Введение к работе
Актуальность исследования.
Растительные липиды и их производные являются
мультифункциональными соединениями и принимают участие в биогенезе мембран, дифференцировке клеток, межклеточной и внутриклеточной сигнализации, создании водоотталкивающих и термоизоляционных покровов, защищающих растение от механического повреждения, воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды и проникновения патогенной микрофлоры, а также выполняют запасающую и энергетическую функции. Важную роль в метаболизме липидов у растений и животных играют белки, связывающие липидные молекулы и обеспечивающие их внутри- и внеклеточный транспорт. В растениях обнаружено несколько классов белков, выполняющих разнообразные функции, но обладающих общим свойством -способностью связывать и переносить липиды и их производные. Один из наиболее функционально значимых классов подобных белков составляют липид-транспортирующие белки (Lipid Transfer Proteins или сокращенно LTP).
LTP - небольшие катионные белки, обладающие способностью обратимо связывать и переносить гидрофобные молекулы in vitro. LTP растений относительно стабильны, хорошо растворимы в воде, устойчивы к тепловой и химической денатурации, а также к действию протеолитических ферментов. Данные белки участвуют во многих биологических процессах в растениях, таких как биосинтез кутина, эмбриогенез, адаптация растений к действию стрессогенных факторов окружающей среды. Предполагается, что LTP, подавляющие рост фитопатогенных бактерий и грибов, являются важным элементом защитной системы растений.
Изучение LTP растений представляет большой интерес в связи с возможностью их практического применения в сельскохозяйственной отрасли для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями. Использование методов ротационного земледелия и
традиционной селекции, направленных на получение устойчивых культур, а также применение химических средств защиты растений не всегда оказывается эффективным и не соответствует требованиям экологической безопасности. Одним из перспективных направлений повышения урожайности сельскохозяйственных культур представляется создание трансгенных растений, обладающих устойчивостью к фитопатогенным микроорганизмам и действию разнообразных стрессогенных факторов окружающей среды.
Важной задачей современной фармацевтической биотехнологии является создание новых лекарственных средств, которые должны прийти на смену традиционно используемым лекарственным препаратам, часто характеризующимся немедленным и неконтролируемым высвобождением действующего вещества. Способность растительных LTP связывать и переносить липидные молекулы делает возможным их применение в качестве лиганд-связывающих белков для создания систем доставки лекарственных средств.
Некоторые представители класса LTP являются аллергенами, ответственными за развитие аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важной фундаментальной задачей экспериментальной медицины, решение которой, с одной стороны, обогащает наше представление о причинах и механизмах развития аллергии, с другой стороны, имеет важное прикладное значение. Природные и рекомбинантные растительные аллергены, а также их гипоаллергенные аналоги могут стать основой для создания современных диагностических тест-систем и аллерговакцин, предназначенных для профилактики и лечения аллергических заболеваний.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в поиске, выделении и структурно-функциональном исследовании новых липид-транспортирующих белков
растительного происхождения. В качестве объектов исследования были выбраны распространенные во многих странах, но малоизученные культуры -укроп огородный Anethum graveolens L. [класс - двудольные (Dicotyledones), порядок - зонтикоцветные (Apiales), семейство - зонтичные (Umbelliferae) или сельдереевые (Apiaceae), род - укроп {Anethum L.)] и чечевица обыкновенная Lens culinaris subsp. culinaris [класс - двудольные (Dicotyledones), порядок -бобовоцветные (Fabales), семейство - бобовые (Fabaceae) или мотыльковые (Leguminosae), род - чечевица (Lens)]. Исследования были направлены на поиск, выделение и очистку, изучение структуры и биологической активности растительных липид-транспортирующих белков, а также на разработку биотехнологических способов получения рекомбинантных LTP и их меченных стабильными изотопами аналогов.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
поиск новых липид-транспортирующих белков;
разработка методик их выделения и очистки;
- определение полных аминокислотных последовательностей и структур
кДНК, кодирующих предшественники новых LTP;
создание систем для гетерологичной экспрессии липид-транспортирующих белков;
получение рекомбинантных LTP и их меченных стабильными изотопами аналогов;
структурно-функциональная характеристика выделенных белков.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В ходе проведенной работы выделен новый липид-транспортирующий белок Ag-LTP из листьев и стеблей укропа огородного Anethum graveolens L. Разработаны биотехнологические способы получения рекомбинантных Ag-LTP из укропа огородного Anethum graveolens L. и Lc-LTP2 из чечевицы
обыкновенной Lens culinaris. Проведено сравнительное исследование антимикробной активности Ag-LTP и Lc-LTP2, а также способности этих липид-транспортирующих белков связывать различные липидные молекулы. Получен рекомбинантный аналог Lc-LTP2, тотально меченный стабильным изотопом N, необходимый для установления пространственной структуры липид-транспортирующего белка чечевицы.
Полученные результаты обогащают наше представление о разнообразии растительных липид-транспортирующих белков и могут стать основой для дальнейшего детального изучения молекулярных механизмов их антимикробного действия и образования комплексов с липидными молекулами с целью практического применения в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.
Связь работы с научными программами.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы (соглашение № 8043 от 20.07.2012 г.), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 12-04-01224 и № 13-08-00956) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа У.М.Н.И.К.-2012).
Апробация работы и публикации.
Результаты исследования были представлены на 38-ом конгрессе ФЕБО (Санкт-Петербург, 2013), V, VI и VII Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011, 2013); XXI-XXV зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009-2013); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения
академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); Международной научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), Осеннем финале программы «У.М.Н.И.К.» РАН (Москва, 2012). По теме диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 124 страницах; содержит 18 рисунков и 8 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка, включающего 295 наименований.
