Содержание к диссертации
Введение
2. Список основных сокращений 8
3. Литературный обзор 9
3.1. Флуоресцентные маркеры 11
3.2. Цианиновые красители 15
2.1. Строение 15
3.2.2. Физико-химические свойства 17
3.2.3 Спектральные свойства 18
3.2.3.1. Флуоресценция 18
3.2.3.2. Электронные спектры и спектры испускания 22
3.2.4. Влияние строения цианиновых красителей на их спектральные свойства
25
3.2.5. Общие методы получения цианиновых красителей 33
3.3. Индоцианиновые красители 36
3.4. Маркирование олигонуклеотидов 45
3.4. 1. Метод активированных эфиров 45
3.4. 2. Метод смешанных ангидридов 46
4.1. Синтез и масс-спектрометрия олигонуклеотидов, несущих тиофосфорильные модификации заданной локализации 48
4.2. Синтез модифицированных индодикарбоцианиновых красителей для маркирования олигонуклеотидов 60
4.2.1. Синтез индодикарбоцианинового красителя - аналога Су5, содержащего этильную группу в полиметиновой цепи (Йодид [5-(1-этил-3,3-
диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-пентадиен-1-ил]-1-этил-3,3- диметилиндолениния) 62
4.2.2 Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего этильную группу в полиметиновой цепи и функциональную (карбоксильную) группу в положение при атоме азота (2-[5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3- этил-1,3 -пентадиен-1 -ил]-1 -карбоксипентил-3,3 -диметилиндоленин ий) 65
4.2.3. Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метильную группу в бензольном кольце (йодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]-1-этил-3,3,5-триметилиндолениния) 69
4.2.4. Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метильную группу в бензольном кольце и функциональную (карбоксильную) группу в положении при атоме азота (2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-
1,3-пентадиен-1 -ил]-1 -карбоксипентил-3,3,5-тримети линдолениний.) 76
4.2.5. Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метильную
группу в бензольном кольце,активную (карбоксильную) группу и
сульфогруппу в положениях при атомах азота (2-[5-(1-карбоксипентил-3,3,5-
триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1 -ил]-1 -сульфобутил-3,3,5-
триметилиндолениний) 80
4. Экспериментальная часть 91
1. Материалы и методы 91
2. Описание методик 932.1. Вспомогательные реагенты 93
2.2. Синтез индодикарбоцианиновых красителей 94
2.2.1. Иодид 2-[5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-
пентадиен-1-ил]-1-этил-3,3-диметилиндолениния 94
2.2.2. 2-[5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-пентадиен-1-ил]-1-карбоксипентил-3,3-диметилиндолениний 98
2.2.3. Иодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]-1-этил-3,3,5-триметилиндолениния 98
2.2.4. 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]- 1-карбоксипентил-3,3,5-триметилиндолениний 103
2.2.5. 2-[5-( 1 -карбоксипентил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3- пентадиен-1-ил]-1-сульфобутил-3,3,5-триметилиндолениний 105
2.3. Синтез олигонуклеотидов 106
2.4. MALDI-TOF масс-спектрометрия олигонуклеотидов 1076.
Выводы 109
7. Список литературы
- Цианиновые красители
- Синтез и масс-спектрометрия олигонуклеотидов, несущих тиофосфорильные модификации заданной локализации
- Синтез индодикарбоцианиновых красителей
- Иодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]-1-этил-3,3,5-триметилиндолениния
Введение к работе
Трудно представить современную молекулярную биологию, генетику, генетическую инженерию и медицинскую диагностику без использования синтетических олигодезоксирибонуклеотидов. Их применение в этих отраслях знания стало необходимым и даже рутинным приемом. Особую роль в развитии диагностических и генотерапевтических подходов имеют фрагменты ДНК, несущие межнуклеотидные модификации и олигонуклеотиды, снабженные концевыми флуоресцентными метками.
Совершенствование методов биоорганического синтеза олигонуклеотидов позволяет получать для решения конкретных задач олигонуклеотиды с соответствующими разнообразными модификациями. Так, например, реализовать терапевтический потенциал фрагментов ДНК для медицинских и фармацевтических целей удается только благодаря использованию устойчивых к биодеградации аналогов олигонуклеотидов: Р-алкилфосфонатных [1,2], тиофосфорильных [3,4], тиоамидофосфитных [5], пептидно-нуклеиновых кислот [6] и др. Среди них наиболее изученными и часто используемыми являются тиофосфорильные олигонуклеотиды. Показано, что по гибридизационным свойствам такие аналоги близки природным фосфодиэфирам. Однако, в тоже время они достаточно стабильны в биологических жидкостях, мембранотропны и, вследствие этого, эффективны как антисмысловые олигонуклеотиды. Также применение тиофосфорильных олигонуклеотидов дает ряд преимуществ в генодиагностике и методе быстрой амплификации плазмидной ДНК [7,8]. С другой стороны, тиофосфорильные олигонуклеотиды и их метаболиты обладают высокой системной токсичностью. В связи с этим ведется поиск лишь частично модифицированных эффективных и менее токсичных последовательностей. Тиофосфорильная модификация сахаро-фосфатного остова может приводить к функционально значимым изменениям третичной структуры олигомеров.
Особенно важно изучение влияния тиофосфорильных замен на конформацию олигонуклеотидов-аптамеров [9], биологическая активность которых непосредственно обусловлена их пространственной организацией [10]. Проведение таких скрининговых и структурно-функциональных исследований требует, широкого набора частично модифицированных олигонуклеотидов.
Наиболее экономичным в настоящее время является автоматический параллельный синтез олигонуклеотидов на многоканальных синтезаторах, но для получения локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов методы не созданы. В этой связи; особенно; актуальны как разработка стратегии и способов синтеза таких производных:, так и оптимизация достоверных способов подтверждения их состава.
Интенсивное развитие методов автоматического секвенирования ДНК, ПЦР-генодиагностики в режиме реального времени (Realime PGR), в особенности, создание комплексных диагностических наборов, позволяющих одновременно анализировать содержание в. пробе нескольких ДНК-мишеней [11,12], а также технологии микрочипов требует постоянного поиска; новых флуорохромов, позволяющих расширить используемую область спектра [13]. На сегодняшний; день- существуют несколько классов флуоресцентных красителей; активно применяющихся в биологии и медицине. Требования, предъявляемые к этим красителям; довольно жесткие, они должны обладать:
—спектральными свойствами в нужном диапазоне (определяются свойствами источников света регистрирующих приборов); —химической стабильностью при твердофазном автоматическом синтезе олигонуклеотидов (например; в автоматическом ДНК-синтезаторе); —биохимической инертностью (отсутствием неспецифических взаимодействий в ходе биохимических и; молекулярно-биологических процессов) [14].
Цианиновые красители
ЭД- и ЭА-заместители или один из них, а также часть метиновых групп могут входить в состав гетероциклических систем - хинолина, пиридина, индола, бензтиазола и др. Часть метиновых групп сопряженной цепочки может также входить в состав ароматических систем - бензола, нафталина и др. [38]
Цианиновые красители могут рассматриваться как часть класса полиметиновых красителей. Они определяются как аммонийные соли, содержащие в молекуле полиметиновую цепь =СН(-СН=СН)п -, фланкированную атомами азота. Вследствие этого катион представляет собой резонансный гибрид предельных структур: —N=CH—(CH=CH)lTN— - —N-(HOHC)n—HC=N—
Именно с резонансным взаимодействием между атомами азота на концах сопряженной цепи связана интенсивная окраска цианинов [39,40].
В молекуле цианинов оба атома азота входят в кольцевые системы, однако возможно существование полиметиновых красителей различных типов, в молекуле которых один или оба атома азота могут находиться вне ядра, а часть углеродной цепи может входить в кольцевую систему. Кроме того, обе кольцевые системы могут быть непосредственно соединены связью между атомами углерода, входящими в ядра, или эта связь может осуществляться при помощи - СН = группы, - СН=СН - СН= группы или посредством более длинной сопряженной цепи, содержащей нечетное число атомов углерода. В зависимости от строения цианины (хинолиновые производные) были разделены на четыре класса [39]: 1) Апоцианины: кольцевые системы соединены непосредственно при помощи атомов углерода, входящих в гетероцикл. 2) Цианины: кольцевые системы соединены с помощью группы - СН=: а) Псевдоцианины: в положениях 2, 2 б) Изоцианины: в положениях 2, 4 в) Цианины: в положениях 4, 4 3) Карбоцианины: кольцевые системы соединены с помощью группы =СН-СН=СН а) Пинацианолы (в положениях 2, 2 ) б) Дицианины (в положениях 2, 4 ) в) Криптоцианины (в положениях 4, 4 ) 4) Поликарбоцианины: кольцевые системы соединены цепью: а) Карбоцианины: из 3-х атомов углерода б) Дикарбоцианины: из 5-й атомов углерода в) Трикарбоцианины: из 7-й атомов углерода и т.д. Кроме этого, цианины делятся на симметричные и несимметричные в зависимости от того, одинаковые ли гетероциклы находятся на концах полиметиновой цепи. Физико-химические свойства.
Цианиновые красители представляют собой соли довольно сильных органических оснований и являются основными красителями. Поэтому они обесцвечиваются и кислотами и щелочами (при длительном воздействии, и особенно при нагревании). В первом случае образуется двухзарядный ион, во втором случае — карбинол [41].
Цианины практически нерастворимы в неполярных растворителях, трудно растворяются в воде, хорошо - в алифатических спиртах [42]. Цианиновые (полиметиновые) красители дают очень яркие и чистые окраски. Светостойкость окрасок в большой степени зависит от природы окрашиваемого материала. На белковых (шерсть, натуральный шелк) и целлюлозных материалах светостойкость, как правило, низка. Однако на ацетатных волокнах катионные полиметиновые красители дают окраски с очень высокой светостойкостью [38]. 3.2.3 Спектральные свойства. 3J2.3.1. Флуоресценция.
Свечение атомов, молекул, ионов и других более сложных комплексов, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбуждённого состояния в нормальное, называется люминесценцией [43]. При этом происходит полное преобразование поглощённой энергии в собственное излучение, что отличает люминесценцию от явлений рассеяния и отражения света.
Свечение органических веществ относится к фотолюминесценции (способ возбуждения - световая энергия (ультрафиолетовые или видимые сине-фиолетовые лучи)) [44].
Люминесценция включает в себя, два вида свечения - флуоресценцию и фосфоресценцию. Они различаются как механизмом происхождения, так и длительностью свечения [45]. При фосфоресценции переход молекулы из возбужденного состояния в основное происходит с изменением спина электрона, и свечение длится некоторое время после окончания возбуждения вещества. При флуоресценции переход молекулы происходит без изменения спина электрона, и свечение прекращается вместе с прекращением действия возбуждающих лучей [44].
Первая попытка теоретического описания процессов длительного свечения, была предпринята Яблонским [43]. Согласно предложенной им схеме предполагалось, что кроме основного и возбуждённого состояний, у молекул существует метастабильное состояние. Позже Теренин, Льюис и Каша показали, что метастабильный уровень является триплетным. Теренин указал на возможность неодинакового направления спинов на различных молекулярных орбиталях. Тот факт, что электрон, возбуждённый на верхнюю орбиталь, может иметь два различных направления спина, означает, что в результате каждого электронного перехода получаются два разных возбуждённых состояния -синглетное и триплетное.
На основе указанных представлений была построена схема энергетических уровней и переходов между ними, получившая название схемы Теренина-Льюиса (представлена на Рис. 1) Видно, что у каждой молекулы одновременно существует две системы электронных уровней: синглетных S и триплетных Т. При этом между этими уровнями могут происходить излучательные и безызлучательные переходы. Излучательные переходы (на схеме обозначены сплошными стрелками) осуществляются между состояниями одинаковой мультиплетности (сингл ет-синглетные и триплет-триплетные переходы). Безызлучательные процессы происходят без поглощения или испускания света - избыток энергии при таких переходах переходит в тепло.
Существует два типа безызлучательных переходов: внутримолекулярный безызлучательный переход между различными электронными состояниями одной мультиплетности (синглет-синглетный: Si - So и триплет-триплетный: Т2 - Ті) и переходы между синглетными и триплетными СОСТОЯНИЯМИ S] - Ті И Ті -» S0. Безызлучательные переходы на схеме показаны волнистыми стрелками.
Синтез и масс-спектрометрия олигонуклеотидов, несущих тиофосфорильные модификации заданной локализации
При введении электронодонорных групп А.тах поглощения смещается в длинноволновую часть спектра, а при введении акцепторных - в коротковолновую. Введение заместителей в полиметиновую цепочку всегда ведет к снижению молекулярной экстинкции и к смещению максимума поглощения (электронодонорные группы дают небольшой сдвиг в длинноволновую область спектра).
Получение индоцианиновых красителей основано на взаимодействии гетероциклических соединений - индоленинов, содержащих активные метальные группы, с полиметиновыми соединениями, содержащими активные заместители на концах цепи (кроме монометинцианинов). Конденсацию проводят в умеренно щелочной среде, причем, чем ниже кислотность индоленинов, тем более сильное основание необходимо использовать.
В качестве соединений, формирующих полиметиновую цепь карбоцианиновых красителей обычно используют ортоэфиры муравьиной кислоты - для симметричных цианинов, либо дифенилформамидин - для несимметричных.
В качестве соединений, формирующих полиметиновую цепь дикарбоцианиновых красителей используют ацетали малонового диальдегида, чаще - дианилы малонового диальдегида. Получение дианилов малонового диальдегида: Дианилы малонового диальдегида обычно получают из соответствующих альдегидов по следующей схеме:
Диэтилацетали получают взаимодействием этилового спирта с альдегидом в присутствии безводного хлорида кальция. Действием на них п-толуолсульфокислоты и хинолина получают винил-этиловые эфиры. Выделяют эфиры методом простой перегонки, над натрием. Авторы [62] отмечают, что /3-алкил-замещенные виниловые эфиры легко реагируют с ортомуравьиным эфиром в молярных соотношениях в присутствии каталитических количеств эфирата трехфтористого бора, хлористого цинка и других катализаторов типа Фриделя-Крафтса (хлористый алюминий, четыреххлористое олово, четыреххлористый титан и другие), образуя с высокими выходами тетраэтилацетали. Отмечено также образование небольших количеств более высококипящих продуктов, представляющих собой, по-видимому, вторичные продукты присоединения винилового эфира к тетраацеталю образующегося диальдегида. сх-Замещенные виниловые эфиры заметно отличаются от /3-замещенных по условиям проведения реакции, с ортомуравьиным эфиром. Оказалось, что в случае а замещенных виниловых эфиров удовлетворительное каталитическое действие оказывает только хлористый цинк. Эфират трехфтористого бора приводит, к осмоленню о-замещенного винилового эфира, а четыреххлористый титан, четыреххлористое олово, эфират треххлористого алюминия и другие катализаторы вызывают побочные процессы расщепления,, в результате чего образуется сложная смесь низкокипящих продуктов реакции. Кроме того, при реакциях с си-замещенными виниловыми эфирами необходимо применять не менее чем двукратный избыток ортомуравьиного эфира.
Дианилы малонового диальдегида получают взаимодействием при нагревании тетраэтилацеталей малонового диальдегида с метанольным,раствором галогенид гидратов анилина [63]. Выделяют в виде кристаллов-желтых оттенков методом переосаждения из спиртов. Получение индоленинов:
Индолы являются биологически активными соединениями и нашли широкое применение в различных областях науки и медицинской практике. Разработано довольно большое количество методов получения индолов И/ индоленинов. Основными из них являются: синтез индолов по Бишлеру, метод Рейсерта, синтез Фишера. Метод Бишлера заключается во взаимодействии алкил-фениламина (либо анилина) с 2-бутаноном, содержащем в третьем положении легко уходящую группу (Hal; ОН и т.д.) в присутствии-каталитических количеств хлорида цинка:
Синтез индодикарбоцианиновых красителей
Фракции 1-3(проба 1) и 34-40(проба 2) объединяли, т.к. по результатам ТСХ они содержат практически чистые вещества, и идентифицировали с помощью MALDI масс-спектроскопии. Спектр пробы 1 (см. Приложение, рис.8) показал интенсивный пик M.W. 438,6, соответствующий расчетной молекулярной массе соединения (136) (439,6). Спектр пробы 2 (см. Приложение, рис.7) показал интенсивный пик M.W. 610,8, соответствующий расчетной молекулярной массе соединения (13а) (611,8).
Фракции 4-33 также объединяли и рехроматографировали на той же колонке. Смесь наносили в системе растворителей дихлорметан:триэтиламин 6:0,2. Фракцию Г элюировали системой дихлорметан:триэтиламин 6:0,2; фракцию 2 -системой бензол:метанол:триэтиламин 5,5:0,5:0,2; фракцию 3 - системой бензол:метанол:триэтиламин 4,5:1,5:0,2.
Качество разделения контролировали методом ТСХ (система растворителей бензол:метанол:триэтиламин 5:1:0,2). В качестве свидетелей использовали пробу 1 и пробу2, выделенные в процессе предыдущей хроматографии. Rf фракции Г соответствует соединению (136), a Rf фракции 2 соответствует соединению (13а). , 69 Состав фракции 2 определяли MALDI масс-спектрометрией: Спектр показал интенсивный пик M.W. 525,0 что соответствует расчетной молекулярной массе, целевого соединения (13) - 524,7.
Из раствора красителя удаляли растворители на роторном испарителе при нагревании на водяной; бане до Т=509С. Остаток растворителей удаляли в токе сухого воздуха: Продукт (13) сушили в вакуум-эксикаторе над КОН и Ро05.
Таким образом, получали 2-[5-(Т-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил І З пентадиен-І-илЗ-Г-карбоксипентил-ЗіЗ-диметилиндолениний (13). с выходом 31,5%. Были, получены спектры поглощения и флуоресценции. Спектрально-люминесцентные свойства соединения (13) оказались аналогичны свойствам, соединения (7), т.к. изменения в строении не затронули хромофорную группу.
Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метильную группу в бензольном кольце (йодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1і,3-пентадиен-1-ил]--1-зтил-3 3 5-триметилиндолениния).
Согласно литературным данным большое; влияние на поглощение цианинов оказывают заместители, входящие- в состав гетероциклических остатков. Электронодонорные группы в положение: 4 к атомам; азота гетероостатков вызывают батохромный сдвиг. Электроноакцепторные группы ві том же положение также оказывают батохромный эффект, но более слабый, либо небольшой гипсохромный; сдвиг. Заместители- в орто-положение к атомам- азота гетероостатков± также как и заместители при- атомах азота, оказывают незначительное влияние на спектральные свойства цианинов. . Таким образом- для сдвига; максимумов поглощения и флуоресценции; целевого индодикарбоцианинового красителя в более;длинноволновую область, по сравнению с коммерческими красителем Су5; было принято решение ввести метальный радикал в положение 4 к атомам азота гетероостатков- Су5. Соответственно, модификации должны были подвергнуться соли индолениния. Была предложена и осуществлена следующая схема синтеза — Схема 5. Схема 5. 4s 4 CH3COOH,t (18) N2H, l.HCbNaNOj » 2. snci2, на сн. Н3С о ся-с
Толилгидразон изопропилметилкетона (18) получали в несколько стадий из л-нитротолуола (14) согласно методикам [67, 68, 89] (выходы продуктов: п-толуидин (15) - 91,6%, и-толилгидразин гидрохлорид - 63,3%, и-толилгидразон изопропилметилкетона (18) - 75,3%). Строение промежуточных соединений было подтверждено с помощью MALDI масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР Н (см. Приложение, рис. 10-12) и электронной спектроскопии поглощения (п-толилгидразин гидрохлорид. Спектр снимали в инертном растворителе (метанол): 3.5 п3,0 -ш 2.5 оя 2,0 1 5(Л .э LAmax=230nmJ 1,0 \ ГЛтах=283шп " 0,50,0 2( 30 I 1250 300Wavelength, пт 350 400 2,3,3,5-тетраметилиндоленин (19) получали реакцией Фишера двумя разными способами. 1 способом 2,3,3,5-тетраметилинд оленин (19) получали из синтезированного ранее и-толилгидразона изопропилметилкетона (18) по аналогии с методикой [90] циклизацией в ледяной уксусной кислоте.
Реакционную смесь перегоняли в вакууме водоструйного насоса в атмосфере азота. Собирали 3 фракции: при Т= 80С/10 мм рт. ст. - уксусная кислота. после отделения фракции 1 на стенках дефлегматора и холодильника образовывалось бесцветное льдистое вещество - предположительно, ацетат аммония. При длительном нагревании с помощью тепловой пушки его собирали как фракцию 2 при Т=115С / 8 мм рт. ст. при Т=125С /8 мм рт. ст. - практически бесцветное, с желтым оттенком, маслянистое вещество с резким запахом - предположительно, целевой продукт.
Отбирали фракцию ТКИП=125С / 8 мм рт. ст. Структура полученного соединения (19) была подтверждена с помощью Н-ЯМР - спектроскопии (Приложение, рис.13) Присутствуют сигналы протонов бензольного кольца, сигналы метальных групп при 2-ом и 3-м положении, а также сигналы метильной группы при бензольном кольце. Также полученный продукт идентифицировали с помощью MALDI масс спектроскопии (Приложение, рис.14). По результатам спектра молекулярная масса вещества составила M.W. 173,9. Расчетная молекулярная масса 2,3,3,5 тетраметилиндоленина - 173,25. способом 2,3,3,5-тетраметилиндоленин (19) получали из синтезированного ранее я-толилгидразина гидрохлорида (16) без выделения я-толилгидразона изопропилметилкетона (18) - взаимодействием метил-изопропилкетона (17), п-толилгидразина гидрохлорида (16)и ацетата калия в ледяной уксусной кислоте.
В колбу помещали метил-изопропилкетон (17), и-толилгидразин гидрохлорид (16), ацетат калия и ледяную уксусную кислоту. Смесь перемешивали при комнатной температуре 30 минут (реакционная масса приобретала насыщенный желтый цвет), затем при перемешивании кипятили 1 час (реакционная масса становилась вишневой).
Иодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]-1-этил-3,3,5-триметилиндолениния
Предложенные модификации состояли во введении алкильных заместителей в бензольное кольцо и в полиметиновую цепь. Перспективным оказался найденный прием использования в качестве заместителя в гетероциклической системе сульфо-группы, поскольку он позволяет не только повысить гидрофильность, но и увеличить квантовый выход флуоресценции.
Получены активированные (N-гидроксисукцинимидные) производные красителей и их конъюгаты с аминоалкильными производными олигонуклеотидов. Маркированные олигонуклеотиды были испытаны в гибридизационном анализе на биологических чипах. Испытания показали пригодность полученных красителей для технологии биологических микрочипов.
Другая- перспективная область применения полученных конъюгатов - ПЦР ДНК-диагностика наследственных и инфекционных заболеваний. Важно отметить, что использование для проведения стандартных ПЦР-анализов. олигонуклеотидных праймеров, несущих новые флуоресцентные заместители, не оказывало ингибирующего действия на процесс амплификации ДНК и не приводило к снижению чувствительности анализа.
Разработанные с участием автора методы, и технологические приемы получения синтетических олигодезоксирибонуклеотидных зондов и праймеров, в том числе модифицированных (тиофосфорильных, флуоресцентномеченных, содержащих гасители флуоресценции и другие заместители), а также способы контроля их качества: используются при создании новых ДНК-диагностикумов наследственных и инфекционных заболеваний человека в фирме ООО "Биотехлит" и внедрены в производство в НПФ "Литех" коммерческих диагностических наборов для определения следующих патогенов: Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma urealyticum.
В работе использовались: серная кислота ("Реахим", Россия), соляная кислота ("Реахим", Россия), хинолин ("Fluka", США), этилортоформиат ("Fluka", США), эфират трехфтористого бора ("Fluka", США), триэтиламин ("Fluka", США), бензол ("Реахим", Россия), гидразин гидрат ("Merck", Германия), 1,2-дихлорбензол ("Aldrich", США), уксусная кислота ("Реахим", Россия), уксусный ангидрид, N— гидроксисукцинимид ("Fluka", США), пятиокись фосфора ("Fluka", Швейцария), гидроксид калия ("Реахим", Россия), нитрит натрия ("Реахим", Россия), палладий на угле (II) ("Реахим", Россия), хлорид олова ("Aldrich", США), сульфат магния ("Реахим", Россия), хлорид кальция безводный ("Aldrich", США); цитрат аммония, амидофосфитные производные нуклеозидов ("Glen Research", США), нуклеозид-компонеиты на твердом носителе (CPG) ("Glen Research", США), 3-//-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксид ("Glen Research", США), аммиак водный 25% ("Экое-1", Россия).
Для получения насыщенных растворов 3-гидроксипиколиновой кислоты ("Fluka", США и "Bruker", Германия) использовали сочетания растворителей: вода LC-MS ("Sigma", США), вода ВРС Grade ("Sigma", США), вода Hiperpur-Plus ("Panreac", Испания), вода Ultrapur ("Merck", Германия), ацетонитрил Hiperpur ("Panreac", Испания), ацетонитрил for mass spectroscopy ("Fluka", США), ацетонитрил for spectroscopy, Uvasol ("Merck", Германия).
Также использовали растворители марок ч.д.а. и ос.ч. отечественного производства ("Реахим", "Лекбиофарм") и HPLC-gradient grade производства Panreac (Испания). Пиридин хранили над молекулярными ситами (4А). Дистиллированную воду получали с помощью последовательно соединённых моно- и бидистилляторов ("Химлабприбор", Россия), получаемый попутно бидистиллят использовали для технических целей. Олигонуклеотиды синтезировали твердофазным амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК ASM-800 ("Биоссет", Россия) с использованием стандартных коммерческих реагентов. Точные объёмы растворителя отбирали с помощью калиброванных пипеток на 1, 2, 5, 10 мл, микроколичества добавляли автоматическими пипетками (Pipetman "Gilson", Франция), а пробы веществ отбирали с помощью пипеток Пастера.
Индивидуальность полученных соединений и ход реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" UV-254 (Чехия) и "Silica gel" F254 ("Merck", Германия). Перед хроматографированием пластины сушили в потоке тёплого сухого воздуха, а затем охлаждали до комнатной температуры. Элюенты - системы растворителей: бензол : метанол : триэтиламин = 5,5 : 0,5 : 0,2; бензол : метанол : триэтиламин = 5 : 1 : 0,2; бензол : метанол : триэтиламин = 4,5 : 1,5 : 0,2; бензол : метанол : триэтиламин = 3,5 : 1,5 : 0,2; дихлорметан : триэтиламин = 6 : 0,2; вода : ацетонитрил =1:4.
В качестве носителей для колоночной хроматографии использовали Silica gel с размером частиц 35/70 нм ("Fluka", Швейцария). Размер колонки (мм) - 10 400, скорость элюции 0,5-1,5 мл/мин.
ВЭЖХ-анализ осуществляли на хроматографе Agilent 1100 (США), колонка Hypersil С-18, 5 мкм, 4x250 мм.
Взвешивание веществ осуществляли на аналитических весах (TYP WA-33, Польша). Осаждение соединений в небольших количествах проводили на микроцентрифуге ("Eppendorf centrifuge" 5414 S, Германия).
