Введение к работе
Актуальность проблемы. Теломеры - это специализированные ДНК-белковые структуры, локализованные на концах хромосом эукариотических организмов; их основная функция состоит в поддержании стабильности генома. Классический механизм репликации не в состоянии обеспечить синтез конца хромосомы, это приводит к укорочению теломер при каждом раунде деления клетки, дестабилизации генома и сенессенсу. Для предотвращения этих процессов клетка использует различные механизмы, важнейшим из которых является активация теломеразы. Данный фермент представляет сложный РНК-белковый комплекс. Основные компоненты теломеразы - теломеразная каталитическая субъединица (теломеразная обратная транскриптаза, TERT) и теломеразная РНК (TR), в составе которой присутствует небольшой матричный участок, по которому и осуществляется синтез теломерного повтора.
Исследования в области биогенеза теломер позволяют предположить, что отсутствие или низкая активность теломеразы в соматических клетках - одна из причин старения организма. Мутации в теломеразной РНК вызывают дискератоз, а также ассоциированы с некоторыми случаями апластичной анемии, миелодисплазией и диффузным интерстициальным пневмофиброзом. Понимание механизма работы теломеразы и закономерностей регуляции фермента позволит найти новые подходы для лечения этих болезней. Было показано, что теломераза активна в 85% опухолей, а активация теломеразы является одним из первых шагов на пути трансформации клетки в злокачественную, поэтому теломеразный комплекс также является заманчивой мишенью для создания препаратов в области противоопухолевой терапии.
Отсутствие структурных данных для функционального теломеразного комплекса представляет главную проблему на пути изучения фермента и создания эффекторов, влияющих на его активность. Одна из причин - низкая стабильность каталитической субъединицы теломеразы, что не позволяет получить белок в форме, пригодной для структурных и функциональных исследований. Другая проблема - вариабельность теломеразной РНК. Различия в размере (от 150 нуклеотидов в реснитчатых до 2000 нуклеотидов в дрожжах) и нуклеотидном составе зачастую не позволяют выявить структурные элементы, необходимые для работы и регуляции комплекса и затрудняют идентификацию РНК субъединиц теломеразы из новых организмов. Использование термофильных организмов часто более перспективно для структурно-функционального изучения ферментов, так как биологические компоненты - и белки, и нуклеиновые кислоты, имеют более компактную пространственную организацию, что способствует их
стабилизации в растворе. Данная работа посвящена идентификации и изучению особенностей теломеразы в термотолерантных дрожжах Hansenula polymorpha. Цели работы:
Идентификация основных компонентов теломеразы дрожжей Н. polymorpha
Разработка метода выделения каталитической субъединицы теломеразы, пригодной для структурно-функционального изучения комплекса
3. Изучение особенностей функционирования новой теломеразы дрожжей
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе были
идентифицированы основные компоненты теломеразы дрожжей Н. polymorpha -
теломеразная каталитическая субъединица (hpTERT) и теломеразная РНК (hpTER). Высокая
стабильность каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha позволила
разработать метод выделения рекомбинантного белка, пригодного для структурных и
функциональных исследований. Он включает экспрессию каталитической субъединицы
теломеразы с 6His и S-тагами на N-конце белка в E.coli, очистку методами аффинной и
ионообменной хроматографии. Впервые было показано, что в системе in vitro
рекомбинантная каталитическая субъединица теломеразы обладает ограниченной
обратнотранскриптазной активностью.
Идентифицированная в работе теломеразная РНК Н. polymorpha представляет собой одну из самых компактных теломеразных РНК дрожжей, ее длина составляет 824 нуклеотида. Анализ матричного участка теломеразной РНК методами мутагенеза, детекция теломеразной активности Н. polymorpha in vitro и анализ теломер выявили существенное различие в работе теломеразы in vitro и in vivo. Теломераза, выделенная in vitro, использует дополнительный нуклеотид с 5' конца матричного участка (А 170) в реакции обратной транскрипции. Синтезируемый таким образом тимин отсутствует в аннотированной последовательности теломер. Анализ последовательности концов хромосом показал, что нет ни одного случая присутствия тимина в этой позиции in vivo. На основе полученных данных предложена модель регуляции теломеразы на конце хромосомы.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: 361 FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", 25-30 июня, г. Турин, Италия, 2011; международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения», 12-15 апреля, г. Сыктывкар, 2010; CSHL Meetings "Telomeres&Telomerase", 28 апреля-2 мая, Нью-Йорк, США, 2009; Spetsai Summer School "Proteins and their Networks - from specific to global analysis", 7-17 сентября, г. Спеце, Греция, 2009.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 32 рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель включает 137 цитированных работ.
