Введение к работе
Актуальность темы исследования. Метод фотоаффинной сшивки приобрел огромное значение в молекулярно-биологических исследованиях. До ^давнего времени в качестве фотоактивируемой наиболее часто употребляюсь такая нитрен-генерирующая группа как арилазидная, которая однако обладает существенными недостатками. Рассматриваемая в настоящей работе арил-3-трифторметилдиазириновая (АТФМД) группа имеет ряд важных преимуществ по сравнению с арилазидными и другими фотоактивируемыми группировками. АТФМД группа быстро фотолизируется с образованием высокореакционного карбена, который может атаковать даже алифатические связи. Время жизни такого карбена (один из главных параметров в методе фотосшивки) находится, предположительно, в наносекундном интервале, в частности поэтому АТФМД группа пригодна для кинетических исследований. Фотолиз этой группы протекает в мягких условиях (длинноволновый УФ-свет), что не вредит биологическим структурам. Кроме того, АТФМД группа стабильна в широком диапазоне химических условий, с ней можно работать без специальных предосторожностей, избегая только прямого облучения УФ или солнечным светом.
В настоящее время синтезировано и использовано в биологических исследованиях большое число фотоактивируемых реагентов, содержащих АТФМД группу. Поскольку эта группа обладает явно выраженным гидрофобным характером, дизайн фотоактивируемых реагентов был направлен в основном на производные фосфолипидов и жирных кислот с целью изучения компонентов мембран. Исследования нуклеиново-белковых взаимодействий методом фотоаффинной сшивки с использованием АТФМД развиваются медленно из-за отсутствия достаточного числа таких реагентов для введения в молекулы белков и нуклеиновых кислот. В литературе описано лишь несколько случаев применения АТФМД производных нуклеотидов и аминокислот. На данный момент не существует хорошо разработанного универсального спосо-
Ьэ. сайт-направленного введения фотоактивируемых групп в белки. Исходя и: преимуществ карбен-генерирующей АТФМД группы, очевидно, что проблем; дизайна фотоактивируемых АТФМД производных нуклеотидов и аминокисло" и включения их в нуклеиновые кислоты и белки является актуальной задачей В частности, перспективными соединениями в последнее время являются так называемые "расшиваемые реагенты", позволяющие значительно упростить анализ продуктов фотопришивки.
Цель исследования заключалась в разработке методов синтеза АТФМД-содержащих фотоактивируемых реагентов для изучения нуклеиново-белковых взаимодействий, а также в изучении методов сайт-направленного включения фотоактивируемой АТФМД группы в белки.
Цель исследования обусловила постановку следующих научных задач:
-
Синтез фотоактивируемых производных нуклеотидов, в которых фотоактивная функция максимально приближена к гетероциклу. Проверка возможности включения фотоактивируемых производных нуклеотидов в олигонуклеотидную последовательность.
-
Синтез фотоактивируемых производных аминокислот и изучение включения их в белковые молекулы.
-
Разработка подходов к синтезу расшиваемых АТФМД реагентов.
Научная новизна и практическая ценность работы
Осуществлен синтез новых фотоактивируемых производных уридина, содержащих АТФМД группу и показана возможность их введения в синтетический олигонуклеотид. Разработаны оптимальные условия получения трифторметил-диазирин-производных коричной кислоты - лимитирующей стадии в синтезе расшиваемых фотореагентов. Осуществлен синтез не описанного ранее фотоаффинного аналога энкефалина, содержащего в 4 положении остаток L-4'-[(3-трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]фенилаланина, и показана перспективность его использования для изучения опиатных рецепторов. На примере фермента люциферазы показано преимущество метода сайт-направленного мутагенеза
з с применением некодируемых аминокислот для введения фотоактивируемой АТФМД группы в белки.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликована одна статья и две поданы в печать, результаты работы докладывались на 23-ем Европейском пептидном симпозиуме (1994, Брага, Португалия), 37-ой ежегодной конференции по биохимии и молекулярной биологии (1994, Колумбия, США), 1-ом Съезде Российского научного общества фармакологов (1995, Волгоград), Ill-ем Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (1996, Москва).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного синтезу фотоактивируемых соединений на основе АТФМД, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.
