [24, 25] предложили эффективный метод введения азидогруппы в молекулу уридина и в 3 -, и в б -положения. Для этого в 2 -дезокси-уридине (37а) (сх. 10) одновременно мезилировали 3 - и 5 -гидроксилы. Затем диме-зилат (38а) с помощью Et3N в кипящем этаноле превращали в ангидронуклеозид (39а), который далее подвергался нуклеофильному замещению №N3 в ДМФА при 120С. На последней стадии соблюдение температурного режима - важное условие для получения диазидопродукта (40а) с приемлемым выходом. У авторов он составил 62%.
Методы получения З -аминоаналогов пиримидиновых нуклеозидов можно условно разделить на две группы. В одну из них входят методики, суть которых заключается в использовании для введения аминогруппы имидных или амидных нуклеозид-ных производных. При этом этот подход может сочетаться как со стратегией синтеза нуклеозидов путем конденсации сахара и гетероциклического основания, так и при использовании в качестве исходных соединений готовых нуклеозидных структур. Согласно стратегии второй группы методов аминопроизводные получаются путем восстановления азидогруппы в соответствующих нуклеозидных азидопредшествен-никах. Спектр методов восстановления азидогруппы, применяемых в химии нуклеозидов, очень широк. Наиболее популярными являются каталитическое восстановление водородом и восстановление по реакции Штаудингера. К менее известным относятся восстановление SnCb, радикальное восстановление н-ВизЭпН, восстановление с помощью NaBhU и муравьиной кислоты. Очень эффективным оказалось применение тиолов и формиата аммония.
Одна из первых методик синтеза АМТ (42) (сх. 11) включала образование промежуточного З -фталимидного производного. Miller et al. [26] получали такое производное (43) замещением эритро-З -мезилатной группы фталимидом калия, при этом конфигурация при С-3 сохранялась: Авторы объяснили это сохранение конфигурации протеканием реакции через 2,3 -ангидроинтермедиат, образующийся при нуклеофильном замещении мезилат-ной группы карбонильным атомом кислорода при С-2. Последующая атака фтали-мид-ионом приводит к восстановлению прежней эритроконфигурации в З -положении. Таким образом, обработав нуклеозид (44) фталимидом калия в кипящем ДМФА авторы получили соединение (43) в виде аморфного порошка. После алкоголиза его метиламином в метаноле при 105С в запаянном сосуде был выделен аминонукле-озид (45). Завершающая стадия детритилирования в кислых условиях превращала (45) вкристаллический АМТ (42) с общим выходом 35% из (44).
Другая методика введения фталимидной группы была предложена Motawia et al. [27]. Она заключается в подготовке 1,5-диацетил-2,3-дидезокси-3-фталимидо-фуранозида (46) (сх. 12) и конденсации его с силилированным тимином в присутствии триметилсилилтрифлата в сухом ацетонитриле. Замещенный фуранозид (46) получали из 2-дезокси-О-рибозы, обрабатывая ее системой реагентов фталимид/Р40ю/Н20/н-ВіізМ в хлороформе при 40С и ацитилируя полученное промежуточное фуранозное производное АсгО в хлороформе в присутствии пиридина. К сожалению, выход фуранозида (46) с этих двух стадий составил лишь 18%.
Первые попытки синтезировать З -амино-З -дезоксиуридин (47) (сх. 13) основывались на стратегии конденсации сахара с гетероциклическим основанием. Fox et al. [28, 29, 30] предложили получать подобные нуклеозиды конденсацией защищенных галогеносахаров, содержащих фталимидную группу в З -положении, и ртутных солей тимина. Kissman и Weiss [31] реализовали эту методику на уридиновых производных. З -Амино-З -дезоксиуридин (47) они получали с выходом 19% с двух стадий из 2 ,5 -О-бензоил-З -фталимидо-З -дезоксифуранозилхлорида (48) и ртутной соли 4-этокси-2-пиримидинона (49). В промежуточном нуклеозидном продукте 4-этоксигруппу гид-ролизовали метанольным раствором хлороводорода, а фталимидную и бензоиль-ные защитные группы удаляли н-бутиламином.
Синтез производных пиримидиновых нуклеозидов, содержащих по З'-положению гетероциклы
Особый интерес представляют аналоги природных нуклеозидов с химически активными группами в З -положении такими, как изоцианато-, изотиоциано- и изоселе-ноцианогруппы. З -Изотиоциано-З -дезокситимидин (127) (сх. 42) можно получить по классической методике синтеза З -модифицированных нуклеозидов - замещением З -сульфонатов. Этот подход был реализован Schreiberet al. [71]. Они обрабатывали З -трифлат (128) тиоцианатом натрия в ДМФА. При этом была получена изомерная смесь изотиоцианата и тиоцианата. После разделения изомеров и удаления 5 -за-щитной группы были получены З -изотиоцано-З -дезокситимидин (127) и З -тиоциано-З -дезокситимидин (129) с выходами 9% и 75% соответственно. Таким образом, этот подход давал целевой продукт с крайне низким выходом из-за амбидентной нуклео-фильной природы тиоцианат-аниона.Matsuda et al. [38] при синтезе З -изотиоциано-З -дезокситимидина использовали сероуглерод и DCC. Они обрабатывали б -О-ТВОМЭ-защищенный АМТ этой системой реагентов в пиридине. 5 -Защищенный изотиоцианат был получен с выходом 87%. Однако после удаления защитной группы с помощью H-BI NF в ТГФ образовалась сложная смесь, возможно содержащая нестабильный целевой продукт (127). При повторении той же реакции с гидрохлоридом АМТ изотиоцианат (127) удалось без проблем получить с выходом 96% в виде гигроскопических кристаллов.
Перечень методов синтеза З -изотиоциано-З -дезокситимидина был приведен в статье Zehl et al. [49]. Его можно получить непосредственно из АМТ обработкой N.N -тиокарбонилдиимидазолом. Этот метод обсуждался подробно в статье Staab и Walther [72], в которой они предложили схему синтеза, аналогичную схеме получения изоцианатов из первичных аминов и ЫД-карбонилдиимидазола. По предложенному методу изотиоцианат (127) был получен с выходом 70%. Более эффективным оказалось использование смеси сероуглерода и оксида ртути [45]. При этом был достигнут выход 90%. Данный метод, видимо, основан на синтезе изотиоцианатов по Гофману [46]. Одно из преимуществ этой реакции - высокая скорость образования целевого продукта.
Такие же результаты были получены при синтезе изотиоцианата (127) из АЗТ с использованием модифицированной реакции Виттига (сх. 43). Эта методика была впервые предложена в статье Molina et al. [73] и представляет собой синтез изотиоцианатов и изоцианатов из иминофосфоранов. При обработке азидопроизводного трифенилфосфином, свободным или закрепленным на полимерной смоле, образуется иминофосфоран (130), который затем легко трансформируется в целевой продукт (127) при взаимодействии с сероуглеродом.
Обе стадии реакции обычно проводят в диоксане. Выход на стадии обработки CS2 по литературным данным составляет около 90% [41, 74]. Если используют три-фенилфосфин, иммобилизованный на полимерной смоле, то обработка сероуглеродом сопровождается одновременным отщеплением продукта от смолы. Использование полимера в реакции открывает преимущества твердофазного синтеза, в частности позволяет использовать более мягкие условия, дает возможность применять большие избытки реагента, а побочные продукты могут быть легко отделены фильтрованием. Если вместо добавления сероуглерода пропускать через диоксан СОг, то можно получить изоцианат (131). У Molina et al. [73] подобный синтез изоцианатов протекал с выходом более 80%.
З -Изоселеноциано-З -дезокситимидин (132) (сх. 44) можно синтезировать из З -изоциано-З -дезокситимидина. Нагревание последнего с металлическим селеном в безводном пиридине происходило с образованием целевого продукта с выходом 48% в виде бесцветных кристаллов. Однако, полученное вещество оказалось очень неустойчивым на воздухе и даже при комнатной температуре разлагалось с выделением металлического селена.
З -Азидо-З -дезокситимидин известен как эффективный анти-ВИЧ препарат. С тех пор как у него были обнаружены противовирусные свойства, было предпринято много попыток, получить соединения, обладающие структурным сходством с ним. В частности, по З -положению вводились различные азольные производные, которые могут рассматриваться как биоизостеры свободно вращающейся нелинейной азидо-группы. В этой связи наибольшим структурным подобием обладают 1,2,3-триазоль-ные циклы, в которых сохранена структура из идущих друг за другом трех атомов азота.
Для введения 1,2,3-триазольного цикла в качестве базовых соединений использовали АЗТ и 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксицитидин. Применяли классический подход для синтеза 1,2,3-триазольных производных, который заключается в термическом 1,3-ди-полярном циклоприсоединении азидогруппы к различным замещенным ацетиленам. Эта реакция хорошо протекает с З -азидопроизводными пиримидиновых нуклеозидов, практически не давая побочных продуктов. Подобным образом был получен ряд триазольных производных с различными заместителями по 4- и 5-положениям 1,2,3-триазольного цикла [75-78].
Haebich и Barth [75] этим методом получили серию 1,2,3-триазольных производных тимидина с карбоксильными, алкоксикарбонильными, гидроксиметильными и ароматическими заместителями по 4- и 5-положениям триазольного цикла (сх. 45). Реакции циклоприсоединения проводили в кипящем DME. При этом разброс величин выходов реакций был очень широким в зависимости от типа и количества заместителей при ацетилене (133).
Если в реакцию вводили ацетилен с заместителями различного типа, то цикло-присоединение протекало с образованием двух региоизомеров (134) и (135). При этом соотношение изомеров определяется стерическими и электронными факторами. В общем, в реакции преимущественно образуется изомер, содержащий элек-тронноакцепторную группу в 4-положении 1,2,3-триазольного цикла [79, 80], и преобладает стерически менее нагруженный изомер [81].
Биологическая активность пиримидиновых нуклеозидов, содержащих по З'-положению гетероциклический заместитель
Согласно литературным источникам, З -амино-З -дезокситимидин не обладает ярко выраженной противовирусной активностью [117, 118, 11, 119]. . Lin и Prusoff [118] оценили способность АМТ тормозить репликацию вируса HSV в клеточной культуре и обнаружили, что лишь при концентрации 400мкМ наблюдается торможение развития вирусной инфекции на 62%. О слабой анти-HSV активности также сообщили Cheng et al. [120] и Fischer et al. [121].
Chu et al. [36] оценили способность З -амино-З -дезокситимидина (42), З -амино-2 ,3 -дидезоксиуридина (51), 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксиуридина (CS-87) (10) и З -азидо-2 ,3 -дидезоксицитидина (12) тормозить развитие ВИЧ-инфекции в РВМ-клетках. Они не обнаружили у АМТ активности при концентрациях до ЮОмкМ. Аминоуридиновый аналог (51) оказался более активным с ED5o, равной бОмкМ, при цитотоксичности с CD5o более ЮОмкМ. CS-87 проявил высокую активность с ED50, составляющей 0,178мкМ, и низкую токсичность с ICso, равной ЮООмкМ. ED5o азидоцитидинового производного (12) находилась в диапазоне 0,66-1,19мкМ, при этом соединение было не токсично при концентрациях до 400мкМ.
De Clercq [122] и Balzarini [123] провели анти-ВИЧ тестирование CS-87 на массивах МТ-4 клеток. Они получили значение ED5o, равное 7,6мкМ, при CD50, составляющей 160мкМ. Таким образом, индекс селективности оказался невысоким, равным 21.
Krenitscy et al. [11] провели обширное тестирование биологической активности АМТ, 3 -амино-2 ,3 -дидезоксиуридина и 3 -амино-2 ,3 -дидезоксицитидина. Анализ активности был проведен с использованием широкого спектра вирусов и бактерий. Они сообщили об отсутствии у этих соединений активности против аденовируса при концентрациях до ЮОмкМ и против РНК-вирусов: гриппа, риновируса и кори. Лишь (51) обладает слабой активностью против риновируса. Эти нуклеозиды оказались также неактивны против использованных в тестировании грамположительных и гра-мотрицательных бактерий. При этом АМТ и его цитидиновый аналог проявили высокую токсичность по отношению к некоторым клеткам. АМТ в D-98 клетках человеках обладает цитотоксичностью с CD5o, равной ЮОмкМ, а в L-клетках мыши с CD5o, равной ЗмкМ. 3 -Амино-2 ,3 -дидезоксицитидин также токсичен для D-98-клеток человека и L-клеток мышей с CD5o. равными ЗмкМ и 1мкМ соответственно. З -амино-З -дезоксиуридин (47) и З -амино-З -дезоксицитидин (52) исследовались Kissman [31] на наличие противоопухолевой и трипаноцидной активности. Активности обнаружено не было ни у одного из этих веществ.
При низкой противовирусной и противомикробной активности АМТ очень токсичен [11, 36]. Причиной этого является его низкая селективность по отношению к обычным внутриклеточным ферментам. Зайцева с сотр. [5] установили, что три-фосфат АМТ является эффективным ингибитором не только вирусных RT HIV и RT AMV, но и обычных внутриклеточных ферментов: ДНК-полимеразы I из E.coli, поли-меразы а из тимуса теленка и полимеразы р из печени крыс. Chen et al. [124] тоже сообщили о токсичности АМТ и о способности его трифосфата ингибировать ДНК-полимеразу а.
Однако, благодаря высокой цитотоксичности, АМТ может рассматриваться как потенциальный противоопухолевый агент. При оценке активности АМТ против лейкемии Молони у мышей (M-MuLV) ED50 составила 42мкМ [125]. Lin и Prusoff [118] обнаружили у АМТ способность ингибировать репликацию клеток лейкемии L1210 и саркомы S180 у мышей. При этом примечательно, что при замене 5 -гидроксильной группы на вторую аминогруппу нуклеозид полностью лишается противоопухолевой активности [118, 125]. Fischer et al. [126] тоже сообщил о способности АМТ эффективно подавлять рост клеток L1210.
Cheng и Prusoff [120] объяснили токсичность АМТ его способностью ингибировать тимидинкиназу. При оценке этой способности по отношению к тимидинкиназе из асцитов саркомы мышей S180 при концентрации нуклеозида 750мкМ наблюдалось ингибирование фермента на 45%. АМТ способен также ингибировать тимидинкиназу из E.coli с ICso, составляющей 2,75мкМ, и цитоплазматическую тимидинкиназу крысы как конкурентный ингибитор с КІ, равной 0,38мкМ [127, 128]. Matsuda et al. [43] оценили активность не только АМТ, но и его трео-З -аналога против лейкемии Р815 у мышей и получили величины Ю5о 0,08мкг/мл для АМТ и Змг/мл для его трео-3 -изомера.
Lin и Mancini [10] исследовали in vitro 3 -амино-2 ,3 -дезоксиуридин (51), З -азидо-2 ,3 -дезоксиуридин (10), 3 -амино-2 ,3 -дидезоксицитидин (62) и 3 -азидо-2 ,3 -ди-дезоксицитидин (12) на способность подавлять рост культур клеток лейкемии L1210 и саркомы S180. Азидоаналоги и уридина, и цитидина оказались неактивными. 3 -Амино-2 ,3 -дезоксиуридин проявил среднюю активность к клеткам саркомы S-180 с Ю5о, равной 50 мкМ, и к клеткам лейкемии L1210 с Ю5о, составляющей 18 мкМ. 3 -Амино-2 ,3 -дидезоксицитидин оказался очень активным, его Ю5о по отношению к L1210 и S-180 оказалось равными 0,7мкМ и 4 мкМ соответственно. Было обнаружено, что цитотоксичность (62) по отношению к L1210 и S-180 снижается при добавлении 2 -дезоксицитидина, но не других пиримидиновых дезоксирибо- или рибонуклеози-дов. Этот эффект 2 -дезоксицитидина на цитотоксичность (62) по отношению к клеткам L1210 зависит от концентрации последнего. При концентрации (62), равной 5мкМ, добавление 2 -дезоксицитидина до концентраций 25 иЮОмкМ снижает его цитотоксичность на 35 и100% соответственно. В то же время при концентрации (62), равной 20мкМ, 2 -дезоксицитидин в количестве 25мкМ понижает цитотоксичность против S-180 на 27%. Также было проведено in vivo тестирование (51) и (62) по протоколу NCI на мышах линии CDFi с лейкемией L1210. В этих экспериментах у уриди-нового производного (51) не было обнаружено никакой противоопухолевой активности, а цитидиновый аналог (62) проявил значительную активность против L1210.
CS-87 тестировали против лейкемии Молони у мышей in vitro [125] и его цитотоксическая концентрация IC50 составила 52мкМ. В отличие от АМТ его трифосфат оказался мощным ингибитором RT HIV-1 [129, 5, 57, 130]. Kedar et al. [129] обнаружил у трифосфата АМТ способность ингибировать RT HIV-1 с КІ, равной 42нМ. Jasko et al. [57] сообщили о способности трифосфата АМТ ингибировать RT HIV-1 и RT AMV при концентрациях, сравнимых с концентрациями трифосфата АЗТ.
В статье Зайцевой с сотр. [5] говорится об оценке субстратных свойств З -амино-3 -дезокситимидин-5 -трифосфата и 3 -амино-2 ,3 -дидезоксицитидин-5 -трифосфата по отношению к ряду ДНК-полимераз и вирусных обратных транскриптаз. Эти три-фосфаты оказались эффективными ингибиторами синтеза ДНК, катализируемого RT AMV и ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами: I из E.coli, полимеразои а из тимуса теленка, полимеразои р из печени крыс и РНК-зависимой ДНК-полимеразой из инфицированных вирусом миелобластоза эмбрионов цыплят. По терминаторным свойствам они превосходят соответствующие 2 ,3 -дидезокситимидин- и 2 ,3 -ди-дезоксицитидин-5 -трифосфаты.
Синтез производного З'-амино-З'-дезокситимидина, содержащего гидразидную функцию по 3'- положению
За последние пятьдесят лет химия нуклеозидов прошла длинный путь от первого синтеза природных нуклеозидов до получения сложных нуклеозидоподобных структур, в которых и гетероциклическое основание, и фуранозный цикл замещены на неприродные аналоги. Особенно бурно эта область стала развиваться после обнаружения у синтезированных нуклеозидных аналогов противовирусных свойств, в частности анти-ВИЧ активности. Много производных было введено в клиническую практику. Среди них хорошо известны нуклеозидные анти-ВИЧ препараты: зидовудин, ставудин, залцитабин, диданозин, ламивудин и др. Хорошо зарекомендовали себя рибавирин - препарат широкого спектра действия, особенно эффективный против гепатита С, ацикловир с его производными - препараты для лечения HSV, реверзет - эффективный против гепатита В, видарабин - применяемый против ряда ДНК-вирусов (W, VZV, HSV), - и некоторые другие. Нуклеозидные аналоги могут использоваться в борьбе не только с вирусами, но и с бактериями. Среди антибиотиков хорошо известен пуромицин, который был выделен из Streptomyces abloniger. Он представляет собой 3 -1М-ацильное производное 3 -амино-6,6-М,г\1-диметил-3 -дез-оксиаденозина. Среди синтетических нуклеозидов тоже были обнаружены соединения с противомикробной активностью: мизорбин, сангивамицин, тиоцамицин и др. Поскольку многие нуклеозидные аналоги являются антиметаболитами, то среди них известны соединения, обладающие противоопухолевой активностью. Цитарабин, флударабин, тиазофурин - эффективные противоопухолевые препараты. Имида-зольное производное EICAR используется в экспериментальных работах с возбудителем.
Среди огромного количества синтезированных нуклеозидов многие наделены ярко выраженной активностью, но не могут применяться в качестве лекарств, т.к. имеют высокую токсичность по отношению к здоровым клеткам организма. Однако некоторые из этих соединений могут служить базовыми структурами, т.н. лидерами, для проведения различных модификаций с целью повышения активности и снижения цитотоксичности. К таким производным относится З -амино-З -дезокситимидин. 5 -Трифосфат АМТ способен прерывать обратную транскрипцию RT HIV и RT AMV при концентрация того же порядка, что и у АЗТ, наиболее эффективного нуклеозид-ного ингибитора RT HIV [57]. Lin и Prusoff [118] и Fischer et al. [126] обнаружили у АМТ активность против лейкемии L1210 и саркомы S180, a Lin и Chen [125] сооб щили о токсичности по отношению к лейкемии Молони M-MuLV. К сожалению, АМТ очень токсичен для некоторых типов здоровых клеток, что, вероятно, связано со способностью его 5 -трифосфата ингибировать ДНК-полимеразы аир млекопитающих. Так как АМТ имеет такой широкий спектр биологической активности, он вполне может рассматриваться в качестве перспективного лидера в поиске более эффективных нуклеозидных производных. При этом даже незначительная модификация структуры нуклеозида может отразиться в резком изменении биологических свойств.
За последние десятилетия было проверено немного вариантов модификаций АМТ. При этом основным модифицируемым сайтом являлась З -аминогруппа. Были получены З -Ы-алкильные, З -Ы-ацильные и 3 -1М-сульфонильные производные, в З -положение были введены изоцианогруппа и ряд гетерокомуленовых функций, получены производные с уреиднои и тиоуреиднои группами, на базе З -аминогруппы были построены некоторые гетероциклические структуры. Формально к производным АМТ также можно отнести аналог тимидина с гидроксиламиногруппой в З -по-ложении, хотя в синтезе этого соединения АМТ не фигурирует.
Однако, не смотря на разнообразие типов модификаций, некоторые из них представлены очень небольшим числом производных. Также при синтезе и изучении многих производных не ставилась в качестве основной задача найти фармакологически ценное соединение. Часто такие вещества получали в качестве субстратов для изучения свойств различных ферментов (ДНК-полимераз и тимидинкиназ), в некоторых случаях изучалась их применимость в технологиях ДНК-секвенирования.
В настоящей работе была предпринята попытка расширить спектр производных АМТ, как путем синтеза новых представителей уже известных видов, так и посредством получения производных новых типов. Из известных, были выбраны З -Ы-ал-кильные, З -И-ацильные, 3 -1М-сульфонильные, З -уреидные и З -тиоуреидные группы производных. Методы их синтеза разработаны недостаточно полно, а информации о влиянии этих модификаций на биологическую активность очень мало.
О синтезе З -Ы-алкильных производных (а) (сх. 1) сообщали Celewicz et al. [1], Petersen et al. [59, 60] и Jasko et al. [57]. Из них З -Ы-метильный и З -Ы-этильный аналоги в виде 5 -трифосфатов терминировали рост ДНК, катализируемый RT HIV и RT AMV, почти с такой же эффективностью, что и 5 -трифосфат АМТ, а ферментативная активность ДНК-полимераз а и р не подавлялась в условиях эксперимента. Таким образом, введение алкильного заместителя по З -аминогруппе АМТ, вероятно, повышает селективность действия нуклеозида. Однако в целом получено алкильных производных было немного, и их биологические свойства изучены мало. Из З -Ы-ацильных производных АМТ (Ь) [13, 33-35, 37, 40, 143] биологические испытания проводились только с формильным и ацетильным аналогами. Заметной активности у них обнаружено не было. Wojczewski et al. получил ряд более сложных продуктов ацилирования, однако они исследовали только их пригодность для ДНК-секвенирования. Из 3 -1М-сульфонильных производных (с) известно только о двух соединениях [67-69]. Причем б -трифосфат одного из них оказался эффективным ингибитором RT AMV.
О З -уреидных и З -тиоуреидных производных АМТ (d) известно также немного. Fischer et al. [137] и Lin et al. [138, 139] сообщили о способности нитрозоуреидного продукта эффективно тормозить in vitro рост клеток лейкемии мышей L1210. В другой статье описывалась попытка использовать уреидныи линкер для создания новых терминирующих субстратов для ДНК-секвенирования.
При получении нами новых производных были использованы как ранее не применявшиеся, так и уже известные методики. Эффективность последних продемонстрирована нами на новых субстратах.
Из модифицированных аналогов АМТ, несущих гетерокомуленовую группу, заслуживает внимание З -изотиоциано-З -дезокситимидин (е, R=H). Известно, что он проявил высокую активность против некоторых линий клеток опухолей, в частности лейкемии L5178Y [34]. К сожалению, наиболее эффективная методика синтеза этого нуклеозида связана с использованием неудобного в обращении СБг. В данной работе представлен новый, не менее эффективный, метод получения этого соединения.
Кроме производных АМТ описанных ранее типов, в ходе работы были получены два новых соединения: З -М-нитрозоаналог АМТ (f) и производное АМТ с З -гидразид-ной группой (д). Эти соединения являются первыми представителями модифицированных аналогов АМТ нового типа.
