Содержание к диссертации
Введение
1. Пуриновые и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы. Строение и механизм катализа. 9
1.1 Общие сведения 9
1.2. Высокомолекулярные пурин нуклеозидфосфорилазы 15
1.2.1. Пространственная структура 15
1.2.2. Строение активного центра 19
1.2.3. Механизм катализа 22
1.3. Низкомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы 26
1.3.1. Пространственная структура 26
1.3.2. Строение активного центра 27
1.3.3. Механизм катализа 31
1.4. Уридинфосфорилаза 36
1.4.1. Пространственная структура 36
1.4.2. Строение активного центра 39
1.4.3. Механизм катализа 44
1.5. Тимидинфосфорилаза Е. coli и пиримидиннуклеозидфосфорилаза Bacillus stearothermophilus. 47
1.5.1. Пространственная структура 48
1.5.2. Строение активного центра 52
1.5.3. Механизм катализа 56
1.6. Заключение 60
2. Получение системы для синтеза модифицированных нуклеозидов наоснове нуклеозид фосфор ил аз Е. coli. 62
2.1. Клонирование и экспрессия генов нуклеозидфосфорилаз Е. coli 63
2.2. Выделение рекомбинантных ферментов 68
2.3. Определение константы Михаэлиса и константы равновесия рекомбинантных ферментов 71
2.4. Синтез модифицированных нуклеозидов с использованием рекомбинантных ферментов 73
2.4.1. Синтез кладрибина 74
2.4.2. Синтез рибавирина 80
2.4.3. Синтез флударабина 83
3. Материалы и методы 90
3.1. Реактивы 90
3.2. Ферменты 90
3.3. Материалы 91
3.4. Препараты 91
3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды 91
3.6. Бактериальные штаммы 91
3.7. Лабораторное оборудование 92
3.8. Буферы и растворы 92
3.9. Методы 94
3.9.1. Гель-электрофорез 94
3.9.2. Трансформация клеток и отбор рекомбинантов 95
3.9.3. Выделение и очистка ДНК 97
3.9.4. Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сенгера 99
3.9.5.Амплификация ДНК in vitro 100
3.9.6. Молекулярное клонирование 101
3.9.7. Экспрессия генов. Анализ белковых продуктов 101
3.9.8. Выделение и очистка рекомбинантных ферментов 102
3.9.9. Определение кинетических параметров рекомбинантных ферментов 106
3.9.10. Синтез модифицированных нуклеозидов 108
Выводы 110
Введение к работе
В настоящее время в химической и фармацевтической промышленностях находят все более широкое применение энзиматические реакции в качестве альтернативы традиционным методам органической химии.
Одна из таких областей, в которой использование регио- и стереоспецифичности ферментов позволяет избежать многостадийного органического синтеза - это синтез модифицированных нуклеозидов.
В силу своего сходства с природными нуклеозидами модифицированные аналоги могут избирательно ингибировать ферменты нуклеинового обмена, что используется для лечения различных вирусных и раковых заболеваний.
Как правило, для синтеза модифицированных нуклеозидов используют нуклеозидфосфорилазы, выделяемые из бактерии Е. сой, которые обладают низкой субстратной специфичностью. Вопросам строения и механизма катализа этих ферментов посвящен литературный обзор диссертации.
Целью данной работы было получение полиферментных систем на основе рекомбинантных ферментов нуклеозидфосфорилаз (ЫФ) Е. сой и разработка биотехнологических методов синтеза лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, флударабина и рибавирина). Конкретные задачи состояли в следующем: создание штаммов-продуцентов тимидинфосфорилазы (ТФ), уридинфосфорилазы (УФ) и пурин нуклеозидфосфорилазы (ПНФ) Е. coli; выделение и очистка рекомбинантных ферментов; сравнение каталитических параметров рекомбинантных и природных ферментов; - подбор условий синтеза с помощью рекомбинантных ферментов субстанций препаратов на основе модифицированных нуклеозидов -рибавирина, кладрибина и флударабина;
Высокомолекулярные пурин нуклеозидфосфорилазы
Каталитически активная молекула ПНФ Е. coli представляет собой шести-субъединичный белок, который имеет форму уплощенного цилиндра толщиной 60 и диаметром 100 А. Внутренняя полость фермента имеет в диаметре около 20 А и заполнена молекулами воды (рис. 3). Структуру ПНФ Е. coli более правильно описывать как тример димеров, поскольку контакты между субъединицами, образующими димер, являются более плотными по сравнению с контактами между субъединицами, которые принадлежат разным димерам. Природа этих контактов по большей части гидрофобная, хотя присутствуют и водородные связи. Каждый мономер (238 аминокислот) состоит из девяти-цепочечного смешанного Р-листа, окруженного восемью а-спиралями. (З-Лист, в свою очередь, состоит из двух Р" л истов: большого центрального, восьми-цепочечного, и небольшого Р-листа. Активный центр расположен на поверхности каждой субъединицы и доступен растворителю (рис. 4). Один из двух активных центров в димере расположен в верхней части, а другой - в нижней части молекулы фермента, расстояние между которыми составляет около 19 А [28]. Активные центры мономеров, составляющих димер, взаимно обмениваются остатками His4 и Arg43, которые необходимы для формирования активного центра соседнего мономера. Правильнее представлять гексамер как тример ассиметричных димеров. В кристаллической структуре нативной ПНФ Е. coli остатки 214-236 около С-конца во всех шести мономерах образуют длинную а-спираль (спираль Н8 [28], или ос 7 [23]), концевая часть которой обладает большой подвижностью. При анализе кристаллов ПНФ в комплексе с 6-метилформицином было обнаружено, что только в одном мономере каждого димера, за счет образования у-изгиба остатками 220-222, эта спираль сегментирована на две Н8 и Н8 , в другом мономере такой сегментации спирали Н8 не происходит (рис. 5) [29]. В молекуле фермента происходит последовательное чередование мономеров с сегментированной и несегментированной спиралью Н8. На то, что фермент может содержать две разные конформации мономеров, указывали и данные связывания фосфата и нуклеозидных ингибиторов с ПНФ Е. соїі [30, 31]. Спираль Н8 входит в состав активного центра, и если она не сегментирована, то вход в активный центр широко открыт и связанный нуклеозид не образует плотного контакта с ферментом (рис. 5). Поэтому эту конформацию активного центра можно назвать «открытой». В этой конформации помимо фосфата/сульфата и нуклеозида в активном центре может находиться семь молекул воды. Они контактируют как с основанием, так и с остатком сахара и могут легко обмениваться с молекулами растворителя через вход в активный центр.
Образование у-изгиба остатками 220-222 перемещает N-концевую часть (214-219) (Н8) по направлению к активному центру, тогда как более длинная С-концевая часть (223-236) (Н8 ) остается на том же месте. Перемещение N-концевой части приводит к закрытию и сжатию активного центра. Четыре молекулы воды удаляются из него, одна молекула связывается вблизи пентозного остатка, и только краешек шестичленного кольца гетероциклического основания остается доступным растворителю. Эту конформацию активного центра можно назвать «закрытой». Помимо закрытия входа в активный центр и сжатия самого активного центра, сегментация спирали Н8 приводит к перемещению остатки Arg2l7 в активный центр и сближению его на расстояние водородной связи с остатком Asp204. Остаток Arg217 консервативен среди всех ферментов, гомологичных ПНФ Е. coli, поэтому предполагают, что это перемещение играет важную роль в предполагаемом механизме катализа. Образование у-изгиба в спирали Н8 сопряжено с разрывом четырех водородных связей главной цепи (221— 217, 224- 220) и все четыре связи замещаются водородными связями с молекулами воды N-H - Ow. Одна молекула воды образует связи с группами, которые до этого сами были связаны водородной связью. Молекула воды, таким образом, исполняет роль смазки. Открытые и закрытые конформации активного центра наблюдались в кристаллах ПНФ Е. соїі в комплексе с фосфатом, но не нуклеозидом. Это показывает, что переход в закрытую конформацию является результатом связывания только фосфата [29]. 1.2.2. Строение активного центра. Сайт связывания фосфата является наиболее удаленной от поверхности частью активного центра. В состав сайта входят три остатка аргинина Arg24, Arg87, Arg43 с которыми анион фосфата/сульфата образует три солевых мостика. Кроме того, анион образует три водородные связи с азотами главной цепи Gly20, Ser90 и кислородом боковой цепи Ser90. Все кислороды сульфата/фосфата образуют, по крайней мере, пару водородных связей или солевых мостиков с белком. Анион сульфата/фосфата также контактирует с кислородами 0(2 ), 0(3 ) и 0(4 ) пентозного кольца.
В открытой конформации, несмотря на образование солевого мостика с анионом фосфата, боковая цепь Arg24 плохо видна на карте электронных плотностей, что говорит о её подвижности. С этим связана и локальная подвижность аниона, плохая пространственная подгонка и нестабильность всей системы в целом. В закрытой конформации спираль Н8 передвигается по направлению к Arg24, образуется водородная связь между Arg24-NE-H и карбонилом главной цепи Arg217, которая приводит к сжиманию фосфатсвязывающего кармана. Это стабилизирует подвижную боковую цепь Arg24 и связанный анион [29]. Водородные связи, образованные остатком пентозы, идентичны как в закрытой, так и в открытой форме активного центра [28]. Боковая цепь остатка Met 180, консервативного среди всех известных ПНФ, располагается над гидрофобной плоскостью рибозы. Гликозидная связь в связанном нуклеозиде находится в высокой cwH-конформации. Торсионный угол % [C(4)-N(9)-C(l )-0(4 )] находится в диапазоне 100-130. Большая часть сайта связывания основания экспонирована на поверхности, поэтому в сайте наблюдается сеть связанных молекул воды. Гетероциклическое основание и боковые цепи Phel59 и Туг 160 образуют ти-к взаимодействия [28]. 6-Метилформицин А в комплексе с ПНФ Е. coli находится в высокой сш-конформации (торсионный угол СЗ-СГ-С2 -Н2 равен примерно 0). Эта энергетически невыгодная конформация благоприятна для образования переходного состояния (из-за перекрытия орбиталей расщепляемой связи N9-C1 со связью С2 -Н2 ) [32]. Взаимное расположение фосфата/сульфата и рибозы соответствует геометрии предположительного переходного состояния, в котором кислород аниона находится на расстоянии 3.14 - 3.3 А от атома С Г рибозы. Это значит, что при закрытии активного центра конформации связанных субстратов не изменяются. В связи с удалением молекул воды, схема водородных связей в сайте связывания основания различна для разных состояний активного центра (рис. 6). Открытая и закрытая конформации активного центра ПНФ Е. coli были изучены после получения кристаллов ПНФ с 6-метилформицином А. Период между получением кристаллов и сбором данных составил около трех месяцев. В течение этого времени происходила самопроизвольная перегруппировка 6-метилформицин а в Ы7-метилформицин, который в открытых конформациях активного центра вытеснял 6-метилформицин, поскольку при использованном рН обладал большей аффинностью к сайту связывания (рис. 7). В то же время, закрытая конформация препятствовала обмену.
Уридинфосфорилаза
В центре гексамера находится центральный канал диаметром 18 А. Так же как и гексамер ПНФ, гексамер УФ можно рассматривать как тример димеров. Каждый димер содержит два активных сайта. В состав активного сайта входят три аминокислоты (Phe7, His8, Arg48), которые принадлежат соседней субъединице, поэтому димер является минимальной функциональной единицей. Активные сайты мономеров в димере открываются на противоположные стороны гексамера и находятся друг от друга на расстоянии 20 А. Общая четвертичная структура УФ сходна с четвертичной структурой ПНФ Е. coli [23], которая тоже состоит из тримера димеров, где в активный сайт каждого мономера входят два аминокислотных остатка (His4, Arg43), принадлежащих соседней субъединице. Мономер УФ (252 аминокислоты) состоит из центрального 9-ти цепочечного смешанного (3-листа, окруженного семью а-спиралями (рис. 14). УФ и ПНФ Е. coli обладают значительной структурной гомологией: гексамерная четвертичная структура, сходная укладка полипептидной цепи, сходный размер и расположение элементов вторичной структуры [23, 24]. Между укладками элементов вторичных структур мономеров ПНФ и УФ Е. coli наблюдаются минимальные отличия [24], главное из которых находится в области, образованной аминокислотами 165-181 УФ. В ПНФ этой области нет, вместо нее находится короткая последовательность из трех аминокислот 163-165, которые принадлежат петле, соединяющей [37 и а5. В УФ дополнительные 14 аминокислот формируют протяженную петлю, содержащую два последовательных (3-изгиба типа III, которые укладываются на поверхности смежного мономера (рис. 15). Большинство контактов между димерами в гексамере УФ формируются за счет гидрофобных аминокислот. Поверхность контакта между димерами состоит из центральной гидрофобной области, образованной аминокислотами 128-134 обоих димеров. Петлевая область 163-185 содержит несколько остатков, которые вовлечены в полярные взаимодействия между димерами. Если кристаллизация нативной УФ происходила в буфере, содержащем ионы калия, то между мономерами, образующими димер, обнаруживался связанный ион калия (рис. 15). Оказалось, что эти ионы значительно влияют на активность УФ. В их отсутствие активность УФ падает в два раза. Стимулирующий эффект ионов калия объясняется стабилизацией ими закрытой конформации УФ в результате более плотной упаковки мономеров.
Активный центр УФ находится внутри карманоподобной впадины, заключающей в себя три места связывания: для фосфата, для урацила и для рибозы. Схематическое изображение остатков, взаимодействующих с 5-фторуридином и фосфатом в активном центре фермента, показано на рисунке 16. Сайт связывания фосфата имеет форму кармана, который образован тремя остатками аргинина Arg30, Arg48 (принадлежит соседнему мономеру) и Arg91. Каждый остаток образует две водородные связи с атомами кислорода фосфата (рис. 16). Кроме того, водородные связи с фосфатом образуют гидроксил боковой цепи Thr94 и атомы азота в остатках Thr94 и Gly26 главных цепей. Если в активном центре находится рибозо-1-фосфат, то гидроксил З -ОН рибозы образует водородную связь с кислородом ОЗ фосфата. Сравнение сайта связывания фосфата УФ с сайтом ПНФ Е. coli [23] показывает почти идентичное расположение остатков, В ПНФ три остатка аргинина Arg24, Arg43 и Arg87 (соответствуют Arg30, Arg48 и Arg91 УФ), азот Gly20 в главной цепи (Gly26 в УФ) и Ser90 (Thr94 в УФ) и гидроксил боковой цепи Ser90 образуют сайт связывания фосфата. Высокая степень сходства между двумя ферментами обусловлена, по-видимому, эволюционным родством и сходной функцией этих ферментов. Сайт связывания рибозы лежит в УФ между сайтом связывания фосфата и урацила. В сайте связывания рибоза образует сеть водородных связей главным образом с боковыми цепями His8 и Glul98. Как уже было сказано, His8 принадлежит соседнему мономеру, и совместно с молекулой воды образует водородную связь с 5 -гидроксил ом рибозы. Glul98 образует пару водородных связей с 2 - и 3 -гидроксилами рибозы. Эти водородные связи необходимы для правильного расположения рибозы по отношению к фосфату и образованию водородной связи между З -гидроксильной группой рибозы и атомом кислорода ОЗ фосфата (рис. 16). 2 -Гидроксил также образует водородную связь с азотом Metl 97 главной цепи и боковой цепью Arg91. Атом серы боковой цепи Met 197 вдается в сайт связывания рибозы и располагается над плоскостью рибозы. Возможно, это стабилизирует большую гидрофобную область над плоскостью, образованной С2 -С3 -С4 атомами рибозы. Это взаимодействие может также играть важную роль для правильного расположения рибозы в активном центре, поскольку остаток метионина обнаружен у всех ферментов семейства НФ-І [24]. Четыре остатка (His8, Arg91, GluI97 и Metl98), которые образуют водородные связи с рибозой, консервативны среди всех УФ. Сайт связывания рибозы в ПНФ также имеет эквивалентные четыре аминокислоты, образующие сходную схему водородных связей с рибозой [23]. Рибоза в комплексах УФ с различными субстратами находится в различных конформациях: в комплексе с 2 -дезоксиуридином и тимидином рибоза находится в необычной CV-endo ( Е) конформации, в комплексе с 5-фторурацил/рибозо-1-фосфатом в CV-exo (Ej) конформации, 5-фторуридин находится в скрученной конформации OV-endolQ4?-exo ( Т0) [56]. В нативной структуре УФ сайт связывания урадила доступен для молекул растворителя, которые проходят через канал, образованный 05 и р9. Phe7 соседнего мономера сужает этот канал к центру до примерно 2.5 А. Сайт связывания урацила образован остатками Thr95, Gly96, карбонилом главной цепи Туг195 и Glul96 с одной стороны, и Phel62 с другой стороны. Phel62 располагается перпендикулярно к основанию и образует я-стековые взаимодействия с остатком урацила.
Остатки Пе220, Val221, Рго229 и Phe7 (последние две аминокислоты принадлежат соседнему мономеру) образуют гидрофобный карман около 5-ой-позиции урацила. Ключевой остаток в сайте связывания урацила - это Glnl66, который присутствует у всех УФ и участвует в узнавании урацила. Боковая цепь Glnl66 образует две водородные связи с урацилом, азот амида образует связь с 02 урацила, а кислород карбонила с N3 урацила (рис. 16). Карбонил образует еще одну водородную связь с молекулой воды, которая, в свою очередь, образует водородную связь с 04 урацила. Эта ориентация боковой цепи Glul66 помещает азот амидной группы таким образом, что он образует вторую водородную связь с карбонилом главной цепи Thr 161. Предполагают, что УФ и гексамерная ПНФ произошли от одного общего гексамерного предшественника [24]. Как уже было сказано, главное отличие УФ Е. coli от ПНФ Е. colt заключается в дополнительных 14 аминокислотных остатках, находящихся в области 163-185 УФ. Предполагают, что эта вставка является эволюционным приобретением, которая позволила отделиться УФ от древней гексамерной ПНФ. Поскольку эта вставка содержит аминокислоты Glnl66, и Argl68 (играющие ключевую роль в узнавании субстрата), область 163-185 была названа областью, отвечающей за специфичность. Отсутствие этой области в ПНФ приводит к большей доступности сайта связывания основания молекулам растворителя. В ПНФ остатки Ser203 и Asp204 плюс несколько молекул воды образуют водородные связи с пурином [23, 28]. Положение этих остатков в ПНФ соответствует положению Пе220 и Val221 в УФ, которые образуют гидрофобный карман у 5-позиции урацил а (рис. 16). По этой причине схема водородных связей в сайте связывания основания совершенно различна у ПНФ и УФ. Единственное, что остается общим в способе связывания - это л- л взаимодействия между остатком фенилаланина и основанием (Phel59 в ПНФ, Phel62 в УФ), которые консервативны во всем семействе НФ-І. Связывание субстратов происходит, вероятно, как и в ПНФ, в случайной последовательности [48]. При связывании субстрата изменяет конформацию обширная область УФ, включающая части р5, Р6, р7, р9 и N-концевую часть а7. Эта подвижная область содержит подвижную петлю, содержащую остатки 224-230, которые являются частью петли, соединяющей Р9 и а7. Эта часть подвергается наиболее значительному перемещению на расстояние около 10А.
Механизм катализа
Основываясь на структурной информации, предполагаемый механизм фосфоролиза пиримидиновых нуклеозидов сходен с SNI механизмом, предложенным для ПНФ [77], который и заключается в поляризации Nl-СГ гликозидной связи нуклеозида. Способствуют поляризации три главных фактора: 1) связывание нуклеозида в высокоэнергетической конформации (+анти-перипланарный угол гликозидной связи и С4 -ендо конформация сахара); 2) перетекание электронов с гликозидной связи на пиримидиновое кольцо, предположительно на 02 и 04, где они стабилизируются положительно заряженными Argl 68 и Lys 187; 3) результирующий положительный заряд на С1т стабилизируется образованием оксокарбкатиона на 04 , который, в свою очередь, стабилизируется отрицательным зарядом на кислороде 04 фосфата. Поскольку 04 фосфата образует только одну водородную связь (с З ОН, основываясь на изучении моделей) и находится в ближайшем положении к С Г атому рибозы, В ходе изучения ТФ Е. coli было предположено, что связывание фосфата вызывает частичное сближение доменов за счет образования водородной связи между боковой цепью His 119 и карбонильным атомом кислорода главной цепи Gly208 [72]. Образование этой водородной связи вызывает поворот а/р-домена на угол 8. Аналогичная водородная связь наблюдается в обеих субъединицах ПиНФ между Hisll6 и Gly205. Образование этой водородной связи с последующим движением доменов совпадает со связыванием фосфата и упорядочиванием петлевого участка 112-117. Сравнение субъединиц А и В в ПиНФ позволяет предположить механизм движения доменов, запускаемый связыванием субстрата с сайтом связывания пиримидина. В субъединице A Gin 153 невидим на карте электронных плотностей и поэтому, можно предположить, что этот остаток подвижен. В субъединице В, в которой субстрат находится в активном центре, Glnl53 обнаруживается на карте электронных плотностей и образует водородную связь с Asp 161. Образование этой водородной связи, по-видимому, совпадает с образованием р-изгиба остатками 154-157 в петле L2, где водородная связь образуется между карбонильным кислородом Leul57 и азотом главной цепи Thrl54. Два остатка глицина петли L2 Glyl52 и Glyl55, по-видимому, играют важную роль в подвижности этой цепи. Несколько остатков в этой петлевой области (Glyl52, Glnl53 и Aspl61) консервативны среди последовательностей ТФ [76].
Образование Р-изгиба в петле L2 уменьшает длину этой междоменной петли (остатки 152-158) и сближает а- и а/р-домены, как показано на рисунке (рис. 22). Две другие междоменные петли (L1 и L3) расположенные на противоположной стороне активного центра, вероятно, служат пассивными шарнирами при движении доменов. Когда субстрат связывается в сайте связывания пиримидина, боковая цепь Lysl87, по-видимому, меняет конформацию для образования водородной связи с 02 пиримидинового кольца (рис. 22). До связывания субстрата (как в субъединице A), Lysl87 образует солевой мостик с Asp 161. При разрыве этого солевого мостика, Aspl61 может образовать водородную связь с Gin 153. Движение Gin 153 для образования этой водородной связи совпадает с движением L2, необходимым для образования р-изгиба между остатками 154-157. Другое наблюдение, вытекающее из сравнения субъединиц А и В, это -71- л взаимодействия между пиримидиновым кольцом и Тугі 65. При связывании субстрата Тугі65, по-видимому, образует водородные связи с карбонильным кислородом Argl 12 на другой стороне щели, и, возможно, с 5 ОН рибозы. Для осуществления этих взаимодействий боковая цепь Туг 165 должна слегка изменить конформацию. Можно предположить, что это может играть важную роль для облегчения и/или стабилизации движения доменов при связывании пиримидинового кольца. При движении Тугі 65, Leull4 тоже слегка меняет конформацию, при сравнении с субъединицей А, где гидрофобная боковая цепь располагается над ароматическим кольцом Тугі65. Механизм открытия щели, вероятно, начинается с ослабления связи Lysl87-02. После разрыва гликозидной связи протонируется 1-позиция пиримидинового кольца, что приводит к перетеканию заряда с 02 и 04 на первый атом кольца. Это приводит к ослаблению связи между Argl68, Lysl87 и атомами 02 и 04. Боковая цепь Lysl87 может вернуться обратно и образовать солевой мостик с Aspl61, что, соответственно, приводит к разрыву водородной связи Aspl61-Glnl53. Разрыв этой связи, в свою очередь, ослабляет водородную связь, стабилизирующую р-изгиб между остатками 157-154, которая помогает удерживать домены в закрытом состоянии. Другой возможный фактор, способствующий открытию щели -это стерические помехи между продуктом реакции и His82. После атаки фосфата на атом СГ рибозы, расположение His82 возможно мешает выходу из активного сайта рибозо-1-фосфата. Это может заставить боковую цепь His82 изменить конформацию, которая может оттолкнуть боковую цепь Не 184 (на лицевой стороне а-домена) и облегчить открытие щели. 1.6. Заключение. Два семейства ферментов НФ-І и НФ-П имеют совершенно разные аминокислотные последовательности, третичные и четвертичные структуры. Однако, несмотря на это, организация субстратов в активном центре и конформация связанных нуклеозидов в этих двух семействах очень похожи. Кроме того, есть основания предполагать сходство каталитического механизма ТФ, УФ Е. coli и ПНФ млекопитающих. Строение сайтов связывания рибозы (дезоксирибозы) и фосфата, а также аминокислоты, участвующие в связывании фосфата и сахара, похожи во всех трех ферментах. Поэтому нет ничего удивительного в том, что во всех НФ связанный нуклеозид находится в необычной высокоэнергетической конформации, ослабляющей гликозидную связь и облегчающей образование переходного состояния.
Общим для всех ферментов является также образование неспецифических п-к связей с гетероциклическим основанием. Общей чертой, объединяющей УФ и ПНФ, является предоставление соседней субъединицей аминокислот, участвующих в формировании активного центра. Несмотря на сходство активных центров ферментов семейств НФ-І и НФ-П, что, вероятно, обусловлено катализом реакции фосфоролиза, совершенно различная укладка полипептидной цепи говорит скорее о том, что они имеют разное эволюционное происхождение. С другой стороны, структурное сходство ферментов семейства НФ-І, несмотря на различия в аминокислотных последовательностях, скорее всего, говорит о наличии общего эволюционного предшественника. Использование ферментов для синтеза модифицированных нуклеозидов значительно упрощает схему синтеза по сравнению с химическими методами - отпадает необходимость использования защитных групп, не образуются регио- и стерео изомеры, уменьшается количество стадий, значительно увеличивается выход реакций [78-82]. Из-за низкой субстратной специфичности и высокой стабильности для синтеза модифицированных нуклеозидов используются бактериальные НФ, как правило, выделенные из бактерии Е. coli. [83-84]. Помимо НФ, используют ферменты N-дезоксирибозилтрансферазы, получаемые из бактерий рода Lactobacillus, однако их использование ограничено синтезом 2 -дезоксирибо (2 ,3 -дидезоксирибо) модифицированных нуклеозидов [85-90]. Помимо использования выделенных и очищенных НФ, успешно используются НФ в составе целых бактериальных клеток, полученных методами селекции [91-106]. Значительно увеличивает стабильность клеток обработка их глутаральдегидом, после которой клетки могут быть повторно использованы до десяти раз при температуре 50-60С без потери энзиматической активности [96, 107]. Из-за высокой стоимости рибозо-1-фосфата и низкой стабильности этого соединения, в качестве донора рибозы (пентозы) используют какой-либо природный нуклеозид, который сначала фосфорилируется с образованием соответствующего гетероциклического основания и пентозо-1-фосфата, который, в свою очередь, переносится на модифицированный гетероцикл с образованием модифицированного нуклеозида. В общем виде реакция приобретает вид реакции трансгликозилирования. Для этого необходимо присутствие в реакционной среде каталитических количеств неорганического фосфата (рис. 23).
Синтез рибавирина
Синтез рибавирина проводили по схеме, которая включала в себя две обратимые реакции: 1) фосфоролиз гликозидного донора - гуанозина (Guo), в присутствии неорганического фосфата с образованием гуанина (Gua) и рибозо-1-фосфата; 2) гликозилирование последним 1,2,4-триазол-З-карбоксамида (ТКА) с освобождением фосфата и образованием рибавирина (рис. 36). Обе реакции катализирует фермент ПНФ. Как правило, в реакциях гликозилирования в качестве донора рибозы используется пиримидиновый нуклеозид. Это обусловлено тем, что, как показано выше, равновесие реакции фосфоролиза пиримидиновых нуклеозидов значительно меньше смещено в сторону образования нуклеозида, чем при фосфоролизе пуриновых нуклеозидов. Однако в литературе есть ряд успешных примеров использования Guo в качестве донора рибозы для синтеза модифицированных нуклеозидов, так как образующийся после фосфоролиза гуанозина гуанин, из-за низкой растворимости кристаллизуется и смещает равновесие реакции в сторону образования продуктов [94, 97, 122]. Оптимизация реакции синтеза рибавирина была проведена по следующим параметрам: концентрация КН2РО4 буфера; количество добавляемого ферментативного препарата; соотношение субстратов реакции - Guo и ТКА; Эксперименты для определения оптимальной температуры и рН реакции не были проведены, потому что в литературе опубликовано много примеров синтеза рибавирина, в том числе и с использованием целых бактериальных клеток, оптимальная температура реакции в которых была 50-60С, и pH 6.5-7.5 [99-106]. Поэтому все эксперименты были проведены при температуре 50С и рН 7.0. Зависимость выхода рибавирина от концентрации КН2РО4 буфера показана на рисунке 37. Реакционная смесь содержала в объеме 2 мл 10 мМ Guo, 10 мМ ТКА, 18 ед.акт. ПНФ. Так же как и в синтезе кладрибина, при больших избытках фосфата равновесие реакции гликозилирования ТКА смещается в обратную сторону. Поэтому концентрацию КН2РО4 буфера следует использовать не выше 20 мМ. В ходе дальнейших экспериментов было установлено, что оптимальным соотношением субстратов реакции Guo:TKA является отношение 1.5:1, при котором содержание рибавирина в реакционной смеси после установления равновесия достигало 80%. Надо заметить, что увеличение концентрации Guo в реакционной смеси выше 60 мМ при 50С приводило к его кристаллизации.
Полученное в предыдущем эксперименте соотношение GuoiTKA было использовано для определения оптимального количества ПНФ, необходимое для катализа реакции. Реакционная смесь содержала в объеме 2 мл 30 мМ Guo (60 мкмоль) и 20 мМ ТКА (40 мкмоль), 30 мМ КН2Р04 рН 7.0. Из приведенных на рисунке 38 результатов видно, что в этих условиях для достижения равновесного состояния на третьи сутки реакции достаточно 0.42 ед.акт. ПНФ. Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что оптимальными условиями реакции синтеза рибавирина с использованием рекомбинантной ПНФ, следующие: концентрация КН2Р04 буфера эквивалентна концентрации Guo; соотношение Guo: ТКА - 1.5:1; оптимальное количество ПНФ - 0.42 ед.акт. на 60 мкмоль Guo и 40 мкмоль ТКА. В данных условиях на четвертые сутки проведения реакции содержание рибавирина в реакционной среде составило 84%. 2.4.3. Синтез флударабина. Синтез флударабина - предшественника препарата Флудары -осуществлялся по схеме, представленной на рисунке 39. Реакция энзиматического трансгликозилирования, включала в себя следующие равновесные реакции: 1) фосфоролиз гликозидного донора, 1-P-D-арабинофуранозилурацила (Ara-U), в присутствии УФ и неорганического фосфата, с образованием урацила (Ura) и ct-D-арабинофуранозші-І-фосфата (арабинозо-1-фосфата); 2) фосфоролиз донора гетероциклического основания 2-фтораденозина (2F-Ado), в присутствии ПНФ и неорганического фосфата, с образованием 2-фтораденина (2F-Ade) и рибозо-1-фосфата; 3) катализируемое ПНФ гликозилирование 2F-Ade арабинозо-1-фосфатом с высвобождением фосфата и образованием флударабина (F-ara-A). Кроме того, в ходе реакции образуется Urd из Ura и рибозо-1-фосфата. Реакция катализируется УФ. Из-за нестабильности рибозо-1-фосфата, длительное время проведения реакции приводит к полному распаду этого соединения на рибозу и неорганический фосфат.
Из-за очень низкой растворимости 2F-Ade в воде (3 мМ при 50С), в качестве его донора использовали 2F-Ado, растворимость которого при 50С значительно выше — 80 мМ. В ходе проведения реакции образующийся F-ara-A начинал выпадать в осадок, если его концентрация в реакционной смеси достигала 26-30%, тем самым смещая равновесие реакции в сторону образования F-ara-A. Оптимизация условий реакции проводилась по следующим параметрам: температура реакции; количество добавляемых ферментативных препаратов ПНФ и УФ; рН реакционной смеси; соотношение субстратов - 2F-Ado и Ara-U; На основании экспериментов по оптимизации условий синтеза кладрибина и рибавирина, концентрация КН2Р04 буфера во всех экспериментах была равна наибольшей концентрации одного из субстратов. На рисунке 40 показана зависимость скорости синтез F-ara-A от температуры реакции. Реакционная смесь в объеме 3 мл содержала 10 мМ 2F-Ado, 10 мМ Ara-U, 10 мМ КН2Р04, рН 7.0, 30 ед.акт. ПНФ и 35 ед.акт. УФ. Результаты, показанные на диаграмме, были получены после инкубирования реакционной смеси 15 мин. Как видно из приведенной зависимости, скорость синтеза F-ara-A максимальна в диапазоне температур 50-55С. При повышении температуры реакции выше 60С, ферменты начинали денатурировать и выпадать в осадок в виде белого творожистого осадка. Очевидно, что стабильность ферментов при температуре 50-55С обусловлена причинами, которые были уже упомянуты выше для синтеза кладрибина. В таблице 5 представлены данные зависимости содержания F-ara-A в реакционной смеси от количества ед.акт., вносимых в реакцию ферментов за первые сутки реакции. Количество ед.акт ГШФ и УФ было эквивалентным. Так, при отношении ед.акт. НФ/мг субстрата - 3.2 за 1 сутки образовывалось 30 % F-ara-A в смеси, и на вторые сутки начинался процесс его кристаллизации. Уменьшение удельного количества ферментов в 12 раз приводило к образованию всего 8.6 % F-ara-A, время начала кристаллизации по достижению концентрации F-ara-A в реакционной смеси 26-30% увеличивалось до 4 суток.
![Сравнительное изучение процессов стабилизации атомов отдачи азота-13 в системах жидкость-газ, влияние параметров системы. Получение [13N]-аммония](/i/i/4321/49646.png "Сравнительное изучение процессов стабилизации атомов отдачи азота-13 в системах жидкость-газ, влияние параметров системы. Получение [13N]-аммония Федорова Ольга Сталлитовна")
