Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Реакция аминоацильного включения 8
3. Введение 8
4. Реакция внутримолекулярного амшюлиза амидной группы 9
5. РААВ и некоторые близкие ей превращения 11
5.1. Особенности механизма РААВ и влияние структурных факторов на ход этой реакции 15
6. РААВ в химическом синтезе 20
6.1. РААВ в синтезе линейных и циклических пептидов 20
6.l.l. Циклодипептиды (дилактамы) 20
6.1.1.1. Превращения а-аминоациллактамов 20
6.1.1.2. Превращения р-аминоациллактамов 22
6.1.1.3. Реакции у-аминоациллактамов 24
6.1.2. Синтез циклотрипептидов 27
6.1.2.1. Циклотрипептиды с 9 атомами в цикле 27
6.1.2.2. Циклотрипептиды, содержащие 10 атомов в цикле 40
6.2. Тетрапептиды 43
6.3. Линейные структуры 44
7. Использование реакции гидрокси- и тиоацильного включения в пептидном синтезе 46
7.1. Реакция гидроксиацильного включения 46
7.2. Реакция тиоацильного включения 48
8. Обсуждение результатов 52
8.1. Ацилирование лактамов активированными производными карбоновых кислот 55
8.2. Циклизация глутаминовой кислоты и родственных соединений в составе пептидной цепи 57
9. Синтез исходных N-ациллактамов и PAAB 59
9.1. Ацилироваїше производных пироглутаминовой кислоты 59
9.1.1. Синтез GIp-OBu' 59
9.1.2. Реакция ащширования лактамов 61
9.1.3. Использование соединений, полученных ацилированием лактамов в РААВ 62
9.2. Окисление пирролидинового цикла 64
9.2.1. Синтез пролинсодержащих дипептидов для реакции окисления 66
9.2.2. Реакция окисления 68
9.2.3. Перегруппировка Гофмана 69
9.2.4. Дипептиды, содержащие гомоглутамин и их превращения 72
9.2.5. Амидоацильное включение 74
9.3. Циклизация с участием боковой функции глутамииовой кислоты 74
9.3.1. Синтез циклопептидов, содержащих Dpr 75
9.3.2. Синтез циклопептидов, содержащих орнитин 77
9.3.3. Синтез циклопептидов, содержащих производные Ant, р-А1а 78
9.3.4. Синтез циклопептидов, содержащих только остатки дикарбоновых кислот 80
10. Экспериментальная часть 83
Выводы 123
- Синтез циклотрипептидов
- Линейные структуры
- Окисление пирролидинового цикла
- Синтез циклопептидов, содержащих производные Ant, р-А1а
Синтез циклотрипептидов
Циклотрипептиды до настоящего времени являются наиболее труднодоступными циклическими пептидами и по этой причине представляют большой интерес для химиков-синтетиков. Несмотря на относительно простую структуру циклических трипептидов, синтез этого типа соединений представляет довольную сложную синтетичесую задачу [95, стр. 322]. Эта задача решалась и решается с использованием двух подходов: прямой циклизацией и с использованием РААВ. Для наиболее полного освещения вопроса, мы сочли целесообразным рассмотреть также синтез ряда циклотрипептидов методом прямой циклизации, т.е. без участия РААВ. Прямая циклизация заключается во внутримолекулярном взаимодействии активированного С-концевого карбоксила с N-концсвой свободной аминогруппой в линейном пептиде. Впервые попытки синтезировать циклический трипептид прямой циклизацией были предприняты в 1952 году [96], но вместо циклического трипептида получился циклический димер - гексапептид без примесей целевого продукта [97]. В большинстве подобных случаев наряду с циклотрипептидом (если это соединение образуется) в реакционной смеси присутствуют продукты олигомеризации. Все «истинные» циклотрипептиды, синтезированные к началу 80-х годов, состояли только из иминокислот (Pro, Sar, (Bzl)Gly, Hyp), что полностью исключало образование циклолов и родственных бициклических структур [95, стр. 322]. В этих реакциях использовались активированные эфиры трипептидов: ОРср, OPfp, ONp. На основе этого подхода Дебер синтезировал циклотрипептид Pro-L-Hyp-Pro с использованием нитрофенилового эфира (выход - 12%) [98]. Кроме того, химической модификацией этого трипептида бьши синтезированы некоторые его производные: Hyp(Bz), выход - 60%; Нур(Ас), выход - 65%. Роте уделил большое внимание синтезу сус/о-[Рго]з и его оптических изомеров, а также пептидов cyclo-[Sar2-Pro] и cyc/o-[Sar-Pr02] [14-16, 99-101]. Было также исследовано влияние различных факторов на выходы циклопептидов (рассматриваются ниже). Кесслер (Kessler) с успехом использовал трихлорфениловые эфиры для синтеза cyc/o-[L-Pro-(Bzl)Gly-D-Pro] [102], cyclo-[L-Pro-(NB)GIy-D-Pro] [103]. Роте [10] предложил использовать N-сульфснилные и N-алкилоксиметилильиые группы для защиты азота пептидной связи, что позволило использовать в прямой циклизации трипептиды, включающие также аминокислоты. Для достижения цели, N- защищенные трипептиды, предварительно силилированные TMS-C1, обрабатывали сульфеиилхлоридом (NPysCl) и различными хлорметиловьши эфирами. Полученные таким способом трипептиды деблокировали по N-концевоїі группе и циклизовали с использованием конденсирующих агентов РуВор и TBTU. Выходы пептидов - 15-51%.
Таким способом были получены cyc/o-[Pro-(NPys)GIy-Pro], cyclo-[Pro-(Mom)-p-Ala-Pro] и cyc/o-[Pro-(Mem)-P-Ala-Pro]. Деблокирование трипептида, содержащего глицин, приводит к образованию смеси циклопептид - циклол (доказано методами ИК и 13С ЯМР спектроскопии). Деблокирование пептидов, содержащих (3-А1а, приводит к образованию соответствующего щіклотрипептида; циклол при этом не образуется [10]. Для ряда соединений, принадлежащих к группе пролинсодержащих циклотрииептидов (сус/о-[Рго]з, c;yc/o-[Pro2-D-Pro3, сус/о-[Рго2-Нур], cyclo-[Pro-(Bzl-Gly)2], был проведён полный конформационньгй анализ на основе данных ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа [83, 98, 102, 104-107]. Циклотрипептиды, состоящие из иминокислот, отличных от пролина, образуются с низкими выходами. Так, пептид cyclo-\Sm\i был синтезирован на основе трихлорфенилового эфира [108], пентахлорфенилового эфира [16] в пиридине при П5С (выходы циклотрииептидов в обоих случаях составляли 16%), в пиридине (100С) (выход — 18%), в ДМФ-ТЕА [100С] - циклотрипептид не образуется (основные продукты реакции — дикетопиперазин и олигомеры) [99]. Наряду с циклотрипептидами образовывались дикетопиперазины, димеры, гексамеры и тетрамеры в различных соотношениях. Пространственное строение этого щіклотрипептида было установлено методом ЯМР-спектроскопии [109]. Описан также синтез cyclo-[-(Вzl)Gly-]3, пространственное строение которого подробно исследовано [106]. Важным аспектом работы по синтезу циклотрипсптидов являлось установление влияния различных факторов (растворителя, температуры, природы активирванного эфира и структуры исходного трипептида) на процесс циклизации. Было установлено, что выходы продуктов реакции зависят: 1. От концентрации исходных активированных эфиров. Выходы обратно пропорциональны концентрации реагентов в растворе. При большом разбавлении (infinite) выходы трапептида сус/о-(Рго-Рго-Рго) составляли до 94%, при концентрации 0,1 М - 24% (в продуктах реакции присутсвовали полимерные соединения) (реакция проводилась в ДМФ-ТЕА [100СС], исходное соединение TFA-Pro-Pro-Pro-ONp) [99]. Пентахлорфениловый эфнр этого трипептида при концентрациях гораздо ниже 0,01М в пиридине удаётся превратить в циклотрипептид с выходом 83%, в то время как при концентрации 0,01М выход продукта падает до 60% [16]. 2. Влияние растворителя: в ДМФ выход щгклотрипролина больше 85%, в NMP - 58%, в пиридине - 78%о (0,01М, 100С).
Выход цикпотрипролина в малополярных толуоле, хлорбензоле, диоксане составляет менее 4%. В хлорбензоле даже при большом разбавлении выход не увеличивается (повышается количество дикетопиперазина) [99]. По мнению Роте [99] высокие выходы сусїо-[Ргоз] обусловлены тем, что этот циклопептид имеет все цис-пептидные связи (соответствует і витку спирали «полипролин I»), а также тем, что олигомеризация не может идти из-за жеской спиральной структуры образующихся олигомеров («полипролин I, II»). Также по мнению этих авторов использование в синтезе растворителей, благопрятствующих цис-конформании пептидной связи (NMP, пиридин, ДМФ) существенно повышает выход циклотрипептидов, тогда как растворители стабилизирующие транс-пептидные связи (хлорбензол) - снижают выход циклизации. 3. Природа активированного эфира. В случае использования п-нитрофениловых и 2,4,5-трихлорфениловых эфиров выход цилотрипролина составляет более 66% ([ДМФ-ТЕА] или пиридин), при использовании 2,4,6-трихлорфенилового эфира - менее 40% (ДМФ-ТЕА), менее 6% (пиридин). В этих случаях низкие выходы циклотрипептидов обусловлены стерическими затруднениями (оба о-положения в фенольном фрагменте заняты относительно большими атомами хлора), поэтому реакция идёт в сторону образования дикетопиперазинов и полимеров [99] (Тем не менее, было показано, что в пиридине пентахлорфениловые эфиры (0,01М) образуют циклопептид с выходом 60% [16]). Однако, в водно-органической среде (карбонат-гидрокарбонатный буфер - диоксан) при циклизации Н-Phe-Pro-Pro-ONp основным продуктом реакции был прогидролизовавшийся линейный трипептид [83]. 4. Влияние структуры циклизуемого пептида. А) При замене одного остатка на его антипод выходы трипептидов существенно уменьшаются [99]. Так, трихлорфениловый эфир L-Pro-D-Pro-L-Pro циклизуется с выходом 2%. На основе анализа молекулярных моделей авторы сделали вывод, что выходы реакции высокие в тех случаях, когда реагирующие концевые группы находятся в цисоидном положении, выходы значительно уменьшаются, если эти группы находятся в трансоидном (transoid) расположении [99]. Конформационная напряженность образующего цикла здесь играет меньшую роль, что было показана на примере синтеза одного циклотрипептида и диастереомерных предшественников, циклизующихся при прочих равных условиях с разными выходами. Так, cyc/o-[Pro-D-Pro-Pro] из Pro-D-Pro-Pro-OPcp получается с выходом 2%, а из D-Pro-Pro-Pro-OPcp - 20% [99]. Б) При замене пролина на более конформациоино подвижную аминокислоту выходы циклизации уменьшаются. «Подвижные» аминокислоты (Gly, Sar и т.д.) увеличивают подвижность пептидной цепи и нарушают псевдоциклическую (спиральную) структуру трипролина и олигомеров, поэтому выходы циклотр и пептидов уменьшаются, а олигомеров -увеличиваются. Трипептиды с С-концевым глицином циклотрипептидов, по-видимому, не образуют.
Линейные структуры
Наряду с изучением амипоацильного включения в циклические лактамы проводились исследования этой реакции и на ряде линейных структур. Исходными соединениями были N-фталилдипептиды [2, 25, 136-138,] и N-бензоилдипептиды [139] (дипептиды и тринептиды [136]). Ацилирование проводили обработкой исходного дипептида (I, схема 31) триметилхлорсиланом (хлороформ-толуол, триэтиламин, слабое нагревание) с образованием силилированного производного II, которое далее обрабатывали хлорангидридом карбобензоксиаминокислоты (схема 31). Выходы соответствующих N-ацилдипептидов (III, 15%). Если использовать фталилглицилхлорид, то выход необходимого соединения составляет 75% [139]. Гидрирование полученных N-ацилдипептидов (кроме последнего случая) (толуол, триэтиламин, Pd/C (10%), 48 часов - способ 1А, таблица I приложения) приводит к образованию соответствующих трипептидов (выходы соединениий приведены в таблице 2 (приложение), соединения 98-101). Фталиламиноацилхлорид использовался для прямого ацилирования (без промежуточного процесса силилирования) Z-защишснных пептидов [27]. Ацилирование шло по уретановому азоту, поскольку азот в уретановой группе более пуклеофилен по сравнению с азотом амидной группы. Если водород при уретановом азоте заместить на алкильную группу, то реакция не идёт даже по амидному азоту [27]. Оптимальным вариантом было использование дипептидов с фталилыюй защитной группой на азоте (I, схема 32). Хлорангидриды Z-защище нных аминокислот также не использовались в качестве ацилирующих агентов в синтезе исходных соединений из-за неустойчивости в условиях реакции ацилирования [136], поэтому в качестве ацилирующего агента использовали азидоацилхлориды [27, 136-138]. Азидная группа является мощным акцептором электронов, что повышает активность ацилирующего агента. Кроме того, азидная группа устойчива в условиях реакции ацилирования (кипячение в толуоле, 6-12 часов). Выходы реакции ацилирования (II, схема 32) относительно высокие (40-50%). Азид переводят в амин в кислой среде. Полученную таким способом соль (III, схема 32) раскисляют триэтиламином в тетрагидрофуране (способ 2В, таблица 1, приложение) [136, 137], ДЕАЕ-целлюлозой или оксидом серебра (І) в водно-спиртовом растворе (способ 2А, таблица 1 приложения) [138].
В результате реакции получаются небходимые линейные трипептиды (VI, схема 32) с высоким выходом (таблица 2 (приложение), соединения 102-107). При растворении в воде исходных гидробромидов (способ 1С, таблица 1 приложения) происходит закисление раствора и выпадение нерастворимого имидазолипоыа (V, схема 32; таблица 2 приложения, соединения 102-103). Если при добавлешш гидробромида к раствору бикарбоната натрия, постоянно поддерживать рН 8-9, образуется линейный трипептид, а не имидазолинон [136]. В каждом случае реакция идёт через образование промежуточного циклола (выделить подобные мо но циклические циклолы не удаётся, но их участие подтвержается образованием имидазолонов из гидробромидов в водном растворе). Важным аспектом синтеза линейных пептидов с использованием реакции аминоацильного включения является рацемизация. Было показано, что процесс включения не сопровождается рацемизацией [137], но при синтезе исходных N-ациллактамов рацемизация происходит [136]. При синтезе трипептида Pht-GIy-D-Leu-Gly-OEt в качестве исходного компонента использовалась сс-азидизокапроновая кислота (при восстановлении переходит в D-Leu). Полученным на основе этой кислоты хлорангидридом ацилировапи дипептид Pht=Gly-Gly-OEt. После восстановления азида и включения аминогруппы получился трипептид Pht Gly-Leu-Gly-OEt, который оказался рацемическим (доказано встречным синтезом). Рацемическим был и азидоацетилдипептид, т.е. рацемизация происходит на стадии ацилирования или получения хлорангидрида [136]. Реакция аминоацильного включения не приобрела практического значения в синтезе линейных трипептидов и тетрапептидов, так как не позволяет применять «классические» защитные группы уретанового типа (Z, Вое). Кроме того, использование РААВ предполагает много промежуточных стадий, выходы реакций ацилирования невысоки и осложняются рацемизацией. «Прямой» синтез линейных трипептидов (который использовался в этих работах в ряде случаев для подтверждения структуры) гораздо более эффективен. Но для модификации уже существующих пептидов этот метод может оказаться вполне приемлемым [136]. Кроме того, этот метод успешно использовался для синтеза линейных депсипептидов [140]. Линейные пептиды, синтезированные методом аминоацильного включения приведены в таблице 2 приложения. Б Использование реакции гндрокси- и тиоацилышго включения в пептидном синтезе ЕЛ. Реакция гидроксиацильного включения Наряду с реакцией аминоацильного включения, активно исследовались реакции гидроксиацильного и тиоацилышго включения. Реакция гидроксиацильного включения (схема 33) явилась важным инструментом в исследованиях эргоалкалоидов, точнее, в синтезе пептидной части этих соединений [17, 19-24, 28]. Благодаря использованию этой реакции был синтезирован серратамолид и некоторые его производные [29, 141]. Начиная с 1960-х годов, было выполнено большое количество работ по реакции гидроксиацильного включения, важнейшие ранние результаты исследований в этой области были обобщены в подробной работе Шемякина и др. [25]. Ход реакции гидроксиацильного включения определяется теми же факторами, что и реакция аминоацилыюго включения.
Реакцию гидроксиацильного включения использовали для синтеза линейных [142, 143] и циклических депсипептидов [144, 145]. Синтез циклических депсипептидов основан па включение гидроксиацильного фрагмента в монолактамные и дикетопиперазиновые циклы (сюда следует отнести и ступенчатое увеличение цикла - депсипептид, полученный из дикетопиперазина через реакцию гидроксиацильного включения, ацилировался вторично бензилоксиацилхлоридом с последующим деблокированием гидроксигруппы и включением [25]). Шеппард (Sheppard R.C) показал, что при нагревании гликоил-L лейцил-Ь-пролина при 150С/1(Г5 мм рт. ст. сублимируется циклический депсипептид (выход после перекристаллизации 11,5%) [146]. При растворении этого лактона в хлороформе не было отмечено трансаннулярного взаимодействия и образования циклопа. Однако, при обработке этого раствора сухим хлороводородом или толуолсульфокислотой образуется циклол. Также циклоп образуется с низким выходом и при циклизации гликоил-L лейцил-Ь-пролина в разбавленных растворах в присутствии кислоты. Использование реакции гидроксиацилыюго включения в дикетопиперазиновый цикл (схема 34) является удобным синтетическим подходом к синтезу эргоалкалоидов. Существует несколько подходов к синтезу: ацилирование дикетопиперазина хлорнгидридом гидроксикарбоновой кислоты [17, 20] или циклизация активировашюго эфира трипептида [147], В состав пептидной части эргоалкалоидов входят а-амино-сс-гидроксикарбоновые кислоты. В 1950-х годах были разработаны синтетические подходы к синтезу этих соединений [67]. Другой подход - использование производных серина с последующей обработкой тетраацетатом свинца [147]. Третий подход -ацилирование дикетопиперазина производными гидроксималоновой кислоты с последующей перегруппировкой Курциуса [17, 20, 147]. Еще одним соединением, полученным по реакции гидроксиацильного включения, является серратамолид [29]. Исходный дикетопиперазин (I, схема 35) ацилировался хлорангидридом гидроксикарбоновой кислоты. Деблокирование гидроксогруппы приводило к образованию серратомолида (II, схема 35). По этой же схеме недавно были синтезированы некоторые производные этого природного антибиотика [141]. Для ряда соединений этой группы установлена пространственная структура [148-150]. Е.2. Реакция тиоацильного включения. Менее широкое распространение в пептидном синтезе получила реакция тиоацильного включения. Эта реакция сходна с предыдущей реакцией по механизму. Схемы синтеза ряда соединений приведены на схемах 36 и 37. Ацилирование N-силилированных лактамов хлорангидридом S-ацетил-тиосалициловой кислоты приводит к образованию соответствующего N-ациллактама (I, схема36)[42,43].
Окисление пирролидинового цикла
Кроме вышеописанных методов получения N-ациллактамов наше особое внимание привлекла реакция окисления пирролидинового фрагмента. Ранее было показано, что некоторые простейшие производные пролина легко окисляются в соответствующие производные пироглутаминовой кислоты. Для окисления, как правило, использовались N-защищснные производные пролина. Существует несколько подходов: 1. Окисление оксидом рутения (VIII), который непрерывно регенерируется in situ из Ru02 и NalCU, или хлоридом рутения (III) [168, 170-173]. Этот метод применялся для синтеза N-защищённых (уретановых), а также простейших N-ацилированных производных пироглутаминовой кислоты [171]. Реакцию проводят в двухфазной или однофазной системе [174]. В двухфазной системе используется смесь водного раствора NaI04 и ЕЮАс [168] или СС14 [174]. В случае однофазного окисления, реакция идёт в CCU под действием стехиометрического количества R11O4 [174]. Выходы реакций, как правило, хорошие ( 50%). Кроме й-метилеповой группы лролшш в этих условиях окислению подвергаются все метиленовые группы, непосредственно связанные с гетероатомами (в первую очередь, с азотом). Защищенные диаминокарбоновые кислоты, используемые в пептидном синтезе (Dab, Orn, Lys) переходят в соответствующие амиды (Asn, Gin, hGln) [175], а глицин окисляется в соответствующий оксамид [170], В ходе реакции также происходит окислительное расщепление ароматические групп: тирозин и триптофан переходят в аспарагиновую кислоту [176, 177], частично разрушается бензилоксикарбонильная защита, а п-нитробензильпая группа в этих условиях устойчива [168]). В тоже время этот подход используется для синтеза производных пироглутаминовой кислоты, содержащих фенильные фрагменты (выходы: 52-65%) [173]. Преимуществом этого метода является отсутствие рацемизации. Так, окисление RCO-Pro-OH (R = Me, Et, cHex, BzlO) использовалось для синтеза глутаминовой кислоты с высокой оптической чистотой [178]. 2. Окисление перманганатом калия. Этот метод позволяет проводить окисление соединений, содержащих фенильные фрагменты [179, 180]. Метиленовая группа, находящаяся рядом с гетероатомом, окисляется в карбонильную группу [180]. Этот метод использовался для получения производных Boc-Glp-OH [166] и H-hGln(Z)-OH [180].
Оптическая чистота соединений, полученных этим методом выше, чем при использовании «классического» метода синтеза защищенной пироглутаминовой кислоты, основанной на перегруппировке N-уретан-защищённого ангидрида глутаминовой кислоты [165]. Кроме пермангангата калия и оксида рутения в отдельных случаях в качестве окислителя использовали NaI04 (без Ru02) [181] и производные пероксийодана [182]. Этот окислительный подход мы решили распространить на ряд пролинсодержащих дипептидов с целью синтеза ключевых интермедиатов реакции амипоацильного включения -N-ациллактамов. Следует отметить, что этот подход использовался для синтеза N-ацилпироглутаматов или их уретановых производных. Для получения дипептидов, содержащих остаток внутренней пнроглутаминовон кислоты, этот подход ранее не применялся. Мы обнаружили, что этот подход весьма эффективен в случае пролиновых дипептидов, но он имеет ряд ограничений, о которых говорилось выше. С использованием этого подхода нам удалось синтезировать дилактамы H-cyc/o-[Dab-Glu]-OH и H-cyc/o-[D-Dab-Glu]-OH с высоким выходом [183]. С.2.1. Синтез пр о линсодержащих дипептидов для реакции окисления Большое внимание в нашей работе мы уделили оптимизации синтеза пролинсодержаших дипептидов, которые далее использовались в реакции окисления. В ходе работы был синтезирован ряд пролинсодержаших дипептидов: Boc-Gln-Pro-OBu 21с, Boc-D-GIn-Pro-OBu 21d, Boc-Asn-Pro-OBu1 21а и Boc-D-Asn-Pro-OBu 21b, а также Boc-iGln-Pro-OBu 24b и Boc-iAsn-Pro-OBu1 24а. Для решения этой задачи мы использовали несколько подходов. Наиболее простой способ - это конденсация соответствующих В ос-аминокислот и Pro-OBu методом смешанных ангидридов (способ А, схема 14). Этот метод применяли для производных глутамина - выходы конечных продуктов высокие, по в ходе реакции образуется небольшое количество циклического имида глутаминовой кислоты [184] (эту примесь можно не удалять, так как она не мешает дальнейшим реакциям и легко удаляется на последней стадии). Нам не удалось применить этот подход для синтеза аспарагинсодержащих дипептидов, так как выход необходимых дипептидов был низкий из-за образования большого количества производных аспартимида. Кроме того, в реакционной смеси много примесей, которые трудно удаляются. Можно использовать метод активированных эфиров, но в случае применения эфиров на основе фенольных производных конечный дипептид содержит следы фенолов, что существенно снижает эффективность процесса окисления на следующей стадии. Для удаления следов фенолов необходима хроматография, что усложняет процесс синтеза. Для того, чтобы исключить в ходе реакции конденсации образование циклических имидов, для получения аспарагиновых и глутаминовых дипептидов мы использовали косвенный метод, основанный на эфирах аспарагиновой и глутаминовой кислот как предшественников аспарапша и глутамина (подход Б, схема 14). Выходы реакции высокие (68-88%), образующиеся дипептиды 21a-d не содержат примесей. Для синтеза производного изоаспарагина 24а, в качестве исходного соединения использовали Boc-Asp(OH)-OBzl.
Схема синтеза та же, что и в случае дипептидов 21a-d (подход Б, схема 14). Для синтеза дипептида, содержащего iGln 24b, использовалось несколько подходов. 1. Взаимодействие Boc-iGln-OH с производными пролина с использованием метода смешанных ангидридов (способ А, схема 14). Boc-iGln-OH 26 для этого подхода синтезировался согласно схеме 15. Если в качестве исходного использовали Boc-Glu(OBzl)-ONp, то амид синтезировали путём добавления водного раствора NH3. Выход Boc-Glu(OBzl)-NIl2 25 высокий, но вещество содержало примесь циклического имида глутаминовой кислоты 27. Другой подход, основанный на использовании Вос20 и NH4HCO3, оказался более эффективным способом синтеза соединения 26 [185]. В качестве исходного соединения использовался Boc-Glu(OBzl)-OH. Полученный таким способом Boc-GIu(OBzl)-NH2 являлся гомогенньш по ТСХ. Boc-iGln-OH 26 получали путём гидрирования 25 в присутствии циклогексеиа. При использовании Boc-iGln-OH в синтезе Boc-iGln-Pro-OBu1 методом смешанных ангидридов, конечный продукт содержит примесь циклического имида глутаминовой кислоты. 2. Для получения хроматографически чистого Boc-iGln-Pro-OBu 24b подходит метод, который применялся для синтеза Boc-iAsn-Pro-OBu 24а (способ Б, схема 14). Все полученные на этой стадии соединения (21a-d, Boc-iGln-Pro-OBu , Boc-iAsn-Pro-OBu ) окисляли для получения дипептидов, содержащих остаток пироглутаминовой кислоты. С.2.2. Реакция окисления Стадия окисления одинакова для всех пролинсодержащих дипептидов. Соединения 21a-d, 24a,b (схема 14) окислялись Ru04, который генерировался в ходе реакции in situ из Ru02 (каталитические количества) и NaI04 (схема 16), Реакцию проводится в двухфазной системе: EtOAc - вода. Ход реакции контролировали по ТСХ (система А): хроматограф ическуга пластину после нанесения образца выдерживали в парах аммиака и хорошо высушивали в токе воздуха, что обеспечивало разделение продуктов реакции и исходных соединений (аммиак разрушает продукты реакции окисления и оставляет без изменения исходные дипептиды). Если реакция прошла полностью, то после хроматографии в системе (А) все вещества остаются в районе точки нанесения. Дипептиды, содержащие глутамин н изоглутамин, окисляются быстрее и с более высокими выходами, чем аспарагинсодержащие дипептиды (таблица 1, экспериментальная часть). Получение таким способом N-ацилпироглутаматы 28a-d, 29a,b -кристаллические вещества, их переводили в соответствующие N-аминоацилпироглутаматы с помощью реакции Гофмана. С.2.3. Перегруппировка Гофмана Наиболее простой способ перевести амидную группу в амии - перегруппировка Гофмана. Эта реакция протекает в наиболее мягких условиях при использовании йодозобензол-дитрифторацетата (PIFA) [186]. Это соединение получали обработкой трифторуксусной кислотой йодозобензол-диацетата (последний получали окислением йодбензола оксидом хрома (VI) в серной кислоте в присутствии уксусного ангидрида [187]).
Синтез циклопептидов, содержащих производные Ant, р-А1а
Согласно схеме 25 были также синтезированы соединения, содержащие остатки антраниловой, р-аланина, р-фенил-р-аланина. Нам удалось осуществить РААВ на основе дипептидов, образованных произодными антраниловой (63) и глутаминовой кислот. Синтез проводился согласно схеме 29. Активированные эфиры N-защищённых производных антраниловой кислоты и N-метилантраниловой кислоты конденсировались с Glu(OH)-OBz! или D-Glu(OH)-OBzl с образованием дипептидов 64а,Ь. Активация боковой карбоксильной группы глутаминовой Деблокирование пептидов 66а,b и добавление буферного раствора к полученным аминоацюшироглутаматам приводило к образованию циклических соединений 67а,Ь с хорошими выходами (около 50%). Этот подход нами был также распространён на синтез циклопептидов, содержащих производные р-аланина (схема 30). Исходные дипептиди 68a,b переводили в N-ацилпироглутаматы 69а,Ь по стандартной схеме. Конечными продуктами во всех случаях являлись циклопептиды 70а,Ь. С.3.4. Синтез циклопептидов, содержащих только остатки дпкарбоновых кислот. Подход, проиллюстрированный выше схемами 25-27, 29-30, нами был распространен и на синтез соединений на основе глутаминовой и аспарагиновой кислоты. Некоторые соединения этой группы (в смеси с соответствующими димерами) ранее были синтезированы методом прямой циклизации согласно схеме 31 [192]. Известные практические сложности метода прямой циклизации (схема 31) нам удалось преодолеть с использованием РААВ и синтезировать целый ряд соединений, принадлежащих к этой группе [193]. Синтез проводился согласно схеме 32. Исходные активированные эфиры аминодикарбоновых кислот 71а-с конденсировали с производными глутаминовой или аспарагиновой кислот. На основе этих дипептидов получали активированные эфиры 72а-е, которые в водно-органическом буферном растворе образовывали N-ацилпироглутаматы 73а-е. Полученные таким способом пироглутаматы деблокировали в ТФУ, а соответствующие трифторацетаты 74а-е, которые циклизовали в водно-органическом буферном растворе с образованием циклопептидов 76а-е. Все синтезированные соединения 76а-е являются циклопептидами.
Отсутствие сигналов в 13С ЯМР в области 90-105 ррт говорит об отсутствии циклолов в продуктах реакции, В ходе реакции не было отмечено образование олигомеров (EI MS), PAAB является удобным с практической точки зрения способом синтеза циклопептидов. Благодаря этой реакции нам удалось синтезировать ряд труднодоступных циклодипептіїдов - потенциальных структурных блоков, представляющих интерес для конструирования новых пептидных молекул. Соединения, полученные с помощью РААВ, приведены в таблице 3. Однако, эта реакция имеет ряд существенных ограничений. К сожалению, РААВ не является универсальным способом синтеза циклопептидов. В каждом конкретном случае необходимо подбирать условия, которые позволяют синтезировать необходимую циклическую структуру с оптимальным вьгходом. Необходимо отметить также, что все синтезированные соединения принадлежат к одному структурному классу (IV группа, рис. 1) или являются их аналогами. Распространить этот подход на синтез соединений других классов нам не удалось. Соединения II группы на основе пироглутаминовой кислоты, по-видимому, не существуют, как и их более простые аналоги. Кроме того, по нашим данным, циклопептиды, содержащие диамино кислоты с геминальным положением аминогрупп, не могут быть получены с помощью РААВ. В работе использовались следующие реагенты: растворители фирмы Реахим (Россия), ТГФ - Merck (Германия), EtOAc для реакций окисления - Sigma-Aldrich (США); производные аминокислот фирм Реахим, Bachem (Швейцария), Fluka (Швейцария), NovaBiochem (Великобритания), Reanal (Венгрия), PRF (Япония), Sigma-Aldrich; органические и неогргаиические кислоты, щёлочи, неорганические соли фирмы Реахим, NH4HCO3 - Fluka. В ходе работы использовались следующие реактивы: Ru02-nH20, СЮз, эфират фторида бора, NMM, ТЭА, РЫ, изобутилхлорформиат, циклогексен (Реахим); реагент Клеланда (Reanal); нингидрин (LaChema, Чехия), NaH (Merck); Z-OSu (NovaBiochem); целит, пентафторфенол, PdO/C, В0С2О, В113Р, DIEA, триметилортоформиат, N-гидроксисукцинимид, йодозобензолдиацетат, циклогексадиен (Fluka); DCC (PRF); 1,1,1,3,3,3-гексафторпропанол-2, NaOMe (Sigma-Aldrich); молекулярные сита (З А, 4А, 5 А), дициклогексиламин (Ferak, Германия); полиакрилмид Р-б (BioGel) (Bio-Rad, Великобритапия), мембранные фильтры Pall Biodine (Pall Ultrafine Filtration Corporation, США) H и 13С-ЯМР спектры регистрировались на ЯМР-спектрометрах UNITY 600 (США) и Brucker WM-500 (Германия). Масс-спектры регистрировались на масс-спектрометре Finnigan Mat 8430 (Thermo Electron, Германия), удельное оптическое вращение определялось на поляриметре J AS СО DIP-360 (Япония). Для определения температуры плавления веществ использовался термоплавильный столик Boetius (Германия). Тонкослойная хроматография проводилась на пластинках с силикагелем Kieselgel 6OF254 Merck (Германия). Хроматографические системы для ТСХ: А: СНСЬ - МеОН (9:1, v:v), А1: СН2СЬ - МеОН (9:1), В: MeCN - СНСЬ, - АсОН (8:1:1), С: іРЮН-Н20 (1:1), D: ЕЮАс-Нех (1:1). Хроматограммы проявляли в парах йода или 1% раствором пингидрина в бутаноле. Glp-OBu4 (2) В синтезе Glp-OBu1 использовалось несколько подходов. A. Метод основан на использовании DMAP в качестве катализатора ацилирования [167]. Z-Glp OBu (4), Z-Glp-OH (3) (4,6 г, 17,7 ммоль) растворили в MeCN (50 мл), добавили DMAP (214 мг, 1,75 ммоль) и TEA (2,36 мл) в атмосфере Аг. Смесь охладили до 0С, добавили ВосгО (5,7 г, 26 ммоль) в MeCN (30 мл) в течении 10 мин.
Перемешивали при охлаждении в течение 2 часов, далее в течении ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь упарили на роторном испарителе, осадок растворили в ЕЮАс (50 мл), промыли 0,1 М НС1 (2 х 30 мл), 5% ЫагСОз (2 х 30 мл), водой. Полученный раствор темно-коричневого цвета сушили над MgSC 4, профильтровали, растворитель удалили на роторном испарителе. Кристаллизовали из смеси ЕЮАс - гексан. Z-Glp-OBut (4) - желтоватый порошок, выход -3,78 г (67%), т. пл. 55-57С (лит. [194], 48-52С; [194], 43-45С), Rf - 0.73 (А). Хроматограмму проявляли в парах йода. Glp-OBu (2). Гидрирование проводили на PdO/C в присутствии циклогексена согласно методике [195]. Циклогексеп (1 мл, 9,9 ммоль) растворили в 10 мл i-PrOH, добавили 1,2 г PdO/C, кипятили 7-10 мин в атмосфере Аг, охладили, добавили полученный на предыдущей стадии 4 (1 г, ЗДЗ ммоль) и циклогексеп (0,5 мл, 4,9 ммоль), нагревали полученную смесь при температуре кипения в токе Аг до исчезновения 4. Смесь профильтровали через целит, катализатор промыли i-PrOH, объединённые фильтраты упарили на роторном испарителе, осадок растворили в ЕЮАс (20 мл), промыли 5% К2СО3 (10 мл), 0,1 М НС1 (10 мл), водой, сушили над MgSO , профильтровали, растворитель упарили. Полученное белое кристаллическое вещество промыли гексаном, сушили в вакууме. Glp-OBu (2): выход— 521 мг (84%), т. пл. 105-108С (лит. [161], 105-107С, [159], 109-1 ЮС, [194], 91-92С), Rf-0.65 (А). ЯМР }Н (600 МГц, CDC13): 5 1.50-1.46 (м, 9Н, t-C4H9), 4.11 (дд, /= 8.44, 5.32 Гц, Ш, СаН), 2.22-2.14, 2.45-2.40 (двам, 2Н, С НН ), 2.40-2.28 (м, 2Н, СрНН ), 6.14 (уш. с, Ш, HNC«). B. РоЮг пНгО (60 мг) растворили в 30 мл 10% раствора NaIC 4, добавили Z-Pro-OBu1 (5) (916 мг, 3 ммоль) в 10 мл ЕЮАс. Смесь интенсивно перемешивали. В случае потемнения раствора, к реакционной смеси добавляли 10% раствор NaIC»4 (10-20 мл) (реакционная смесь должна оставаться жёлтого цвета). После исчезновения исходного соединения (контроль по ТСХ, система А), органический слой отделили, водный слой промыли ЕЮАс (6x10 мл). К объединённой органической фазе добавили 3-5 мл МеОН. Смесь оставили в холодильнике на 2 часа. Выпавший катализатор отфильтровали через мембранный фильтр PAL. Фильтрат промыли раствором (0,02 М) аскорбиновой кислоты, водой, сушили над MgSCV Осушитель отфильтровали, фильтрат уиарили на роторном испарителе. Осадок, содержащий смесь 2 [Rf - 0.65 (А)], и 4 (Rf = 0,73 (А) — соединение получено встречным синтезом), без кристаллизации и дополнительной очистки растворили в 10 мл i-PrOH, добавили циклогексен (0,5 мл, 4,95 ммоль). PdO/C (1,0 г) суспендировали в 10 мл i-PrOH, добавили циклогексен (1 мл, 9,9 ммоль).
![Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур](/i/i/4471/365034.png "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович")
![Синтез, строение и химические свойства соединений включения комплексов металлов в кукурбит[8]урил](/i/i/4590/294358.png "Синтез, строение и химические свойства соединений включения комплексов металлов в кукурбит[8]урил Митькина Татьяна Валентиновна")
