Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Методы определения холестерина в сыворотке крови человека 10
1.1.1. Химические методы определения холестерина 10
1.1.2. Ферментные методы определения холестерина 14
1.1.3. Определение холестерина методами жидкостной хроматографии 16
1.1.4. Определение холестерина методом газожидкостной хроматографии 18
1.2. Определение высших жирных кислот в плазме крови человека 20
1.3. Определение катехоламинов в плазме крови человека 24
Глава 2. Экспериментальная часть 32
2.1. Реагенты и аппаратура 32
2.2. Методы исследования 35
Глава 3. Многоуровневая система определения холестерина в плазме крови человека 39
3.1. Определение содержания холестерина методом планарной хроматографии 42
3.2. Определение холестерина фотометрическими методами 44
3.3. Определение холестерина методом ВЭЖХ 58
Глава 4. Методы определения высших жирных кислот в плазме крови 64
Глава 5. Определение катехоламинов и важнейших биохимических маркеров в биологических жидкостях человека 90
5.1. Определение катехоламинов методом ВЭЖХ 90
5.2. Определение показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека 103
Глава 6. Использование совокупности параметров для решения классификаци онных задач в клинической диагностике 122
Выводы 142
Литература 144
Список сокращений 167
Приложения 169
- Химические методы определения холестерина
- Определение высших жирных кислот в плазме крови человека
- Определение холестерина фотометрическими методами
- Определение показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека
Введение к работе
Актуальность работы. Клиническая лабораторная диагностика является г одной из важнейших областей современной медицины, успехи которой зависят как от уровня развития аналитической химии, так и степени внедрения наиболее перспективных методов анализа в практику. В настоящее время возможно-сти абсолютного большинства клинико-диагностических лабораторий нашей страны ограничены применением фотометрических методов анализа. Это не всегда дает возможность быстро и правильно провести определение диагностически значимых параметров.
Многочисленные эпидемиологические исследования установили связь гиперхолестеринемии с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. В "* связи с этим определение холестерина в крови является одной из самых акту- альных задач современной клинической лабораторной диагностики. Анализ литературных данных показывает, что исследования в этой области ведутся, в основном, с применением химических и ферментных фотометрических методик. Отсутствуют также данные о возможности оптимизации применения комплекса аналитических методов, что дало бы возможность повысить эффективность решения задачи определении холестерина (ХС) в биологических жидкостях.
Не менее важной проблемой современной клинической биохимии явля- ~ ется определение содержания высших жирных кислот (ВЖК) и катехоламинов (КА) в плазме крови для ранней диагностики ряда тяжких расстройств здоровья. Одним из направлений в решении этой задачи является внедрение в практику медицинских лабораторий хроматографических методов анализа. Методом ГХ можно быстро выявлять малейшие изменения в содержании и соотношении ВЖК различного строения, что позволяет диагностировать ряд серьез- U ных заболеваний эндокринной системы. Внедрение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения содержания катехоламинов в плазме крови позволяет с высокой точностью проводить диагностику гормонально активных опухолей хромафинной ткани на ранних стадиях заболевания.
Целью работы явилась разработка системного подхода к определению основных показателей липидного и кальций-фосфорного обмена, катехолами-нов в биологических жидкостях человека спектрофотометрическими и хрома-тографическими методами.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: систематизировать и оценить аналитические и метрологические характеристики методов, применяемых в клинико-диагностических лабораториях для определения параметров липидного и кальций-фосфорного обмена; оптимизировать условия спектрофотометрического определения некоторых показателей липидного и кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях; выбрать оптимальные условия и разработать методики хроматографиче-ского определения катехоламинов, высших жирных кислот и холестерина в плазме крови; выявить возможности использования совокупности основных параметров биологических жидкостей для решения классификационных задач в целях ранней диагностики эндокринных заболеваний и мониторинга лечебного процесса.
Научная новизна работы
Изучена возможность использования системы методов жидкостной хро матографии, включающей планарные варианты (бумажную и тонкослой ную) и ВЭЖХ для определения холестерина в сыворотке крови с целью оптимизации процесса диагностики нарушений липидного обмена.
7 Разработана рациональная многоступенчатая схема определения холестерина и высших жирных кислот, включающая спектрофотометрические и хроматографические методы анализа.
Разработана и внедрена методика ВЭЖХ - определения катехоламинов и холестерина при их совместном присутствии в пробе с использованием мультидетекторной схемы;
Показана принципиальная возможность применения элементов метода распознавания образов для обработки совокупности результатов определения содержания ключевых веществ в биологических жидкостях человека с целью решения классификационных задач;
Оптимизированы условия аналитического определения основных биохимических показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека. Практическая значимость работы на основе результатов проведенных исследований предложены и внедрены в практику работы диагностической лаборатории тест-методики определения ХС и ВЖК; разработана и внедрена в практику работы лабораторий СамГМУ методика газохроматографического определения высших жирных кислот в плазме крови; разработана и внедрена методика определения ХС в плазме крови методом ВЭЖХ; предложена и внедрена многоуровневая схема определения ХС и ВЖК с использованием комплекса аналитических методик; разработан и внедрен в практику клинико-диагностической лаборатории ООО «Центр «Диабет» ВЭЖХ - методика количественного определения катехоламинов в плазме крови; разработана и внедрена в практику система классификации образцов био логических жидкостей в целях ранней диагностики расстройств здоровья, основанная на графическом представлении совокупности ключевых па раметров крови и мочи.
Положения, выносимые на защиту многоступенчатая система определения параметров липидного обмена, включающая спектрофотометрические, колоночные и плоскостные хро-матографические методы; оптимальные условия спектрофотометрического определения биохимических показателей обменных процессов; оптимизация хроматографического определения параметров липидного обмена, катехоламинов в плазме крови; разработанные методики определения основных показателей обменных процессов и система использования совокупности ключевых параметров биологических жидкостей для ранней диагностики эндокринных заболеваний и мониторинга процесса лечения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999г); I Российском съезде геронтологов и гериатров (Самара, 1999); Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000); IV Российском съезде геронтологов и гериатров (Самара, 2001); VII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и электрофорезу (Москва, 2001); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, 2002); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (к 100 - летию со дня рождения К.В.Чмутова) (Москва, 2002); XII Всероссийской конференция по газовой хроматографии (Самара, 2002); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Сара-
9 тов, 2003), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Москва, 2004), V
Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2005), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, 2005).
Химические методы определения холестерина
Холестерин (ХС) относится к числу наиболее часто определяемых орга нических соединений. Нами проведен анализ литературных источников, по священных методам определения ХС в биологических жидкостях (сыворотка или плазма крови), а также в животных и растительных тканях, маслах. Методы определения ХС можно классифицировать следующим образом: а) химические; б) ферментные; в) хроматографические методы. К химическим относятся методы определения продуктов взаимодействия ХС с кислотами Льюиса после его дегидроксилирования. В качестве реагентов наиболее часто применяются либо реактив Либермана-Бурхарда (Л-Б) (смесь конц. H2SO4, СН3СООН и уксусного ангидрида), либо реактив Златкиса-Зака її (H2S04 и соли Fe ). Известно большое число модификаций обоих методов, отличающихся способами пробоподготовки, соотношением реактивов и условиями проведения реакций. Реакция Л-Б заключается в том, что в сильнокислой среде в присутствии IV уксусного ангидрида от ХС отщепляется вода и образуется окрашенное в зеле новато-синий цвет соединение, содержащее несколько сопряженных двойных связей, предположительно бисхолестадиенмоносульфоновую кислоту. Изучению этой реакции посвящено множество работ. Исследовано влияние света, температуры, состава реактива Л-Б, присутствия воды [1] на ее про Ї текание. Реакция может проходить в самых разнообразных растворах, содер жащих, помимо уксусного ангидрида, уксусную и серную кислоты, а также ор ганические растворители, лишь бы среда была абсолютно безводной. Реакция ускоряется при повышении температуры, яркий свет разрушает окраску продукта.
Авторы [2,3,4,5,6,7] доказали, что при измерении светопоглощения можно использовать абсорбцию промежуточного () =620 нм) и конечного (A =420 нм) продуктов, причем для промежуточного продукта Хтах меняется от 610 до 660 нм (по-видимому, в зависимости от состава реактива Л-Б). Как правило, измеряют поглощение при 610-620 нм, поскольку окраска конечного продукта сильнее зависит от условий проведения реакции [4,6,8]. В лабораторной практике стандартным является проведение реакции при 25 С. Определение общего холестерина (ОХС) по промежуточному продукту реакции требует четкого соблюдения времени от начала реакции до момента измерения. Абсорбция продуктов реакции при 620 нм линейно зависит от концентрации ОХС в диапазоне 0-10ммоль/л [9]. В зависимости от способа подготовки пробы химические методы можно разделить на две группы: 1) прямые методы, не предусматривающие предварительную подготовку пробы; 2) экстракционные методы, включающими экстракцию ХС органическими растворителями. Основными достоинствами прямых методов являются простота, доступ f ность и низкая стоимость анализа. Важнейшим недостатком является неспеци фичность. Это связано с тем, что реакция проходит с значительным выделением тепла, и многие компоненты сыворотки крови образуют окрашенные про дукты (чаще всего, в результате дегидратации). Кроме того, все стерины реагируют таким же образом как ХС. Но так как разница в концентрации между другими стероидами и ХС значительная, то авторы [1 Сосчитают, что погрешность незначима. На определение ОХС сильно влияет билирубин (в зависимости от метода 1 мг/ 100 мл билирубина сыворотки имитирует 5-10 мг/ 100 мл ХС) [11], гемоглобин, каротин, некоторые стеролы, лекарственные препараты, присутствующие в крови. Причиной ошибки может являться также денатурация белка сыворотки в присутствии кислоты. Из-за влияния этих факторов результаты определения ОХС прямыми методами оказываются завышенными в среднем на 2-12 % [4], Для образцов с аномально высоким содержанием мешающих компонентов применение прямых методов без учета их влияния практически невозможно. Мешающее действие гемоглобина и билирубина можно устранить, применяя двухволновое спектрофотометрирование при регистрации разности оптических плотностей (A i=618 нм, Х2=730 нм) [2]. Включение этапа экстракции повышает специфичность метода: результаты определения ХС в среднем на 7 % ниже, чем при прямом методе. Спектр используемых экстрагентов довольно широк: этанол-диэтиловый эфир, этанол-ацетон, спирт-петролейный эфир, хлороформ, гексан, изопропанол, петролей-ный эфир [12], смесь метанол-хлороформ [13]. Погрешность, связанную с присутствием эфиров ХС устраняют гидролизом последних. Гидролиз эфиров ХС осуществляют растворами NaOH, этила-том натрия или другими гидролизующими агентами и довольно часто - водно-этанольными растворами КОН [3,6,14]. Трехстадийные методы, включающие гидролиз эфиров ХС, экстракцию, упаривание экстрактов и последующее определение ХС реактивом Л-Б, отличаются хорошими метрологическими характеристиками. Примером может служить метод Абеля, модифицированный авторами в работе [15]. В настоящее время этот метод принято считать эталонным для определения ОХС в сыворотке крови.
Для повышения чувствительности экстракционных методов используют флуориметрическое определение с возбуждением при 546 нм и регистрацией сигнала при 590 нм [9]. Этот метод поддается автоматизации [16,17,18]. Для определения ХС в лабораторной практике широко используется реакция Златкиса-Зака (3-3), основанная на окислении содержащегося в плазме или сыворотке крови свободного или эфирно-связанного ХС солями железа (III) в присутствии уксусной и серной кислот с образованием ненасыщенных продуктов, окрашенных в красно-фиолетовый цвет. Реакция 3-3 используется либо без предварительной подготовки пробы, либо после экстракции ХС. Известно несколько модификаций метода, отличающихся соотношением реагентов, условиями проведения реакции и т.д. В работе [19] исследовано влияние введения смеси уранилацетата и ацетата железа вместо FeCl3. Автор [20] считает, что замена уксусной кислоты на пропионовую позволяет уменьшить влияние белков. Одна из модификаций прямого метода с применением реактива 3-3, к которому добавлена фосфорная кислота, разработана авторами [1]. Методы, основанные на реакции 3-3 и включающие предварительную экстракцию ОХС, в целом аналогичны экстракционным методам, основанным на реакции Л-Б [21]. В качестве экстрагентов используют смеси: петролейный эфир-этанол, этанол-хлороформ, этанол-изопропанол [11,22]. Обычно используют фотометрическую регистрацию (Х1Т1ах=560 нм) [21], однако для повышения чувствительности применяют и флуориметрический способ [23]. При этом снижается влияние ряда мешающих компонентов. Для определения ОХС предложены и другие реагенты. Известны методы, основанные на использовании концентрированной серной кислоты [24], соли
Определение высших жирных кислот в плазме крови человека
Определение содержания катехоламинов в биологических жидкостях че-ловека имеет большое значение для оценки функционального состояния симпа-то - адреналовой системы. Кроме того, катехоламины, являясь нейротрансмит-терами, через центральную и симпатическую нервную систему принимают участие в регуляции сердечно-сосудистой системы [113]. Катехоламины (КА) - соединения, содержащие 3,4 - дигидроксифениль ное (пирокатехиновое) кольцо и боковую группу - этиламиновую или этанола миновую, гистаминовую, холиновую, ацетилхолиновую, индольную [113],- от носятся к группе гормонов, которые образуются в мозговом слое надпочечников. В нормальных условиях адреналин (А) и норадреналин (НА) вырабатыва ются в человеческом организме в соотношении 1:4 [114]. Быстрый рефлекторный выброс КА происходит в ответ на различные воздействия - эмоциональное Р возбуждение, болевые сигналы, мышечную нагрузку, гипоксию, гипогликемию.
Синтезированные КА депонируются в гранулах нервных окончаний в кровь, \ где они циркулируют преимущественно в связанном белками состоянии. Не связанные А и НА быстро инактивируются. Полупериод их существования в крови менее 3 минут. В организме реализуется два основных пути инактивации КА: извлечение из кровотока с последующим включением в гранулы нервных окончаний или метаболизм (конечным продуктом которого является ванилил-миндальная кислота) [115]. Потребность в определении низких концентрации КА стимулирует разра-ботку соответствующих аналитических методов. К настоящему времени разработаны методы определения КА, основанные на специфических ферментативных реакциях, предусматривающие использование радиоактивных субстратов, а также иммунологические методы [116, 117]. Широкое внедрение их в практику здравоохранения затруднено из - за отсутствия во многих лабораториях соответствующей радиометрической аппаратуры и высокой трудоемкости определения. Наибольшими возможностями в анализе биогенных аминов обладает вы (ф сокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Основная трудность при проведении анализа биологических жидкостей методом ВЭЖХ - нежелательность прямого ввода пробы в колонку. Это связа но с содержанием в крови и моче белковых молекул, адсорбирующихся на дос тупной им внешней поверхности частиц сорбента и быстро выводящих его из строя.
Попытка устранения этого эффекта введением больших доз вещества в Wi хроматограф с целью насыщения колонки приводит к появлению на хромато граммах дополнительных пиков, искажающих результаты исследования. Во избежание засорения колонки используют методику пробоподготов ки, включающую отбор пробы, введение в нее внутреннего стандарта, экстрак цию, центрифугирование, отделение и упаривание в токе азота органической фазы, растворение остатка в подвижной фазе. На воспроизводимость результатов могут влиять многие факторы, в том числе отбор, хранение и приготовление анализируемых проб. При подготовке к проведению исследований на содержание гормонов следует учитывать два важных момента: необходимость соблюдения стандартных условий отбора биологического материала и предотвращение деградации гормонов в об разцах. Уже в момент отбора биологического образца необходимо обеспечить г минимальную потерю катехоламинов вследствие их возможного разрушения. Сразу же после отбора пробы ее переносят из шприца в центрифужную про бирку, охлажденную на льду. Сохранность биогенных аминов обеспечивают ЭДТА и кислая среда [117]. При работе с кровью общим правилом является немедленное отделение плазмы от форменных элементов крови, так как гормоны могут поглощаться и инактивироваться эритроцитами и лейкоцитами. Для решения этой задачи используют добавление хлорной кислоты (0.1 М - 0.4 М) с последующим центрифугированием. Избыток хлорной кислоты после центрифугирования U можно удалить, нейтрализуя супернатант раствором КОН, К2 СОз или К3 РО4 при охлаждении до О0 С [113]. Плазму или сыворотку непосредственно после получения запаивают в стеклянные ампулы, замораживают и хранят при температуре не выше -20 С. Для отделения КА от других компонентов пробы проводят селективную обратимую адсорбцию на активированном оксиде алюминия. КА элюируют І разбавленным водным раствором кислоты (0,1 М НСЮ4 или 0,1 М НС1). По следним этапом процесса пробоподготовки является концентрирование КА путем пропускания через экстракт азота особой чистоты. Разделение КА можно проводить с использованием различных вариантов жидкостной хроматографии. Так, на колонках с катионообменниками можно проводить разделение КА, проявляющих основные свойства. Соответственно для метаболитов КА с кислотными свойствами применяются анионообменники. Хотя и катионо - и анионообменники вполне пригодны для разделения соответственно основных аминов и их кислых метаболитов, при наличии в анализируемой смеси КА и их карбоксильных метаболитов, разделение осуществляется недостаточно эффективно. Около 90% всех анализов методом ВЭЖХ выполняются на химически привитых фазах, главным образом с привитыми алкильными группами.
Среди адсорбентов лучшей разделительной способностью по отношению к биологическим аминам обладают силикагели с химически привитыми функциональными группами С18 [118]. Для разделения КА в качестве элюента используют буферные растворы на основе фосфорной [119, 120] , уксусной [121,122,123], лимонной [124], азотной и трихлоруксусной кислот с органическими добавками: метанола [123, 125, 126], цианистого метила [118, 120, 127, 128], ацетонитрила [119, 129]. Для регистрации физико-химических свойств, как правило, используются оптические и электрохимические детекторы. Из числа оптических наибольшее применение нашли флуориметриче-ские детекторы, позволяющие повысить селективность определения. Кроме того, применяются абсорбционные детекторы, работающие в ультрафиолетовой области спектра, спектрофотометры, предназначенные для фотометриро-вания элюата, выходящего из хроматографической колонки и хемилюминес-центные детекторы. Использование указанных детекторов перечисленных приборов делает необходимым перевод биогенных аминов в окрашенные или флуоресцирующие производные. В основе этого метода лежит введение хромофорных и флуорофорных групп в молекулы катехоламинов путем химиче
Определение холестерина фотометрическими методами
В случае превышения норматива содержания холестерина в сыворотке крови, установленного нами методом бумажной хроматографии, возникает необходимость проведения определения данного биологически активного вещества более чувствительными методами. Нами были изучены различные варианты фотометрического определения холестерина в сыворотке крови. Анализ литературных данных показал, что холестерин плазмы или сыворотки крови и его эфиры дают цветное окрашивание при взаимодействии с р серной кислотой и солями железа (III), а также при обработке смесью уксус ного ангидрида, серной и уксусной кислот (1:5:1). , Обе реакции включают стадию дегидратации, механизм которой - по теря воды после протонирования ОН-группы ХС с образованием иона карбо-ния 3,5-диена. Этот ион в дальнейшем превращается последовательно в ди-, три- и тетраенильный катион в реакции 1 и в пентаенильный катион и далее -в холестагексансульфоновую кислоту по реакции 2 (рис.3). Наличие нескольких сопряженных двойных связей в образующихся соединениях определяет т их характерную окраску. г Для проверки возможностей метода 1 нами была использована сле дующая методика. К 1,3 мл уксусной кислоты добавляли 0,05 мл сыворотки крови без следов гемолиза, перемешивали, а затем добавляли 1 мл цветного реактива, встряхивали и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Затем фотометрировали при А=530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против контрольной пробы, состоящей из уксусной кислоты, исследуемой сыворотки и концентрированной серной кислоты в соотношении 1,3:0,05:1 (в мл).
Цветной реактив готовили следующим образом: к 8 мл раствора хлори да железа (2,5 г хлорида железа растворяли в 80 мл ортофосфорной кислоты, нагревая до полного растворения, затем охлаждали и доводили объем до 100 мл о-фосфорной кислотой) добавляли концентрированную серную кислоту до объема 100 мл. Расчет концентрации холестерина в сыворотке крови проводили методом построения калибровочного графика. 1160 мг/л калибровочный раствор холестерина готовили путем растворения 116мг холестерина в 100 мл ледя ной уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика вместо исследуемого материала вносили 0,05-0,2 мл калибровочного раствора, к кото Рис.4. Градуировочная характеристика для определения холестерина по реакции с хлорным железом Для реализации методики 2 нами была приготовлена смесь ледяной ук сусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты в соотношении 10:50:10. К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке про щ бирки добавляли 0,1 мл сыворотки крови, встряхивали и ставили на 20 минут в водяную баню при 37С, затем фотометрировали в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против реактива при длине волны 625 нм. Калибровочный раствор готовили путем растворения 232 мг холестерина в 3 мл хлороформа и доведения до 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Расчет холестерина в сыворотке крови проводили методом построения градуировочной характеристики. Из анализа литературных данных следует, что прямые методики определения холестерина обладают низкой специфичностью. Для устранения ме шающего действия интерферирующих веществ нами была предпринята попытка модифицировать методику путем предварительной экстракции холестерина изопропанолом [26]. » Рис.5. Градуировочная характеристика для определения холестерина по реакции с уксусным ангидридом Для этого к 0,2 мл исследуемой сыворотке крови добавляли 4,8 мл изо-пропанола, тщательно перемешивали и через 10 минут центрифугировали. Далее анализировали надосадочную жидкость, используя реакцию холестерина с хлорным железом. Метрологические характеристики исследуемых методик оценивались путем определения холестерина в контрольных сыворотках (с известной нормальной (2000 мг/л) и патологической (3200 мг/л) концентрацией ХС). Под правильностью понималась степень близости результата измерения к истинному значению измеряемой величины. Показателем правильности является значение систематической погрешности [197]. Под прецизионностью понималась степень близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных установленных условиях. Мерой пре Экстремальные показатели прецизионности - повторяемость, сходимость и воспроизводимость. На изменчивость результатов измерений, выполненных по одному методу, могут влиять различные факторы, в том числе: время между измерениями, калибровка оборудования, оператор, используемое оборудование. В условиях повторяемости все четыре фактора считают постоянными, в условиях воспроизводимости изменяющимися. Промежуточные состояния определяются условиями промежуточной прецизионности [187]. Для оценки систематической погрешности нами был использован t-критерий Стьюдента, который рассчитывался по следующей формуле: \х-м\ / = 4п (8), где т s ц - истинное значение измеряемой величины. Рассчитанное значение критерия Стьюдента сравнивали с табличным при числе степеней свободы f=n-l и доверительной вероятности Р равной 0,95Лтаб.(0,95;19)=2,09. Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что при нормальной кон центрации ХС в контрольном материале все три методики удовлетворяют ус ловиям правильности.
Прямое определении ХС в патологической сыворотке Щ по реакциям с хлорным железом и уксусным ангидридом характеризуется наличием весьма существенной систематической погрешности, что не позволяет рекомендовать данный метод для использования в практике клинико-диагностических лабораторий. Нами было также проведено сравнение стандартных отклонений ре зультатов, полученных исследуемыми методиками, с использованием крите 1 рия Фишера.
Определение показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека
К показателям кальций-фосфорного обмена, определяемым с целью диагностики ряда серьезных заболеваний, относят содержание кальция и Л фосфора в крови и моче, активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в крови. Кроме того, весьма информативным является определение экскреции кальция и фосфора по отношению к креатинину в утренней порции мочи. Для определения данных параметров наиболее доступными для отече ственных лабораторий являются спектрофотометрические методы [140]. Изучение возможностей использования различных регентов и внедрение со временных методов анализа в лабораторную практику позволяют повысить надежность диагностики, снизить временные и материальные затраты. В таблице 19 обобщены имеющиеся в литературе данные по методам определения показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях. Кальцию принадлежит весьма важная роль в осуществлении процессов жизнедеятельности. Он влияет на проницаемость биологических мембран, возбудимость нервов и мышц, участвует в нервно-мышечной проводимости, сокращении и расслаблении мускулатуры (в том числе мышцы сердца), фор-it мировании кости и хряща; воздействует на обмен веществ в клетках, секре цию гормонов, биологически активных веществ, секреторную деятельность желудка, является важным фактором свертывания крови. Уровень кальция в плазме крови зависит от: 1) количества кальция, посту пающего в организм; 2) величины его экскреции; 3) состояния процессов об мена кальция между кровью и костной тканью. І В норме концентрация так называемого общего кальция в плазме крови колеблется в довольно узких пределах: 2,25—2,75 ммоль/л. Методы исследования кальция в сыворотке (плазме) крови можно разделить на две большие группы: прямые и непрямые (состоящие в предварительном осаждении кальция в виде труднорастворимых в воде соединений). t
Большинство применявшихся ранее методов определения содержания общего кальция в крови основывалось на выделении его оксалатом аммония , в форме щавелевокислой соли, а также на осаждении кальция пикролоновой, хлоранилиновой кислотами с последующим исследованием осадка гравиметрическим, колориметрическим или титриметрическим (например, перманга-натометрическим) способами [140]. Методы этой группы отличаются плохой воспроизводимостью результатов, большой трудоемкостью, многочисленными ошибками, обусловленными необходимостью многократного промы-вания осадка, его высушивания, прокаливания, растворения в минеральных щ кислотах. В этой связи несравненно больший интерес представляют прямые методы определения уровня общего кальция: колориметрические, флюоримет-рические, пламеннофотометрические, титриметрические (комплексономет-рические), а также атомно-абсорбционная спектроскопия, признанная как референтный метод [174]. Наиболее используемым в клинико-диагностических лабораториях является фотометрический метод с применением цветных комплексообразую - щих реагентов. Для определения содержания кальция методом спектрофото метрии предложено множество комплексообразующих реагентов: глиоксаль бис-[2-оксианил] (ГБОА), вазо I [175], 1-(2-карбоксифенилазо)-7- (4" карбоксифенилазо)-хромотроновая кислота [172], орто крезолфталеинкомплексон [176], 4-(2-пиридилазо)-резорцин [177], Арсеназо III [166]. Широко применявшиеся ранее разнообразные модификации мурек сидного метода определения кальция сейчас практически не используются. Колориметрические способы с применением мурексида или метилтимолово-го синего уходят из лабораторной практики главным образом потому, что цветной комплекс кальция с мурексидом неустойчив, а таковой с метилтимо ловым синим имеет малый линейный диапазон калибровочной кривой Ц- (несмотря на высокую чувствительность метода, специфичность и стабильную окраску комплекса). . В литературе имеются данные также о применении вольтамперометри ческих [167, 168] и полярографических [165] методах анализа. Наиболее точным является способ атомно-абсорбционной спектроскопии, принятый в ряде стран в качестве референтного для оценки надежности других методов установления содержания кальция. Однако методика атомной абсорбции не нашла широкого применения в клинико-лабораторной практике, так как ее реализация требует использования достаточно дорого-стоящей аппаратуры. Для определения содержания кальция в крови можно использовать как сыворотку, так и гепаринизированную плазму (другие антикоагулянты: цитрат, оксалат, ЭДТА — непригодны), свободные от следов гемолиза (незначительный гемолиз может вызвать завышение результатов). Кальций стабилен в сыворотке крови в течение 24 часов при комнатной температуре (18—25С), одну неделю при 2—8С, 5 месяцев в замороженном состоянии (пробы нельзя многократно размораживать).
Точное определение г содержания кальция в моче может проводиться только после полного раство рения осадка солей мочи перед исследованием, для чего к суточному объему мочи добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты либо прогревают мочу при 56С в течение 15 минут, что способствует растворению осадка. Нами была изучена возможность применения двух комплексообразова телей: о-крезолфталеина и Арсеназо III для определения кальция в сыворотке крови. Калибровочный раствор кальция готовили из кальция углекислого (ч.д.а.), высушенного до постоянной массы, 250, 22 мг навески растворяли в л 0,1 н. НС1, концентрация ионов Са в таком растворе составляла 2,50 ммоль/л. В кислой среде ионы кальция взаимодействуют с Арсеназо-Ш с обра зованием комплекса малинового цвета, интенсивность окраски которого про . порциональна содержанию кальция и измеряется при длине волны 650 (640 670) нм. Нами был использован следующий состав реагента: 0,15 ммоль/л Арсеназо III в 0,1 моль/л ацетатного буфера рН 4,75. Реагент стабилен, постоянно готов к работе. Сохранность его не менее 6 месяцев при комнатной температуре, при 2-8С реагент стабилен не менее года. Оптимальное соотношение пробы и реакционной смеси — 1:100. Изме-рения проводили против холостой пробы. В таблице 20 приведено соотноше % ние исходных компонентов в реакционной смеси для проведения определе ния кальция по данной методике. калибровочного раствора. Нами также была изучена возможность применения в качестве реагента о-крезолфталеина.
Крезолфталеинкомплексон образует с ионами кальция в ч щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция. В реакционную смесь добавляли 8-оксихинолин, который маскирует металлы, мешающие определению. Определение проводили при длине волны 578 нм. Нами был использован следующий состав раствора реагента: в качестве буферного раствора использовался 2-амино-1-метил-пропанол, рН 10,7, 3,5 моль/л, в качестве хромогена Ц о-крезолфталеинкомплексон (0,16 ммоль/л), 8-гидрокси хинолин (6,89 ммоль/л) и соляная кислота (60 ммоль/л). Рабочий реагент готовился путем смешивания составляющих. Сохранность реагента не превышала 7 дней при температуре хранения -2-8С. Пробы готовили согласно таблице 21. Нами было проведено определение концентрации кальция в аттестованном контрольном материале (контрольной сыворотке фирмы BioRad, с концен трацией кальция 2,50 ммоль/л) перечисленными выше методами. Результаты определения представлены в таблице 22.
