Введение к работе
I. I.I. Актуальность проблемы
Экзогенные соединения, в том числе лекарственные препараты, попадая в организм человека, подвергаются превращениям в ходе химических реакций, катализируемых особой группой ферментов. Наследуемые нарушения метаболизма лекарственных средств во многих случаях вызваны мутациями в генах ферментов, катализирующих биотрансформацию ксенобиотиков. Два важных обстоятельства характеризуют феномен полиморфизма ферментов метаболизма ксенобиотиков: во-первых, высокая частота аллельных вариантов, и во-вторых, то, что в отсутствие соответствущего ксенобиотика носитель мутантного аллеля фенотипически неотличим от дикого типа. В эволюционном плане, существование полиморфизма этих ферментов, видимо, является благоприятным фактором, повышающим шансы популяции на выживание при воздействии разнообразных химических соединений, например, компонентов пищи.
Фундаментальная проблема взаимодействия организма с экзогенными соединениями, поступающими из окружающей среды и обладающими физиологической активностью, тесно связана с прикладными вопросами: полиморфизм ферментов, катализирующих метаболические превращения ксенобиотиков, часто лежит в основе изменения фармакологических характеристик и физиологических последствий применения лекарственных средств. Поэтому наследуемые вариации активности ферментативных систем, катализирующих такие превращения, в ряде случаев определяют терапевтический эффект лекарственных препаратов. Известны многочисленные примеры, когда подобные вариации вызывают серьезные токсические эффекты и даже приводят к гибели больного. Необходимость получить ясное представление о роли полиморфных ферментов метаболизма ксенобиотиков вызвана возрастающим числом экзогенных соединений, поступающих извне в организм человека в виде лекарственных препаратов, компонентов пищевых продуктов, индустри-
альных токсинов.
Хотя к настоящему времени накоплены данные о роли индивидуальных изоформ ферментов метаболизма в биотрансформации некоторых классов лекарственных соединений, о строении генов ме-таболизирующих ферментов (в том числе цитохромов Р450, N-ацетилтрансфераз, глюкуронозилтрансфераз), все еще не выработано единого взгляда на роль и функции основных вариантов и минорных форм в метаболизме ендо- и екзогенних соединений в организме человека. Поетому создание общего молекулярно - биологического подхода к изучению данного круга вопросов является актуальной задачей.
1.2. Цель и задачи исследования: Цель работы состояла в изучении механизмов, приводящих к снижению активности ферментов, катализирующих метаболизм ксенобиотиков. При атом были поставлены и решались следующие задачи:
-
Создание единого молекулярно-биологического подхода к изучению индивидуальных изоформ и аллелей метаболизирующих ферментов.
-
Выявление особенностей биохимической трансформации лекарственных препаратов (на примере синтетических стероидных гормонов) у экспериментальных животных по сравнению с человеком.
-
Создание систем гетерологической экспрессии двух классов ферментов метаболизма - мембран- связанных белков (индивидуальных изоформ цитохрома Р450 - CYP2D6 и CYP3A4), и цитозольного белка (тиопурин - метилтрансферазы, ТРМЗ!).
-
Выяснение механизмов, лежащих в основе нарушения активности ферментов, участвующих в метаболизме лекарственных средств, на примере тиопурин S-метилтрансферазы. Выявление и характеристика инактивирующих мутаций. Характеристика ТРМІ- подобных последовательностей в геноме человека.
5. Разработка методов генотипирования больных для выявления
нарушений биотрансформации конкретных лекарственных средств. Изучение распространенности аллелей (ТРМТ). Создание диагностических систем для обнаружения мутантних аллелей ферментов метаболизма перед началом лекарственной терапии.
1.3. Научная новизна и практическая ценность работы:
В данной работе получило развитие новое направление в исследовании ферментов метаболизма ксенобиотиков, базирующееся на синтезе индивидуальных ферментов человека и их мутантних форм в клетках низших еукариот (Sacoharomyces oerevisiae).
Разработана высокоэфффективная система экспрессии функционально активных ферментов метаболизма человека в дрожжах S.oerevlsiae. С использованием разработанной системы получены данные об участии изоформы цитохрома Р450 CYP3A4 в метаболизме синтетического лекарственного препарата анаболического действия метандростенолона в организме человека. Изучены кинетические особенности метаболических превращений субстратов - прототипов изоформ цитохрома Р450 CYP2D6 и CYP3A4, в монооксигеназ-ной системе окисления in vitro под действием соответствующих ферментов человека, синтезированных в клетках дрожжей. Проведено изучение метаболизма лекарственных препаратов стероидной структуры у експериментальних животных (крыс). Показано существование значительных межвидовых отличий метаболизма этого класса лекарственных препаратов у человека и животных. Предложен метод выявления больных с нарушением синтеза изоформы цитохрома Р450 CYP2D6 путем анализа РНК, выделенной из периферических клеток крови. Обнаружен молекулярный дефект, приводящий к нарушению метаболизма противоопухолевых препаратов -меркаптопурина и тиогуанина в организме.человека. Путем клонирования и секвенирования кДНК из крови пациентов, дефицитных по активности тиопурин 5- метилтрансферазы (ТРМТ), выяснен механизм инактивации этого фермента - обнаружены точковые мутации, приводящие к снижению активности белка. Разработаны методы выявления инактивирующих ТРМТ мутаций путем генотипирования
больных до начала лекарственной терапии. Проведено изучение распространенности соответствувщих аллелей в популяции белого и черного населения Северной Америки. Соответствующие неактивные аллели были охарактеризованы в гетерологической системе, показано влияние мутаций на каталитическую активность и стабильность белков. Обнаружено присутствие ТРМШ - подобных последовательностей в геноме человека, в том числе процессирован-ные псевдогены. Экспрессия ТРМТ дикого типа в дрожжах дала возможность получить данные о субстратной специфичности фермента и определить кинетические параметры реакции метилирования тиопуринов и их производных. Полученные результаты использованы при лечении больных с острым лимфобластным лейкозом в Детском Исследовательском Госпитале Св.Иуды (Мемфис, США).
Личный вклад автора. В цикле исследований, составляющих диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве , личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех етапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно- биологических и физико- химических экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.
Публикации. По материалам исследований, обобщенных в диссертации, опубликовано 34 работы.
1.4. Апробация работы.
Материалы работы доложены и обсуждены на 4 Международном симпозиуме Международного общества по изучению ксенобиотиков (Сиеттл, США, 1995), 10 международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарственных препаратов (Торонто, Канада 1994), 6 Североамериканском симпозиуме международного общества по изучению ксенобиотиков (Ралей, США, 1994), Третьей конференции
"Геном Человека - 93" (Черноголовка, 1993), Международной конференции по цитохромам Р450 (Москва, 1991), Международном симпозиуме по хроматографии (Москва 1988) , V Всесоюзном съезде биохимиков (Киев, 1986), а также на семинарах в МГУ и Детском Исследовательском Госпитале (Мемфис, США.).
Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе. Работа выполнена в 1984 - 1995 гг.
Тезисы защиты. На защиту выносятся следующие положения:
создание и развитие теоретических и експериментальних подходов к изучению полиморфных ферментов метаболизма ксенобиотиков в организме человека;
молекулярные механизмы, лежащие в основе нарушений метаболизма меркаптопурина и его производных - важных препаратов антипролиферативного и иммуносупрессивного действия;
гетерологические системы на основе Saccharomyces cerevisiae, експрессирующие ферменты метаболизма человека, с целью получения функционально активных индивидуальных ферментов метаболизма ксенобиотиков;
диагностикумы для выявления нарушений метаболизма лекарственных препаратов, с целью предотвращения токсических побочных аффектов химиотерапии;
совокупность идей, теоретических подходов, експериментальних методов и результатов, которую можно сформулировать как новое научное направление "Молекулярно-биологические подхода к изучению биотрансформации лекарственных средств в организме человека".
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 52 страницах и включает общую характеристику работы, експериментальную часть, описание основных результатов и выводы. Работа содержит 14 рисунков, 4 схемы, 4 таблицы.
