Введение к работе
Актуальность проблемы. Обмен веществ между организмом и окружающей средой - основная функция эпителиальной ткани как пограничного образования. Некоторые из этих тканей, такие как обонятельная выстилка, ткани респираторного эпителия и другие, непосредственно контактируют с атмосферой и в норме покрыты слизью, которая является первым барьером между ними и окружающим воздухом и, фактически, обеспечивает нормальное функционирование всех тканей дыхательной системы и, следовательно, всего организма в целом.
Для поддержания жизнедеятельности организма через слизь осуществляется транспорт важных веществ, например, кислорода - в респираторном эпителии, пахучих стимулов - в обонятельной выстилке. Но одновременно через этот секрет в эпителий поступают вещества, которые могут быть токсичными для клеток. Действие этих факторов в органах и тканях респираторной системы нейтрализуется путем самоочищения дыхательной поверхности с помощью фагоцитоза, неспецифической бактерицидной защиты органов дыхания радикальными соединениями, генерируемыми активированными фагоцитами, специфической иммунной защитой от инфекционных возбудителей и чужеродных макромолекул, обезвреживанием токсичных веществ и липофильных эндогенных макромолекул. Нарушение работы этих систем является причиной развития многих заболеваний различной этиологии.
Большая физиологическая значимость понимания процессов регулировки
механизмов защиты организма предопределяет интенсивность исследований
самых различных структурно-функциональных аспектов этих систем, в
частности, проводятся работы по поиску и характеризации белковых
регуляторных компонентов обонятельной слизи, называемых (если пользоваться
медицинской терминологией) «белками первой линии защиты». Несмотря на
достигнутый прогресс в этой области в течение последних лет, многие
молекулы, важные для поддержания гомеостаза в органах дыхания, все еще остаются неизвестными, т.к. выделение белковых компонентов в индивидуальном виде и их идентификация имеют свои специфические трудности. Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реально существующих защитных механизмов эпителиальных тканей воздухоносных путей, нормальное функционирование которых представляет собой основу естественной невосприимчивости организма к болезням. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование белков обонятельной выстилки является актуальной проблемой физико-химической биологии.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явился поиск, идентификация и исследование новых белковых компонентов, непосредственно контактирующих с окружающей средой клеток. Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:
1. Разработать методы очистки и выделить в индивидуальном состоянии новые,
ранее неизвестные полипептиды из обонятельной выстилки крысы.
2. Определить частичную аминокислотную последовательность этих
полипептидов и отобрать белки, являющиеся потенциально значимыми для
функционирования эпителиальных тканей.
3. Клонировать структурные гены ранее неизвестных белков и определить их
нуклеотидную последовательность; установить полную аминокислотную
последовательность новых белков и идентифицировать участки цепей природных
продуктов, имеющих посттрансляционные модификации.
-
Создать рекомбинантные аналоги новых белков и изучить особенности их функционирования.
-
Выявить клеточную локализацию новых белков, изучить их функциональную роль в механизмах клеточной защиты эпителиальных тканей.
В ходе данной работы был открыт основной антиоксидант респираторных тканей - l-Cys-содержащий пероксиредоксин (Ргх VI). В связи с этим была поставлена отдельная задача по разработке условий получения высокоактивных генно-инженерных аналогов пероксиредоксина VI человека и сравнения его антиоксидантных свойств с природным белком.
Научная новизна работы. В процессе исследования разработана методика и осуществлено выделение в гомогенном виде двух новых, неописанных ранее белков респираторного эпителия крысы с молекулярными массами 28 и 45 кДа. Впервые установлено, что в слизи обонятельного эпителия в значительных количествах (~2%) присутствует новый тип тиол-специфических пероксидаз и липид-переносящий белок, 8ес14р-подобный белок, несущий в своем составе CRAL/TRIO- или 8ес14р-подобный домен.
На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование к ДНК этих белков. По определенной нуклеотидной последовательности установлена полная первичная структура этих белков, состоящая из 223 и 400 аминокислотных остатков, соответственно. Установлено, что тиол-специфическая пероксидаза принадлежит к семейству пероксиредоксинов VI и в ее составе идентифицирован домен, способный защищать белки от разрушения активными формами кислорода, подобно полноразмерному ферменту. Изучены особенности химического строения Ргх VI и показано, что белок не гликозилирован; отсутствие посттрансляционной модификации имеет важное значение для проявления белком протекторной активности.
Впервые показано, что наибольшая концентрация этих белков обнаруживается в тканях, имеющих непосредственный контакт с атмосферой и больше, чем другие, подверженных воздействию неблагоприятных внешних факторов. На основании полученных данных сделано предположение, что эти белки входят в состав защитных систем эпителиальных тканей и обеспечивают их нормальный контакт с окружающей средой.
Нами установлено, что ключевой посредник сигнальных путей фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат является специфическим липидным лигандом 8ес14р-подобного белка тканей респираторной системы. Доказана
колокализация этих веществ в клетках млекопитающих и выявлено участие липид-связывающего 8ес14р-подобного белка в секреторном процессе. Впервые продемонстрирована транспортная активность 8ес14р-подобного белка млекопитающих и возможность переноса фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата во внеклеточную среду.
Практическая ценность работы. На основе белка пероксиредоксина VI для тканей, контактирующих с внешней средой, предложен принципиально новый специализированный препарат антиоксидантного действия, направленный, в первую очередь, на восстановление ре доке-баланса тканей органов дыхания. В модельных экспериментах на животных показана высокая эффективность действия этого белка на восстановление эпителиальных тканей верхних дыхательных путей. В связи с потенциальной практической важностью Ргх VI на его использование оформлена международная заявка.
Получены высокоактивные генно-инженерные аналоги пероксиредоксина VI человека и осуществлено сравнение их протекторных свойств с природным белком.
В ходе определения липид-связывающей специфичности 8ес14р-подобного белка разработан новый простой и не требующий использования радиоактивных липидов метод изучения липид-белковых взаимодействий. Метод позволяет исследовать транспортную активность белков по отношению к липидному лиганду и в случае, когда тип липидного соединения не известен.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: IV, VII и VIII Чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 1998, 2004 и 2006 гг., соответственно); II Съезде биофизиков России (Москва, 1999 г.); INTAS Симпозиуме «Микробные и клеточные системы для фармакологии, биотехнологии, медицины и экологии» (Москва, 1999 г.); NATO-FEBS Конференции «Белки, липиды и мембранный транспорт» (Франция, Каргез, 1999 г.); X Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Украина, Гурзуф, 2002 г.); 7 Международном симпозиуме «Биомолекулярные структуры» (Великобритания, Шеффилд, 2004); Московской конференции по компьютерной молекулярной биологии, (Москва, 2005 г.); Международной конференции «Новые концепции липидологии» (Нидерланды, Нарвайкерхуд, 2006 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 2 обзорные статьи в книгах, 7 статей в рецензируемых российских журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, 7 статей в иностранных журналах, входящих в систему цитирования Web of Science, и З патента.
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. За исключением биомедицинских исследований по оценке лечебного действия пероксиредоксина VI (выполненных в Институте биофизики клетки под руководством проф., д.б.н. Новоселова В.И.), экспериментальная работа выполнена автором, а также студентами, аспирантами
и сотрудниками (под руководством автора). В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном участии в руководстве при проведении экспериментальной работы, выполнении ряда экспериментов, в обсуждении полученных результатов и оформлении их в виде публикаций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена
на страницах печатного текста и включает в себя рисунков и таблиц.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их
обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой
литературы, состоящего из наименований.
