Введение к работе
Актуальность проблемы. Ганглнояиды- гликосфинголипиды клеточной поверхности, содержащие остатки сиаловой кислоты, участвуют как во взаимодействиях типа клетка — клетка, клетка — вирус, клетка — молекула, так и в функционировании плазматической мембраны. Примером роли ганглиоэидов в функционировании цитоплазматической мембраны может служить модулирование ганглиозидом СМз аутофосфорилирования рецепторов некоторых факторов роста, приводящее к ннгнбированню пролиферации клеток. Рядом авторов проводятся исследования, направленные на изучение действия ганглиозидов, в частности СМз и его производных, в составе лекарственных средств с целью модулирования функций цитоилазматической мембраны клеток, причем результаты, опубликованные различными авторами, отличаются противоречивостью. В то же цремя данные, полученные нами ранее, демонстрируют возможность усиления клеточной пролиферации под дйпетвием ганглиозида СМз из эритроцитов лошади. Это может быть связано с использованием различных типов клеток, концентраций ганглиозида и , что самое главное, с тонкой структурой GM3. Поэтому дальнейшие исследования, направленные на выяснение роли ганглиоэидов в процессах клеточной пролиферации, являются актуальной задачей.
Цель работы. Диссертационная работа посвящена изучению связи структуры ганглиозида СМз из эритроцитов лошади и его способности усиливать пролиферацию клеток.
Научная, новизна работы. При изучении влияния ганглиозида GM3, выделенного из эритроцитов лошади, на пролиферацию гепатоцитов In vivo и in vitro, также как и фи'оробластоа, впервые показано, что происходит увеличение пролиферативной активности. Методами хроматомасс — спектрометрии, ГЖХ, масс - спектрометрии с ионизацией* осколками деления ядер калифорния — 252, ВЭЖХ, ферментативного гидролиза и др. изучена структура этого соединения. Впервые предложено использовать 9 — антрилметиловые зфиры ганглиоэидов в качестве флуоресцентных производных для характеристики состава длинноцепочечных оснований и анализа молекулярных видов. Установлено, что в составе олнгосахаридной части ганглиозида СМз KJ эритроцитов лошади присутствует остаток N — гл^колилнгйраминоной кислоты, а в состав церамида входят, в основном, эйкозасфикгецнн и жирные кислоты 24:1 и 24:0. Синтезированы молекулярные . яиды ганглиозида GM3, содержащие остаток N — ацетил-нейраминовой кислоты - и остатки жирных кислот различной длины, с
*.
помощью которых установлено, что тип остатка нейрамшювой кислоты (NeuAc или NeuGc) не влияет на модулирование г&нглиозидом GM3 пролиферативной активности клеток. ' В то же время показано, что определяющим в способности СМз усиливать росі' клеток является дуина цепи жирной кислоты, входящей в состав церамида.
Разработан новый метод црепаративноії ВЭЖХ ганглиозида GM3 с использованием проточного детектирования ври коротких длинах волн для получения вещества с чистотой не менее 99%.
Практическая ценность. Показана принципиальная возможность использования ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади в составе препаратов, применяемых для усиления пролиферации клеток. Разработан промышленный способ получения' ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади с высокой степенью чистоты и высоким выходом. Данный способ получения ганглиозида GM3 внедрен иа Харьковском предириятии "Биолек", составлен технологический регламент производства и ТУ.
Разработанный метод ВЭЖХ ганглиозида " GM3 с применением непрерывного детектирования при коротких длинах волн использован в условиях производства для анализа и выделения ганглиозида GM3, а также может быть адаптирован для ВЭЖХ других їликосфішголипидов. Основные положення, выносимые на защиту.
Промышленный метод получения ганглиозида СМз "3 эритроцитов
лошади. . *
Изучение структуры ганглиозида СМд, выделенного из эритроцитов лошади, и синтез его молекулярных видов.
Изучение связи структуры ганглиозида GM3 и его способности влиять на пролиферацию клеток.
Апробация работы. Результаты работы доложены на VI съезде фармакологов Украины (г, Харьков, 1990).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, тезисы
1 доклада, получены 1 авторское свидетельство и 1 положительное решение
иа выдачу патента на изобретение. ,,
' \ г-- ' . ' ' -"
Список использованных сокращений: GM3 — NeuAc, Il3NeuAc — LacCer; GM3-NeuGc, H3NeuGc-LacCer; GM3-NeuNH2, H3NeuNH2-LacCer; de—N —ацил—GM3, U3NeuNH2_LacSph; EGF — эпидермяльный фактор роста, FGF — фактор роста фибробластов.
Овъем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора л^тературы.обсуждению результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы. Работа изложена на ___ страницах машинописного
текста, включает схеми, таблиц, рисунков. Список литературы
состоит из ссылок.
Основные результаты работы.
Промышленный метод получения ганглиозида GNfj из эритроцитов
лошади. На первом этапе наших исследований для проведения
экспериментов In vivo с основным ганглиозидрм эритроцитов лошади — ганглиозидом GM3. с целью изучения динамики пролиферативного ответа клеток, дозового эффекта и различных способов введения было необходимо значительное количество вещества. Поэтому в нашу задачу входила разработка препаративного способа получения ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади высокой степени очистки и с максимальным выходом. Известные методы получения ганглиозида GM3 из природных источников отличаются многостадийностью. трудоемкостью и низким выходом.
Предложенный нами метод получения ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади представлен на схемо 1.
На первой стадии эритроцитарную массу обрабатывали 1% — ной СН3СООН д/я удаления пигментов, образующихся при гемолизе. Для полного извлечения гаиглиозидов мы использовали эффективную схему экстракции, разработанную на нашем предприятии для получения гаиглиозидов мозга крупного рогатого скота при непосредственном участии автора данной работи. После обезвожинания и экстракции нейтральных лнпидоа ацетоном сырье обрабатывали смесями хлороформа и метанола, 2:1 и 1:2 (экстракты А и В) и смесью 70 % —ного водного 2—пропанола п гсксана, 4:1 (экстракт С). Использозание пос/едяей смеси 'увеличивало выход GM3 на 40—45 %. Учитывая низкое содержание липидов в сырье, для снижения расхода растворителей мы изучили возможность циклической экстракции эритроцитов указанными смесями и показали, что наиболее эффективным является трехкратвее использование экстрагентов. К объединенным экстрактам А и В прибавляли сконцентрированый в вакууме при температуре не выше 40 С экстракт Си отделяли водно — метанольную фазу, содержащую ганглиознды. Для выделения фракции моносиалоганглиозидов мы использовали ионообменную хроматографию на QAE — сефадсксе. Выбор эгсго сорбента был обусловлен возможностью увеличения нагрузки на колонку в 1.5 раза по сравнению с другими
Технологическая схема кьшелсния ганглиозида GM3
Схема \.
Пнгмекты
| Ліоне, дсщігисптащія, фильтроаакие І 1 АсОН
Нейтральные липвды
Экстракция нейтральных лкгщцов U
Ме2СХ5
CHC13/McOH,l:2tt2;lj
Экстракция фосфолипидо» и ганглкозвдов
ІРгОН/С6Н14/ЮО 55:20:25
О садок
Раствор фосфолипидов Разделение фаз
МсОИДІ20 , 1:1
^1 Водно-мстанольнія фаза ^
Упаривание, осавдекне, фильтрование
MejCX)
Адсорбционная хроматография
снсі3/меон/н2о
Упаривание, осахдекие, фильтрование
Ме2СО
4 Ганглшяид СМЗ-NGe
сорбентами. Элюирование моносяалогаяглноэидов 0.05 М раствором
NH4HCO3 в водном метаноле позволяло легко обессоливать раствор GM3 с
помощью катиоиообменника в Н-*" — форме. Полученную моносиало-
гангляоэидную фракцию упаривали до 5 % исходного объема и осаждали
ацетоном. Это позволило практически полиостью удалить пигменты перед
хроматографированием на колонке с силнкагелем. Элюирование с
силикагеля проводили смесью СНСІ3-МЄОН-Н2О (70:35-.8). Фракции,
содержащие гаиглиозкд СМз (по данным ТСХ), объединяли,
концентрировали в вакууме и осаждали целі.юй продукт ацетоном. Выход
составлял 80—100 мг нэ 1 л эритроцитарной массы. Чистота получаемого
таким способом ганглиозида GM3 была не менее 97 % (по данным
аналитической ВЭЖХ). Препарат не содержал примесей пептидов и
фосфолипидоа в детектируемых количествах (по данным количественного
анализа содержания фосфора и аминокислот). Содержание сиаловой
кислоты (25 %) соответствовало расчетному. Ганглиоэнд GM3 из
эритроцитов лошади содержит остаток N — гликолилнейраминовой кислоты, что было подтверждено нами сравнением при ТСХ подвижности отщепленной с помощью нейраминидазы сиаловой кислоты со стандартами N — ацетил и N — гликолиляейрамниовых кислот.
Для интенсификации контроля чистоты GM3 мы провели модификацию известного метода анализа гангляозидов с помощью ВЭЖХ на колонке с модифицированным амшюпропнльными группами силнкагелем при градиентном элюнрованнн смесью ацетонитрил—фосфатный буфер и детектированием при 215 "м. Нами предложено использовать колонку длиной 150 мм вместо 250 мм. Предложенная в результате проведенных экспериментов методика позволила без потерн эффективности разделения гаиглиозидов сократить в 1.5 раза время анализа и расход растворителей.
Препаративная ВЭЖХ ганглиозида СМд. Для проведения экспериментов на культурах клеток необходимо 10—20 мг вещества с чистотой не менее 99 %. Наиболее эффектипнпм методом получения гаиглиозидов с такой степенью чистоты является препаративная ВЭЖХ. В настоящее время известен ряд методов для препаративной ВЭЖХ гаиглиозидов. однако во всех этих методах для анализа собираемых фракций применяется ТСХ, что связано с невозможностью использования проточного детектирования ганглнезидоп при коротких длинах волн из —за сильного поглощения подвижной фазы. Прямое масштабирование метода, который был,использован нами для аналитической ВЭЖХ гаиглиозидов с
непрерывным контролем поглощения при коротких длинах волн, не приводит к успеху в препаративном варианте вследствие плохой растворимости ганглиозида GM3 в подвижной фазе (MeCN —буфер). Частичная замена ацетоннтрила на метанол, в котором ганглиозиды растворяются значительно лучше, привела к уменьшению коэффициента емкости (к"). В связи с этим в состав подвижной фазы мы ввели компонент с меньшей злюирующей силой — 2-пропанол. Соотношение компонентов подвижной фазы было оптимизировано для полумения максимального выхода СМз за единицу затрачиваемого на разделение времени с требуемой чистотой 99 % . (В данных условиях, на колонке с силікагелем, модифицированным аминопропильными группами, при элюировании смесью МеОН- 2-PrOH-MeCN — 30 mM натрий -фосфатный буфер было с успехом очищено от 1 до 20 мг GM3 —NsuGc. Выход ганглиозида после упаривания и обессоливаиин составлял не менее 96 % по данным количественного определения содержания ошловой кислоты.
Предложенный метод был использован нами для получения GM3— NeuGc непосредственно из моиоендлоганглиоэндной фракции эритроцитов лошади. Гомогенный по данным аналитической ВЭЖХ ганглиозид.СМз (3.1 мг) был получен за 14 минут при расходе 250 мл подвижной фазы (рис. I ). .
Рисунок J. Препаративное разделение методом ВЭЖХ моносиало —
ганглиозидов эритроцитов лошади на колонке Zorbax NH2 (21.4x250 мм).
Подвижная фаза МеОН- 2-РгОН- MeCN-30 mM фосфатный буфер. рН
5.6 (168:84:24:35, об.), Расход 20 мл/мин. Детектирование при 215 )ім.
Поглощение максимального пика принято за 100 %. ..-.'. '
Несколько изменив соотношение компонентов подвижной фазы за счет уменьшения доли воды мы применили разработанный метод для' очистки ганглнозида GM3. содержащего в своем составе остаток N —ацетил — нейрамняовой кислоты.
Полученные нами с помощью предложенного метода препаративной ВЭЖХ ганглиоэиды имели чистоту ие менее 99 % по данным аналитической ВЭЖХ и не содержали детектируемых количеств примесей пептидов и фосфолипидов (рис. 2J. Этот метод позволяет существенно сократить время, затрачиваемое на получение вещества с такои степенью чистоты, и снизить трудоемкость. Предложенная комбинация подвижкой и неподвижной фаз может быть также использована для аналитической хроматографии ганглиозила GM3.
Рисунок 2. Аналитическая ВЭЖХ ганглиозила GM3 на колонке Диасорб 130 NH2- Подвижная фаза МеОН- 2-PrOH- MeCN- 30 мМ фосфатный буфер, рН 5.6 (198:9623:20, об.|, Расход 1.5 мл/мин. Детектирование при 215 ни. A GM3""NeuAc, в GM3-NeuGc. Поглощение максимального пика принято за 100%.
Структура ганглнозида GM3. Строение олигосахарндной части.
В продуктах полного кислотного гидролиза GM3 из эритроцитов лошади нами обнаружены нейтральные моносахариды глюкоза и галактоза. При частичном кислотном гидролиз" отщеплялась сиаловая кислота и
образовывался гликосфииголипид, подвижность которого во результатам ТСХ совпадала с подвижностью стандарта лактоэилцерамида. К аналогичному результату приводил и гидролиз иейраминидаэой из V. cholerae. Сравнение подвижности при ТСХ сиаловои кислоты со стандартами N—ацетил и N—гликолилнейраминовых кислот показало, что в составе' СМз присутствует остаток только N—гликолил иейрамнновоя кислоты. По данным количественного анализа гаиглиознд содержит остатки глюкозы, галактозы и сиаловои кислоты в соотношении 1:1:1.
Положение связей между остатками моносахаридов и последовательность
моносахаридов в ганглиозиде определяли с помощью метилирования. При
ГЖХ продуктов кислотного метанолиза перметнлнроааяного ганглиознда
был обнаружен только один пик производного сиаловои кислоты,
соответствующий стандарту метилового эфира метилкетозида 4,7,0,9—
тетра—О—метил—N — метил — N—(О—метилгликолил)—иейраминовой
кислоты. Следовательно, как и ожидалось, в ганглиозиде остаток N —
гликолилиейраминовой кислоты занимает концевое положение.
Хроматомасс — спектрометрический анализ ацетатов частично
метилированных полиолов, полученных после гидролиза
перметилнрованного ганглиозида, восстановления NaBH4 и последующего ацетилироваиия, показал присутствие 1.3,5—три—О — ацетил—2.4,6—три — О —метил—дульцита и 1,4,5—три—О—ацетил—2,3,6—три—О—метил— сорбита. Следовательно, в ганглиозиде остаток глюкозы замещен в положении 4, а остаток галактозы в положении ,3.
При ГЖХ частично.метилированных ацетатов полиолов, образующихся из перметилнрованного дигексозилцерамида, полученного после гидролиза ганглиозида иейраминидаэой, восстановления и ацетилироваиия, обнаружены пики 1,5—ди—О—Ас— 2,3,4,6—тетра—О—Me—дульцита и 1,4,5—три —О—Ас—2,3,6-трн-С—Me—сорбита. ..'.'
Из приведенных результатов метилирования следует, что олигосахлриднля часть ганглиозида линейна, в начале цепи находится остаток глюкозы, . замещенный по 04 остатком галактозы, которыйv гликознлнрован по ОЗ остатком N — гликолилиейраминовой кислоты.
Для определения конфигурации глякозндных связей нейтральных Сахаров днгексозилцерамид, полученный при' частичном кислотном гидролизе, ацетилировали и окисляли хромовым ангидридом. Глюкоза и галактоза по данным ГЖХ окислялись практически полностью, что свидетельствует о присутствии только Ь—гликозидная связь. Сиаловая кислота присоединена а — кетоэидной связью, что следует из результатов гидролиза
неираминидазой.
Таким образом, структура олигосахаридной части,исходного ганглиозида полностью соответствует структуре ганглиозида GM3 — NeuGc (рис. 3).
соон он
он он ОН
НО"^-<Ц^
НО>~7~^"0-
ОН олигосахаридной
но—/"
частя ганглиозида GM3 из
і'исунок 3. Структура эритроцитов лошади.
Для определения строения липидиой части ганглиозида был проведен его кислотный метанолиз. В продуктах метанолиза с помощью ТСХ были обнаружены метиловые эфиры только неокясленных высших жирных кислот н сфипгении. Состав жирных кислот, которые были выделены после полного кислотного гидролиза СМз твердофазной экстракцией на патроне Об, бил проанализирован с помощью ВЭЖХ в виде флуоресцентных производных (рис. 4), полученных при взаимодействии с монодапсилка\аверином в ДМФА в присутствии конденсирующего агента — 1 — (3—диметиламшю — пропил) — 3—зтилкарбодиимнда (Схема 2).
NMe.
СН (СН )„СООН
DEC
NMe.
Схема 2.
(СН2>5 NHCG(CH,)nCn3
Использование данного реагента пнесто ДЦК, позволило избежать проблем, связанных с плохой растворимостью образующегося произг.одного мочевины и необходимостью дополнительной подготовки пробі.! пород ВЭЖХ. Ках показам! наши исследования, основними кислотами п ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади являются кислоты 24:1 и 24:0 (в сумме 09%).
lILaJi
I Л .,
Рисунок 4. ВЭЖХ монодансилкадаверииовых производных жирных кислот гаиглиознда GM3 из эритроцитов лошади. Колонка— Zorbax ODS, 4.6x250 мм, Подвижная фаза- MeOH-MeCN-2-PrOH ( 63:27:10), расход 1 мл/мин. Флуоресценция максимального пика принята за 100 %.
Характеристика состава сфипгоншовых оснований и молскулярішх типов. Для характеристики состава сфингознновых основании мы исследовали возможность использова! <я ВЭЖХ на обращенной фазе производных ганглиозидов, у которых остатки жирных кислот замещены на остаток уксусной. Поведение при ВЭЖХ на обращенной фазе подобных соединении должно определяться длиной цепи и степенью ненасыщенное ефннгозиновых оснований. X*n увеличения чусгвительности детектирования н снижения влияния на разделение заряда карбоксильной группы нейраминовой кислоты мы предложили использовать 9 — антрнлметнлЬвые эфиры (АМЕ) ганглиозидов, получаемые действием 9 - антрнлднаэометана на карбоксильную группу нейраминовой кислоты (Схема 3). Этот реагент ранее был с успехом применен для модификации карбоксильной группы жирных кислот, но в химии ганглиозидов прежде не использовался.
9—Антрилдиазометан был синтезирован нами окислением гидразона 9 — антрилкарбальдегида оксидом ртути в эфире (Схема 4). Несмотря на то, что нам не удалось выделить в индивидуальном состоянии; ,
Схема 3.
o-'R
/* соон
1. R,= H, R' СНз 2. R= Gal-GalNAc-Lac-SphNAc, R'»CH3
3. R= LacSphNAc. и' = СНз 4. 11= LacCer. R'^Cl^OH
неустойчивый 9 — антрилдиазометаи, возможность применения этою реагента была убедительно доказана при контрольных экспериментах. Как представлено на рисунке 5В, при взаимодействии 9 —антрилдиазометана со стандартом N — ацетнлнейраминовоя кислоты (Схема 3) на ТСХ детектируется только одно флуоресциирующее резорвин — положительное пятно. При ВЭЖХ на колонке с силикага\ем также детектируется, только один пик (рис. 5А). УФ —спектр выделенного эфира непраминовой кислоты соответствовал литературным данным.
Использование этого реагента позволило проводить модификацию ганглнозида п олигосахарндной части в мягких условиях (20С) за короткое время (20 минут) и применить чувствительный метод детектирования по флуоресценции при ТСХ и ВЭЖХ ганглиозидов.
, . Схема 4.
Предварительно нами была исследована, возможность использования подобного подхода на стандартном ганглиозиде GM| из мозга быка. Было показано, что состав молекулярных видов GMj полностью соответствует литературным данным. Анализ тем же методом производного ганглиозида СМ[, в котором остатки жирных кислот заменены ацетильной группой (ipNeuAc—GgOse4SphAc ), показал присутствие двух основных пиков-' *9 % и 40 %), соответствующих сфингенину н эикозасфингенину. и двух
1'исупох 5. 9 —Антрмлмсшловий эфир NeuAc. Л ВЭЖХ, колонка —
Lichrosoib SiSO, rpaA"=mi!(X; злюїірозание. СНСІ3 —МгОН-НгО аг 65:10.0.1
до 65.25:1, расход І мл/їиш. Флуоресценция максимального :jji::.t принята За
100.
В ТСХ, Kicselgol CO. Систем* і><илпоригел«іі СНС!з-Ь5еОН-Н20 (&5.2S:3)
Обнаружение розарпшюпым реагонто». 1— MouAc, 2~ ЛЛШ — NeuAc
минорных (5% и С %), соотвеїстиуіоціїл сфшпмшту n :)і:кеззсфі;і;гакнну (см р:іс ОА ). Получен;пис рсзулі «-ш лироіио корр-ляриічі\іі с длшичі;
литературы.
Подобный подход бил использован нами для анализа состава сфннгознковых оснований в GM3 из эритроцитов лошади. Ках видно из рисунка 6Б, при анализе АМЕ—II3NeuNAc—LacSphNAc детектируется один главный пик (69%) несколько минорных (максимальный не более 8%). При масс—спектрометрии GM3—NeuGc с ионизацией осколками деления ядер калифорния — 252 были обнаружен ион с массовым числом 130в. Исходя из этих данных и данных анализа жирных кислот следует, что главным сфингозиновым основанием являете* эйкозасфингенин. Этот вывод подтверждается результатами ВЭЖХ молекулярных видов AME-GM3 (рис.7).
Тт I
"І ЇН ЇІ ЧК 7« '. Зп
UV UU
V %J АЧ AU ,V
Рисунох в. РЭЖХ 9—антрилметкловых эфиров гонглвозидов при разделении на колонке Lichosorb RP—48, расход 1 мл/мин. A ipNeuAc — GgOse4SphAc, Колонка 3x150 мм. подвижная фаза MeOH-MeCN-r^O. от (35:15:50) до (70:30:0) Б H3NeuAc — LacSphNAc. Колонка 3x300 мм, подвижная фаза МеОН — MeCN — 2 — РгОН (50:24:20). Флуоресценция максимального пика принята за 100%.
16 ,
d?0:1. С 24:1
dZO-Л. С 24:0
d20:1. С Z2.0
^АлА
""J г...[.... у ... !,,.. ,. ,.,,,,,.,,,.,,...,
Рисунок 7. ВЭЖХ АМЕ —GM3—NewGc ори разделении на колодке Uchrosorb RPI8. 4x-j0 мм , подвижная фаза: 10 мни 90- 100 %В, 70 мин 100 %В. А МеОН-MeCN-H20- 2-РгОН (3*15:50:5} В MeOH-MeCN- 2-РгОН (48:40:5), расход 1 мл/мин. Флуоресценция максимального пика принята за 100%.
Таким образом, из результатов установления структуры следует, что церамид ганглиознда GM3 — NeuGc из эритроцитов лошади содержит, в основном, эйкоэасфингенин н кислоты 24:1 и 24:0.
Проведенные исследования позволили нам предположить, что способность ганглиознда СМз из эритроцитов лошади усиливать
пролиферацию гепатоцнтов может быть связана с наличием остатка NeuGc 11 олнгосахаридноб части и/или жирных кислот 24:1, .24:0 і: длинноцепочечного основания 20:1 в составе цсрамида. Поэтому мы посчитали необходимым провести сравнительное изучение биологической активности ганглиознда GM3, отличающегося типом остатка нейраминовой кислоты ^JeuGc или NeuAc) и длиной жкрноккслотной цепи (16:0 и 24:0).
Синтез ганглиознда СМз-NeuAc, содержащего природный набор жирные кислот.
Для выяснения возможной роли типа остатка иейраминовой кислоты мы синтезировали ганглиозид GM3— NeuAc, содержащий природный набор жирных кислот. Для этого исходный ОМз- NeuGc обрабатывали .! М раствором гидроксида тетраметиламмоння в 90 % н —бутаноле при !00 С в течение 4 часов с последующим выделением GM3-- NnuNHj обращенг.о — фазовой хроматографией на колонке с Lichroprep RP'8 при элюировднип
метанолом. Элюированне оС.дэующегося в тех же условиях примесного tie— N-ацил GM3 достигалось смесью метанол—вода (80:20). Селективным fi — ацетнлирован- э остатка нейрамнновой кислоты проводили уксусным ангидридом в смеси метанол-4% NaHC03 (1:1). Полученное соединение рмело время выхода при ВЭЖХ, соответствующее стандарту ганглиоэида (ЇМз-NeuAc. Наличие в составе полученного ганглиоэида остатка только N — ацетилнейрамнновой кислоти било подтверждено сравнением подвижности на ТСХ отщепленной ирн действии фермента сиаловой кислоты со стандартами NeuAc и NeuGc. Состав жирных кислот синтезированного ганглиоэида был по данным ВЭЖХ дансилкадавериновых производных идентичен составу исходного СМз- Никаких существенных изменений не наблюдалось и в составе ефннгозиновых оснований, что было продемонстрировано нами при анализе антрилметилового эфира лизо — ганглиоэида.
Синтез ганглиоэида СМз-NeuAc. содержащего кислоты 16:0 и 24:0.
Для исследования г>гад.улнрования ганглиозидом GM3 пролиферативной активности клеток в зависимости от состава церамнда мы синтезировали соединения, содержащие только короткую (16:0) и только длинную (24:0) (Шслоты, без изменения состава длинноцепочечных оснований прироідного рМз (схема 5).
Для этого исходный гликосфинголипид (I, R = CH20H) гидролизовали 1 М
гидрокендом тетраметиламмония в 90 % н — бутаноле при 100 С. Контроль
состава продуктов реакции по ТСХ показал, что оптимальным является
проведение реакции в течение 10 часов. Удаление основания в пашем случае
достигалось пропусканием разбавленной метанолом реакционной массы
через колонку с AmberUte 1R—120 в Н+— форме. Полученные GM3 —
NeuNHj и cle —N —ацил —GM3 (Н) разделяли обращение —фазовой
хроматографией на кспонке с Uchioprep RP18. Менее гидрофобное целевое
соединение (I!) элюиропали смесью МеОН —Н2О (8:2); а более гидрофобное
соединение GM3""NU'4,H2—.чистым метанолом. Селективное ацилирование
свободной аминогруппы сфингозинового основания соединения (II) жирной
кислотой с необходимой длиной цепи проводили в воде с использованием
конденсирующего . агента— 1 — (3— диметиламинопропил) — 3 —
этилкарбодиимида, В отличие от известного в литературе метода, нами был изменен порядок прибавления реагентов Карбодиимид добавляли к смешанным мипеллам из лизо —ганглиоэида (II) и "жирной кислоты, что позволило избежать проблем нерастворимости
Схема 5,
^^
S"
а. П"14 D. п-22
2 о*
" j DEC/CH3(CK)nCOOH
---^^(CH^InCHj
2 h
111 a-b I AC20/NaHC03
cooh "Vo^T0"
но H >o-^ ^/ hoVJ*— О " nh-"
IV а. п*14 Ь. Г.-22
последней и , в конечном итоге, увеличить выход (особенно в случае ^ кислотой 24:0). При данном способе мы не наблюдали также сколько -* нибудь заметного образования продуктов О —ацилироваиия, что исключи^ необходимость проведения стадии щелочной обработки. Свободную аминогруппу выделенного обращеннофазовой хроматографией соеднненвд (III) избирательно ацетилировалч действием AC2O в смеси МеОН —4 < NaHC03 в Н2О (1:1). Выход ганглиозида GM3 (IV а,б), содержащего
cirj/рлеленную жирную кисло-'у, составлял 19 %.
Структура полученных соединений была подтверждена методами ВЭЖХ
и масс — спектрометрии с ионизацией осколками деления ядер
калифорния — 252. Так, при ВЭЖХ на колонке с модифицированным
аминопропильными труппами силикагелем синтезированные ганглнозиды
(IV а,б) имели времена удерживания, совпадающие со временем
удерживания стандарта GM3 —Nev.\c. При анализе состава жирных кислот
в виде даисилкадлвериновых производных было показано, что
синтезированные липиды содержат только одну жирную кислоту (16:0 или
24:0, соответственно). Состав сфингоэиновых оснований,
проанализированный в виде АМЕ лнзо--ганглиозидов, соответствовал природному. В масс — спектре были зарегистрированы ионы с массовыми числами llgO (d20:l + 16:0) и 12.92 420:1 + 24:0), что полностью отвечает предлагаемой структуре.
Исследования влияния СА1ч на промкЬераиию клеток.
Опыты проводились как в экспериментах in vivo- при двух моделях повреждений печени крыс: частичной гепатэктомии и терк.гчески индуцированного гепатита, так н in vitro— на культурах гепатоцитов и фибробластов.
Ранее было показано, что после хирургического удаления части печени гепатоцнты начинают интенсивно пролиферировать, причем максимум включения радиоактивной метки в ядра клеток наблюдается через 24 часа после операции. Увеличение пролнферативной активности гепатоцитов было продемонстрировано и, d случае с термически индуцированным гепатитом. Введение ганглнозида СМз из эритроцитов лошади приводило к увеличению включения |^Н] — тимидина в ядра клеток печени крыс с гепатэктомией через 24 часа (рис. 8В). Увеличение пролиферативной'.активности клеток было обнаружено и для модели с гепатитом, причем динамика включения метки была подобна контрольной, оставаясь все время на более высоком уровне (рис. 8А).
Для подтверждения результатов экспериментов In vivo и для выяснения возможной роли типа остатка нейраминовой кислоты (NeuAc или NeuGc) мы провели исследование влияния ганглиозидов GM3 — NeuGc и GM3 — NeuAc на пролиферацию гепатоцитов в первичной культуре. Были использованы вещества с чистотой не менее 99 % . Как показано на рисунке 9, пролиферация гепатоцитов стимулировалась при инкубировании клеток с СМз ПРИ различных концентрациях вне зависимости от типа остатка нейраминовой кислоты.
1 -*- йяірол 2
OO-NGc
rJ-i
і г j 4
Рисунок 8. Влияние-ганглиозида GM3—NeuGc из эри-фоцитов лошади на пролиферацию гепатоцитов In vivo. А—Гепатит, В— Гепатэхтомия (через 24 часа); 1-контроль, 2 —общие липиды эритроцитов лошади, 3-GM3 — NeuGc, 4 - суммарные гангллозиды мозга КРС.
Для того, чтобы выяснить, влияет ли тин клеток на характер изменения
пролиферации под действием ганглиозида СМд, вместо гепатоцитов,
пролиферация которых индуцируется и контролируется ростовым
фахтором, отличным от EGF и FGF, мы провели исследования на
перевиваемой линия фибробластов мыши. Эксперименты проводили при
двух типах инкубирования клеток с ганглиозидом: трехчасовое
иякуби) ование клеток однодневное культури (аналогично опытам с первичной культурой гепатоцитов, вариант А), и культивирование клеток в среде, содержащей гакглиозид (аналогично опытам других авторов, париант Б). Нами было показано, что GM3—NeuGc способен усиливать пролиферацию фибробластов при обоих типах инкубирования (рнс. 10).
В следующей группе экспериментов мы изучали влияние на пролиферацию клеток ганглиозида GM3 —NeuAc, содержащего определенную жирную кислоту (16:0 и 24:0). Полученные данные позволяют считать, что GM3, содержащий более длинную жирную кислоту, способен усиливать пролиферацию фибробластов, a GM3, в состав церамида
0.0-
париант А
Премії (дни)
| _я~ 7.5 нкг/м-1 - **— Контроль
О.в
вариант Б
4 L»
Время (дни)
--*— 7.5 мкг/кл
Контроль
исунок 10. Влияние ганглиозиДа GM3 —NeuGc на пролиферацию ибробластов. А Инкубирование клеток с ганглиозидом в течении 3 часов. Б обавление ганглиозидов в культуральную среду. Результаты представлены ж средние значения двух независимых экспериментов по 8 лунок на )чку. С) Различие с контролем статистически достоверна (р<0.05).
которого входит кислота 16:0 не обладает таким эффектом.
Концентрация (мкг/мл)
I | ОМЭ-ИОС ^ GM3+IAC
Рисунок 9. Влияние ганглиознда СМз "а про.\иферацию геиатоцнтов In vitro.
Выводы.
-
Разработай промышленный метод получения ганглиознда GM3 из эритроцитов лошади с высокой степенью чистоты и высоким выходом.
-
Предложен экспресс —метод д\я препаративной ВЭЖХ ганглиознда GM3 с применением непрерывного детектирования ври коротких длинах волн.
-
Изучена структура ганглиознда GM3~NeuGc из эритроцитов лошади и уста ювлено, что в составе церамида присутствуют, в основном, эйкозасфингенин и жирные кислоты 24:1 и 24:0.
-
Впервые предложено использование Э — атрилметнловых эфиров ганглиозидов в качестве флуоресцентных производных для анализа молекулярных видов и характеристики состава длинноцепочечных оснований методом ВЭЖХ.
Ь. Синтезированы гашлиознди типа GM3 — МеиЛс с исходным набором длинноцепочечных оснований, содержащие , как первоначальный набор жирных кислот, так и заранее заданны.! (16:0 и 24.0).
-
Впервые показано, чч ганглиозид GM3 из эритроцитов лошади способен усиливать пролиферацию клеток как In vitro, так и In vivo: при модельных повре—дениях печени у животных: частичной гепатэктомии и при индуцированном гепатите.
-
В тестах воздействия на пролиферативную активность клеток изучена зависимость между биологической активностью ганглиозида GM3 и его структурой. Показано, что на пролиферацию клеток не влияет тип остатка нейрамнновой кислоты (NeuGc или NeuAc). В то же время показано, что длина цепи жирной кислоты определяет способность СМз усиливать пролиферацию клеток.
