Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. Иммунобиологические свойства и терапевтическая эффективность липосом. 20
2.1. Введение 11
2.2. Структура, физические и физико-химические свойства . 13
2.3. Стабильность липосомных препаратов. 15
2.4. Методы получения липосом. 16
2.5. Иммунохимические и иммуногенные свойства фосфолипидов. 18
2.5.1. Кардиолипин. 20
2.5.2. Фосфатидилинозит. 27
2.5.3. Фосфатидилглицерин. 30
2.5.4. Фосфатидная кислота. 31
2.5.5. Фосфатидилсерин. 33 2.5.6 фосфатидилэтаноламин. 34
2.5.7. Фосфатидилхолин. 37
2.5.8. 1-Алкил-2-ацетил-глицерофосфохолин. 4 6
2.5.9. N-Модифицированный РЕ. 4 8
2.6. Использование липосом в медицине. 52
2.7. Особенности использования липосом в пульмонологии. 73
2.7.1. Взаимодействие липосом с альвеолярными макрофагами. ^5
2.7.2. Взаимодействие липосом с нефагоцитирующими клетками. 77
2.7.3. Взаимодействие липосом с сурфактантнои системой 81
2.8. Заключение. 97
3. Результаты и обсуждения. 100
3.1. Иммунобиологические свойства моносахаридных аналогов липида А.
3.1.1. Иммунохимическая активность синтезированных соединений. 102
3.1.2. Иммуногенные свойства синтетических аналогов. 116
3.1.3. Иммуномодулирующие свойства синтезированных соединений. 121
3.2. Ориентация синтетических аналогов в липосомнои мембране. 12 9
3.3. Взаимодействие иерсинина с флуоресцентными аналогами липида А. 134
3.4. Конформационные рН-зависимые переходы иерсинина. 142
3.5. Спонтанное встраивание иерсинина в липосомный бислой. 147
3.6. Мембранотропные свойства ацилдепсипептидов бацирцинов. 150
3.6.1. Влияние рН на мембранотропные свойства. 151
3.6.2. Определение констант ионизации бацирцина в липосомном бислое. 157
3.7. Эффективность липосомнои формы фенотерола (ЛФФ) в терапии бронхообструкции. 162
3.7.1. Влияние ЛФФ на биомаркеры бронхообструкции. 163
3.7.2. Роль физико-химических параметров липосомнои формы. 169
3.7.3. Участие сурфактантного белка А. 171
4. Экспериментальная часть . 17 6
5. Выводы. 1А9
6. Литература. 133
- Структура, физические и физико-химические свойства
- Иммунобиологические свойства моносахаридных аналогов липида А.
- Экспериментальная часть
Введение к работе
Актуальность проблемы. Более 30 лет прошло с момента открытия спонтанной агрегации фосфолипидов в полностью гидратированном состоянии в замкнутые мембранные оболочки. Дальнейшие исследования показали, что мембрана этих везикул состоит из липидного бислоя, обладающего свойствами полупроницаемого барьера, и замкнутого водного пространства, способного захватывать в момент образования растворенные в водной фазе низко- и высокомолекулярные соединения. Эти везикулы, получившие название липосомы, оказались максимально упрощенной моделью клеточных мембран, и очень скоро стали объектом исследования многих ученых, занимавшихся изучением биологических мембран. С помощью липосом были установлены основные закономерности транспорта веществ через мембрану, показана важная роль фазовых переходов в функционировании мембран, определены молекулярные параметры липидного бислоя и его динамические характеристики, изучены процессы слияния мембран, в реконструированных системах были охарактеризованы индивидуальные мембранные белки и целые белковые ансамбли.
Новый стимул в развитии теоретических и практических исследований вызвало открытие так называемых "невидимых" липосом, несущих на себе нейтральные гидрофильные цепи полиэтиленгликоля и напоминающих гликокаликс клетки без углеводной специфичности. С другой стороны, использование положительно заряженных липосом для переноса высокомолекулярных соединений внутрь клетки позволило открыть новые горизонты по трансфекции клеток, что представляет для биотехнологии особый интерес.
Включение фармакологических препаратов в липидный бислой или во внутреннюю водную фазу липосом может значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат защищен липидным бислоем от действия неблагоприятных факторов, а с другой - липосома служит в качестве депо для токсичного препарата с контролируемой скоростью выхода в окружающее биологическое окружение. Сейчас эффективно разрабатываются новые виды терапии с использованием липосом для переноса ферментов, генетического материала, цитокинов внутрь клетки для коррекции специфического дефицита.
Тот факт, что липосомы не задерживаются такими органами, как сердце,
почки, мозг, а также клетками нервной системы, позволяет за счет
использования липосомных лекарственных форм значительно снизить
кардиотоксичность, нефротоксичность и нейротоксичность
терапевтических препаратов. Кроме того, использование векторных молекул на поверхности липосом, специфичных по отношению к клеткам-
мишеням, позволяет проводить целенаправленную доставку противораковых, противоинфекционных и противовоспалительных препаратов.
Целью настоящей работы является исследование биологически активных соединений различной природы, как низкомолекулярных амфифильных соединений, так и высокомолекулярных - белков, с использованием липосом, уточнение механизма их действия, моделирование процессов иммунного узнавания.
Научная новизна. Впервые были получены серологически активные липосомные антигены и иммуногены на основе тетра- и пентаацильных производных D-глюкозамина 6-фосфата со специфичностью липида А грамотрицательных бактерий. Впервые были синтезированы флуоресцентные зонды со специфичностью липида А и с их помощью исследована ориентация главного интегрального белка порина бактерии Yersinia pseudotuberculosis - иерсинина - в липидном бислое.
С помощью флуоресцентных зондов исследована рН-зависимая конформационная пластичность иерсинина и выяснены оптимальные условия для функционирования этого порообразующего белка.
Выяснена роль физико-химического состояния липодепсипептидов (бацирцинов) в липидной мембране в их рН-зависимом мембранотропном действии. Показано, что в условиях максимальной гемолитической активности бацирцин 5 в липидном бислое находится в моноионизированном состоянии.
Разработана липосомная форма широко применяемого для снятии бронхоспазма р2-агониста - фенотерола - и исследована ее терапевтическая эффективность на экспериментальной модели бронхообструкции у крыс. Найдено, что его токсичность в составе липосом снижена, по крайней мере, в 15 раз по сравнению с его свободной формой.
Исследована роль главного белка легочного сурфактанта (SP-A) в векторной доставке липосом клеткам-мишеням в экспериментах in vitro; в его присутствии терапевтический эффект усиливается в 1.5-2 раза.
Практическая ценность работы. В результате исследования разработаны композиции липосомных иммуногенов и антигенов, полезных для получения антител, реагирующих с природным липидом А, с одной стороны, и способные потенциально блокировать патофизиологические последствия эндотоксического шока, с другой стороны. Полученные флуоресцентные зонды на основе моносахаридных аналогов липида А обладают полезными свойствами для исследования взаимодействия иерсинина с липидами мембраны, для описания его микроокружения.
Водорастворимые иммуностимуляторы на основе 4-
ацилоксибутилфосфатов могут быть использованы как адъюванты лабораторного применения, они способны вызывать как специфическую стимуляцию иммунного ответа, так и неспецифическую, в дозах сравнимых
с природным липидом А. При этом эти соединения не обладают нежелательными эндотоксическими свойствами.
Разработанная липосомная форма фенотерола обладает пониженной токсичностью как минимум в 15 раз по сравнению со свободной его формой. При этом полностью сохраняется его эффективность в снятии бронхоспазма, в подавлении воспалительного процесса.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзной конференции "Липиды биологических мембран" (Ташкент, 1980), XII Менделеевском съезде (Баку, 1981), VII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1982), 16-ой Конференции ФЕБО (Москва, 1984), IV International Conference on Chemistry of Biologically Active Products (Budapest, 1987), International Symposium on Endotoxin (Tokyo, 1988), 10 World Congress on Animal Plant and Microbial Toxin (Singapore, 1991), VI Симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), Conference of International Endotoxin Society (Helsinki, 1994), 3-ем Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), XV Word Congress of Astmology (Montpellier, France, 1996), VII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997), Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), Symposium "EuroCarb 9" (Utrecht, 1997), 2-ом Биофизическом съезде (Москва, 1999)
Публикации результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы 22 статях в таких научных журналах как European J. Biochemistry, Биоорганическая химия, Carbohydrate Res., Experientia, Известия АН СССР, Сер. Хим., Химико-фармакологический ж., Biochimica et Biophysica Acta, Toxicon, а также в трех патентах в патентной литературе России. Кроме того в виде тезисов отдельные части работы опубликованы в материалах Всесоюзных, Российских и международных симпозиумов и конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в котором представлены основные направления использования липосом, 8 глав, посвященных результатам исследования, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает^Упубликации. Диссертация изложена на ZUL стр. машинописного текста, содержит і f-таблиц и IS рисунков. Используемые в работе сокращения: АС4, АС7, АС12 и АС12:1 - ю-2-антрил-бутановая, гептановая, додекановая и додецен-11-овая кислоты; ANS - 8-анилин-1-нафтилсульфо-кислота, Choi - холестерин, CL -кардиолипин, DCP - дицетилфосфат, ЕРС - яичный фосфатидилхолин, LPL
Структура, физические и физико-химические свойства
Как известно, первые липосомы были получены из фосфолипидов [1-2]. По своему химическому строению фосфолипиды амфифильны и способны самопроизвольно образовывать в воде мембраны, которые представляют собой двойной слой липидных молекул (ламеллярную структуру), обычно называемый просто липидным бислоем. В бислое гидрофобные цепи липидных молекул обращены друг к другу и образуют внутреннюю неполярную область мембраны, в то время как их полярные головки находятся на . поверхности мембраны и экранируют углеводородные цепи от контакта с водой. Стремление максимально ограничить контакт неполярных цепей липида с водой приводит к тому, что бислой при его достаточной протяженности замыкается сам на себя, образуя водонаполненые структуры.
Липосомы могут отличаться размерами: от малых липосом с диаметром 25 нм, ограниченных теоретически возможными размерами, до липосом с диаметром 1 мкм и выше, сравнимых по размерам с клетками. Они могут отличаться композицией, балансом поверхностного заряда и структурной организацией (моно-, олиго-и мультиламеллярные везикулы). В зависимости от природы включаемых в липосомы соединений, последние могут быть локализованы в липидном бислое (гидрофобные молекулы) или включены во внутреннюю водную фазу (гидрофильные молекулы).
Свойства липосом и их применение зависят от физических и физико-химических характеристик липосомной мембраны. Эластичность бислоя играет важную роль в устойчивости липосом к механическому воздействию, особенно при их получении. Другое важное свойство липидного бислоя - характеристика их самоорганизованного двойного электрического слоя, определяющего различия их трансмембранного потенциала [61].
Микровязкость липидного бислоя зависит от окружающей температуры и от его физического (фазового) состояния. При повышении температуры мембрана из гелевого состояния с высокоупорядоченными углеводородными цепями переходит к жидкокристаллическому, при котором молекулы обладают повышенной степенью свободы, как латеральной, так и вращательной диффузии [4-5]. Такое переходное состояние характеризуется точкой фазового перехода липидного бислоя (Тс) .
Проницаемость бислоя является другой важной характеристикой липосомных препаратов, которая характеризует скорость проникновения из внутренней фазы включенного водного раствора через бислой во внешнее пространство. Она зависит от микровязкости бислоя и природы включенного раствора. Для гидрофильных соединений она падает в ряду: вода низкомолекулярные неэлектролиты анионы катионы = высокомолекулярные неэлектролиты [61]
Иммунобиологические свойства моносахаридных аналогов липида А.
Исследования липида А из липополисахарида псевдотуберкулезного микроба требовали выявления его важнейших структурных элементов, ответственных за проявление биологической активности. В частности, для изучения иммунохимических свойств были необходимы простые синтетические соединения, моделирующих иммунодетерминантную группу липида А и ее окружения. Синтетический подход позволяет, разнести токсические элементы структуры и группы, ответственные за его полезные иммунобиологические свойства. Это путь к созданию иммуногенов без нежелательных эндотоксических свойств и выход к иммуномодуляторам клинического применения.
Основной задачей нашей работы стало выяснение роли остатков ЖК, ацилирующих гидроксильные группы в молекуле липида А. Для этого был предпринят синтез, с одной стороны, 4-ацилоксибутил-1-фосфатов как амфифильных соединений с эфирами ЖК, специфичных для липида А, а с другой стороны, получение производных глюкозамина как моносахаридных аналогов липида А с различными О-ацильными заместителями. Дополнительно нас интересовало влияние физического состояния исследуемых веществ на проявляемую активность.
Экспериментальная часть
Температуры плавления определяли на приборе Boetius (ГДР), удельное вращение - на поляриметре Perkin-Elmer-141 (США) при 25С, оптическую плотность - спектрофотометре VSU (ГДР), ИК-спектры записывали на спектрофотометре Specord-75 (ГДР), УФ-спектры - на Саггу-214 (Япония). Эксперименты, связанные с измерением флуоресценции, проводили на спектрофлуориметрах Shimadzu RF 54 0 и Hitachi-850 (Япония). 1Н- и 13С-ЯМР спектры снимали на приборах Bruker НХ - 90Е и Bruker - Physik VM-250 (ФРГ) в CDC13 с внутренним стандартом - (CH3)4Si. Радиоактивность образцов, содержащих 1251, измеряли на счетчике Тгасог (США). Для получения липосом использовали ультразвуковой генератор УЗДН - 2Т. Элементный анализ проводили на C,H,N - анализаторе Perkin-Elmer-240 (США). Неорганический фосфор определяли по [348], белок - по модифицированному методу Лоури [348].
ВЭЖХ проводили на приборе Милихром-1 с колонкой Силасорб (5-8 мкм ) при скорости элюента 50 мкл/мин. Детектирование проводили при 250 и 350 нм. Для производных ЖК использовали систему Б, для фосфатов - хлороформ-метанол-вода 65:23:2 (Д). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле L 40/100 мкм (ЧССР), Sephadex LH-20, G-50 и Sepharose CL-4B (Pharmacia, Швеция). Детектирование проводили на диференциальном УФ-детекторе DUV-254 (ЧССР) и Uvicord SD модель 2158 (LKB,Швеция). В работе использовали растворители марки ч.д.а. и х.ч., пиридин и ТГФ высушивали над КОН, перегоняли над Р205 и хранили над молекулярными ситами 3 А. Хлороформенные растворы высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали в вакууме при 25-45С.
Моносахаридные аналоги липида А (1-8) получали по [452], ацилоксибутилфосфаты (11-15) - по [350], АС4, АС7 и АС12 - по
[351]. 2-Антрилпроизводные моносахаридов (9) и (10) по аналогии с пентаацильным аналогом по [452]. АС12:1 любезно предоставлена проф. Молотковским Ю.Г. (ИБХ РАН, Москва), препараты иерсинина -с.н.с. Новиковой О.Д., липид А, кроличья антисыворотка к нему и ЛПС Y. pseudotuberculosis - с.н.с. Красиковой И.Н., образцы бацирцинов - с.н.с. Калиновской Н.И. (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток). Пирен, РС10, ANS, NPN, KI, CsCl, фенотерол получены от фирмы SIGMA (США).
