Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 9
2.1. Биологически активные соединения морских грибов 9
2.2. Жирные кислоты и их производные 12
2.3. Терпеноиды 12
2.4. Поликетиды и производные шикимовой кислоты 15
2.5. Меротерпеноиды 34
2.6. Алкалоиды 36
2.7. Пептиды 57
2.8. Некоторые заключения 63
3. Обсуждение результатов 65
3.1. Скрининг 65
3.2. Установление строения индивидуальных соединений из грибаIsariafelina КММ4639 65
3.3. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus carneus 90
3.4. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Myceliophthora lutea 97
3.5. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus versicolor КММ4647 104
3.6. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Curvularia inaequalis 109
3.7 Установление строения индивидуальных соединений из гриба Wardomyces inflatus 113
3.8. Установление строения индивидуальных соединений из грибаPenicillium citrinum 116
3.9. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Acremonium roseum 118
3.10 Биологическая активность выделенных соединений 119
4. Экспериментальная часть 124
4.1. Приборы и оборудование 124
4.2. Хроматография 124
4.3. Биологический материал 125
4.4. Выделение соединений из гриба Isariafelina КММ 4639 127
4.5. Выделение соединений из гриба Aspergillus carneus 136
4.6. Выделение соединений из грибаMyceliophthora lutea 138
4.7. Выделение соединений из гриба Aspergillus versicolor КММ 4647 141
4.8. Выделение соединений из гриба Curvularia inaequalis 143
4.9. Выделение соединений из гриба Wardomyces inflatus 144
4.10. Выделение соединений из гриба Penicillium citrinum 146
4.11. Выделение соединений из гриба Acremonium roseum 146
4.12. Определение биологической активности выделенных соединений 148
4.12.1. Определение цитотоксической активности и действия на формирование и рост колоний опухолевых клеток T-47D, SK-Mel-5, SK-Mel-28, ТНР-1 и HL-60 148
4.12.2. Определение цитотоксической активности и способности усиливать экспрессию белка Hsp70 в клетках асцитной карциномы Эрлиха 149
4.12.3. Определение цитотоксической активности в отношении спленоцитов мышей 150
4.12.4. Определение гемолитической активности в отношении эритроцитов мышей 150
4.12.5. Определение антимикробной активности 150
4.12.6. Определение токсичности в отношении сперматозоидов морских ежей 151
4.12.7. Определение токсичности в отношении оплодотворенных яйцеклеток морских ежей 151
5. Выводы 153
6. Список цитируемой литературы
- Жирные кислоты и их производные
- Поликетиды и производные шикимовой кислоты
- Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus versicolor КММ4647
- Выделение соединений из гриба Wardomyces inflatus
Жирные кислоты и их производные
Новый циклопентенон триходерон (149) синтезировался грибом Trichoderma sp., изолированным из донных осадков в Южно-Китайском море [90]. Соединение проявило цитотоксичность против шести различных опухолевых клеточных линий (А549, NCI-H460, MCF-7, MDA-MB-435s, HeLa, DU-145) с ИК50 от 43 до 164 мкМ, тогда как в эксперименте с нормальными фибробластами легких человека ИК5о была более 7 мМ. Морфологические изменения, произошедшие в клетках А549 при инкубации с триходероном свидетельствовали о возможном апоптотическом механизме цитотоксического действия.
Пересечение главных путей вторичного метаболизма (мевалонатного, полиацетатного и шикиматного) приводит к меротерпеноидам, соединениям смешанного биогенеза. Меротерпениоды, образованные в результате сочетания терпениод-ной и поликетидной единиц относят к поликетид-терпеноидным. Неполикетидная группа меротерпеноидов образуется при соединении шикимата и терпена. При этом к меротерпеноидам часто не относят пренилированные ароматические соединения, подобно описанным в предыдущей главе поликетидам 77 и 78 [34, 91].
Три новых меротерпеноида спиродитерпеноидного типа, бревионы F-H (150-152) продуцировались баротолерантным грибом Penicillium sp., который был выделен из грунта собранного на глубине около 5 км в восточной части Тихого океана. Абсолютная конфигурация соединений 150 и 152 была определена с использовани 35 ем метода Мошера и подверждена для бревиона Н (152) рентгеноструктурным анализом его (S)-MTPA-3(f Hpa. Соединение 150 ингибировало репликацию вируса иммунодефицита человека в клетках С8166 (ИК5о 14.7 мкМ) [92]. Предлагаемая авторами схема биосинтеза подобных соединений включает присоединение геранилге-ранильного фрагмента к триацетатному предшественнику. Несмотря на структурное сходство с бревионами А-Е, ранее выделенными из наземного Penicillium brevicompactum [93-94], и с соединениями 150 и 151, бревион Н имеет уникальный ранее не описанный скелет, образованный, по-видимому, в результате окислительной циклизации бревиона G (151).
Последующее изучение этого штамма привело к выделению еще трех бревиа-новых меротерпеноидов - бревионов I-K (153-155) - в дополнение к вышеописанному тритерпену 25 [32]. Бревион I (153) проявил умеренную цитотоксическое действие на клетки MCF7 с ИК50 7.4 мкМ. Из изолята гриба P. commune - продуцента комазафилонов 92-97 - при культивировании на рисовой среде кроме сесквитерпена 9 был также выделен меротер-пеноид фарнезилорселлинатного происхождения 3-деацетилцитреогибридонол (156) [23]. Соединение не проявило ингибирующего действия на Candida albicans, Bacillus subtilis, метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и P. fluorescens до концентрации 256 мкг/мл.
Дриман-содержащие меротерпеноидные метаболиты пурпурогемутантин (157) и пурпурогемутантидин (158) продуцировались штаммом Penicillium purpurogenum, выделенным из грунта, собранного в Бохайском заливе (Китай) и подвергнутым мутагенезу действием диэтилсульфата. Предполагается, что оба со единения биосинтетически образуются из фарнезилированного гентизилового спирта [95]. Соединение 158 проявило цитотоксическую активность против клеток HL-60 и К562 (ИК5о 2.5 и 0.9 мкМ). Стоит отметить, что другой группе китайских исследователей при изучении гриба Penicillium sp., изолированного из глубоковод ного образца грунта в северном районе Южно-Китайского моря, удалось выделить соединение пенициллиумин А с формулой идентичной пурпурогемутантидину (158) [96]. К сожалению, авторы не установили абсолютную структуру пеницил лиумина, но отличие в величинах углов удельного оптического вращения для этих соединений может указывать на их стереоизомерность.
Одной из особенностей вторичного метаболизма грибов, выделенных из морских грунтов, является биогенез разнообразных азотсодержащих соединений, которые составляют более трети новых соединений из этих грибов, выделенных в последние годы. Большинство из них могут быть отнесены к алкалоидам и дикетопи-перазинам. Глиотоксин (159) - широко известный представитель класса эпиполитиодиок-сопиперазиновых грибных метаболитов, обладающий широким спектром биоактивности. Интерес к глиотоксину угас вследствие обнаружения токсичности in vivo, что резко ограничивало его химиотерапевтический потенциал. Однако интенсивность исследований глиотоксина и его аналогов вновь выросла после открытия его селективной токсичности в отношении клеток кроветворной и иммунной систем, а также показана способность вызывать апоптоз нескольких типов клеток (макрофаги, тимоциты, апленоциты и фибробласты) [97-98]. Гриб Aspergillus fumigatus из морских донных осадков бухты Цзяочжоу в Желтом море (Китай) наряду с глиотоксином (159) и рядом известных тиосоединений продуцировал новый аналог глиотоксина (160) [99]. Исследование цитотоксической активности выделенных соединений в отношении клеток мышиной карциномы показало важную роль дисульфидного мостика в обеспечении биоактивности глиотоксина и его аналогов.
Дальнейшее изучение этого грибного штамма привело к выделению N-гидроксилированных глиокладридов А (167) и В (168). Оба соединения проявляли питотоксичность в отношении раковых клеток линий HL-60 и U937 с ИК50 11.6-19.9 мкМ, что на порядок выше, чем у соединения 165. Вероятно, решающее значение в уменьшении активности имеет окисление одного из атомов азота [103].
Три новых соединения, w-гидроксифенопиррозин (169) и два эпимерных дике-топиперазина 170 и 171, были выделены из гриба Chromocleista sp., изолированного из образца грунта, собранного в Мексиканском заливе. Абсолютная конфигурация единственного хирального центра 169 была установлена с помощью PC А, а для дикетопиперазинов 170 и 171 - анализом геминальных и вицинальных констант ЯМР JHH и сравнением их с аналогичными соединениями [104].
Еще два новых глиотоксин-подобных дикетопиперазина бис-(детио)-10а-метилтио-За-деокси-3,За-дигидроглиотоксин (172) и 6-деокси-5а,6-дидегидро-глиотоксин (173) синтезировались штаммом Penicillium sp. (грунт, бухта Суруга, Япония) [105]. Оба соединения проявили цитотоксическую активность в отношении клеток Р388 (мышиная лейкемия), причем дисульфид-содержащий метаболит оказался почти на два порядка более активен (ИК5о 58 нМ), что подтверждает ключевую роль полисульфидного мостика в проявлении цитотоксичности производными глиотоксина.
Дикетопиперазиновый дисульфид деоксиапоаранотин (174) продуцировался грибом Aspergillus versicolor, изолированным из донных осадков, собранных в Японском море у берегов Южной Кореи [106]. Совместно с соединением 174 были выделены ранее не известные для морских организмов ацетилапоаранотин (175) и ацетиларанотин (176) [107]. Все три выделенных соединения, подобно глиотоксину (159), относятся к классу эпиполитиодиоксопиперазинов, которые благодаря своим дисульфидным мостикам могут инактивировать белки и генерировать реактивный кислород [108]. Соединения 174-176 индуцировали апоптоз в клетках НСТ116 (рак кишечника человека). Ацетилапоаранотин (175) в опытах in vivo ингибировал рост опухоли НСТ116 у мышей, проявив при этом меньшую острую токсичность по сравнению с веществом сравнения цисплатином.
Структурный аналог соединения 176 альтернарозин А (177) был получен из галотолерантного штамма Alternaria raphani, также продуцировавшего церебрози-ды 4-6. Абсолютная конфигурация стереоцентров альтернарозина была определена РСА его ацетатного производного. Алкалоид проявил антимикробную активность в отношении Escherichia coli, Bacillus subtilis и Candida albicans с МИК 203, 203 и 406 мкМ, соответственно [20].
Новые дикетопиперазиновые алкалоиды пренилциклотрипростатин В (178), 9-гидроксифумитреморгин С (179), 20-гидроксициклотрипростатин В (180), 6-гидрокситрипростатин В (181) и спироглиотоксин (182) были выделены китайскими исследователями в 2012 году из гриба Aspergillus fumigatus, изолированного из ила прибрежной зоны Бохайского залива (Желтое море, Китай) [109]. Соединения 178 и 180 ингибировали рост клеток U937 (моноцитной лимфомы человека) с ИК5о 25.3 и 18.2 мкМ. Следует отметить, что 20-гидроксициклотрипростатин В (180) в течение этого же года был опубликован двумя другими китайскими группами как новый метаболит еще двух аспергиллов - циклотрипростатин Е из A. sydowii (гор-гонария, Хайнань, Китай) [ПО] и 123-гидрокси-13а-метоксиверрукулоген TR-2 из наземного A. fumigatus (кора Melia azedarach) [111]. MeO
Гриб Aspergillus versicolor, изолированный из образца донных осадков Бохай-ского залива (Желтое море, Китай), продуцировал димерный дикетопиперазин бре-вианамид S (183), а также мономерные бревианамиды T-V (184-186) [112]. Бре-вианамид S - второй пример выделения димерных дикетопиперазинов после бре-вианамида J, ранее выделенного из другого штамма У! versicolor [113]. Соединение 183 проявило селективную ингибирующую активность в отношении бациллы Кальметта-Герена (ослабленного штамма возбудителя бычьего туберкулеза Mycobacterium bovis).
Новые алкалоиды мелеагрины В (188) и С (189), а также рокфортины F (191) и G (192) были выделены из глубоководного изолята гриба Penicillium sp., продуцирующего дитерпеноиды 12-17 [27]. Соединения 188 и 189 являются продуктами биосинтетического присоединения Михаэля, соответственно, дитерпена и пре-нильного остатка к имидазольному кольцу мелеагрина (187), впервые описанному в P. meleagrinum [114]. Дикетопиперазины 191 и 192 являются N-производными рокфортина С (190). Рокфортин С, биосинтетический предшественник как рокфор-тиновой, так и мелеагриновой групп алкалоидов [115], является обычным микоток-сином многих видов рода Penicillium [116]. Широкий спектр биологической активности рокфортина С связывают с его способностью к ингибированию белков группы цитохрома Р450 [117]. Из четырех новых мелеагринов и рокфортинов только мелеагрин В показал умеренную токсичность в отношении опухолевых клеток А549, MOLT-4, BEL-7402 и HL-60 с ИК50 1.8 - 6.7 мкМ.
Поликетиды и производные шикимовой кислоты
Новые алкалоиды, плектосфаэровые кислоты А-С (199-201) были обнаружены в этилацетатном экстракте гриба Plectosphaerella cucumerina, выделенного из донных осадков тихоокеанского шельфа Баркли Саунд (Британская Колумбия, Канада) [122]. Эти соединения структурно близки ранее описанным антибиотикам вертициллинам из наземного гриба Verticillium sp. (базидиомицет Coltricia cinnamomea, Япония), а также лептозинам, выделенным из гриба Leptosphaeria sp. (бурая водоросль Sargassum tortile, бухта Танабе, Япония) [123-124]. Биогенетически соединения 199-201 образуются из четырех триптофановых и одной сериновой или аланиновой единицы. Примечательно, что остатки триптофана участвуют в трех кардинально отличающихся путях биосинтеза, приводящих к финальной структуре. К примеру, центральный фрагмент образован триптофаном, сформировавшим пептидные связи с остатком серина/аланина, что дает модифицированное дикетопиперазиновое ядро. Частичная деградация интермедиата подобного центральному тетрациклическому фрагменту, вероятно, приводит к образованию ин-дольного фрагмента. Катаболическая деградация триптофана через кинурениновый путь дает две 3-гидроксиантранилатных единицы, которые подвергаются окислительному взаимодействию с образованием трициклического феноксазинонового фрагмента плектосфаэровых кислот [123, 125-126]. Все три соединения ингибиро-вали индоламино-2,3-диоксигеназу (ИДО), являющуюся перспективной молекулярной мишенью при исследовании потенциальных агентов противоопухолевой терапии [127]. Стоит отметить, что также выделенный из этого гриба известный метаболит Т988А (202) в этом исследовании не проявил какой-либо значимой активности, тогда как синтезированная авторами циннабариновая кислота ингибиро-вала ИДО в концентрациях сравнимых с плектосфаэровыми кислотами (ИК5о 2 мкМ). Таким образом, содержащийся в структурах плектосфаэровых кислот феноксазиноновый фрагмент представляет собой новый фармакофор, обеспечивающий ингибирование ИДО.
Соединение 202, а также два его новых аналога, лютеоальбузины А (203) и В (204), были выделены из гриба Acrostalagmus luteoalbus, изолированного из глубоководных донных осадков, собранных на глубине 2.8 км в северной части Южно-Китайского моря [128]. Для всех трех выделенных соединений показан мощный цитотоксический эффект в отношении опухолевых клеток линий SF-268, MCF-7, NCI-H460, HepG-2 с ИК5о 0.2-5.6 мкМ. При этом активность обоих лютеоальбузи-нов оказалась в 2-5 раз выше известного аналога 202 и на порядок выше активности цисплатина.
Из гриба Penicillium janthinellum, изолированного из образца грунта, собранного в Амурском заливе (Японское море), были получены три новых алкалоида -шеаринины D-F (205-207) [129-130]. Эпимеры 205 и 206 являются 22-гидроксипроизводными известного шеаринина А, ранее выделенного из наземного почвенного гриба Eupenicillium shearii (Кот-д Ивуар) [131]. Шеаринины близки по структуре янтитремам, треморгенным микотоксинам гриба Penicillium janthinellum [132]. Шеаринины Е и F индуцировали апоптоз клеток меланомы человека (HL-60), шеаринин F также показал потенциальный канцерпревентивный эффект, ингиби-руя EGF-индуцированную злокачественную трансформацию мышиных клеток JB6 Р+ С1 41 в концентрации 13 мкМ [129]. В параллельном исследовании китайско-немецкой группы был изучен гриб Penicillium sp. (стебель мангрового растения Aegiceras corniculatum, Китай), из которого также были выделены соединения 205 и 207, последнее из которых получило название шеаринин К. В этом исследовании была показана высокая способность шеаринина D (205) блокировать активность Са-активированных калиевых каналов [133].
Гриб Spicaria elegans, выделенный из донных осадков залива Цзяочжоу, оказался продуцентом новых цитохалазинов Z7-Z9 (208-210). Эти соединения являются редким примером цитохалазинов с 12-членным лактонным циклом [134]. После 47 дующее исследование этого гриба привело к открытию цитохалазинов Zi0-Zi5 (211-216), представляющих собой первые природные цитохалазиновые производные с восьмиуглеродной боковой цепью вместо обычных 11 - 14-членных макроциклов [135]. Соединения 208-212 показали цитотоксичность к опухолевым клеткам линии А549 с ИК50 4.3-21.0 мкМ.
При культивировании на модифицированной питательной среде, содержащей соевую муку, этот же штамм гриба Spicaria elegans синтезировал еще шесть новых соединений: новый спикохалазин А (217) с уникальной пентациклической структурой и аспохалазины M-Q (218-222). Показано, что спикохалазин А и аспохалазин М проявляют цитотоксическое действие на клетки HL-60 с ИК5о 19.9 и 20 мкМ, соответственно [136].
В ходе дальнейших исследований этот гриб был обработан ингибитором ци-тохрома Р-450 метирапоном, что привело к образованию дегидроксилированных предшественников цитохалазинов Z7 (208) и Z9 (210) 7-деоксицитохалазина Z7 (223) и 7-деоксицитохалазина Z9 (224). На основании полученых результатов [137], а также литературных данных [138-139] авторы предположили, что ключевую роль в окислении положения 7 цитохалазинов играет цитохром Р-450. К сожалению, осталась неясной роль цитохром Р-450 зависимой монооксигеназы в окислении положения 9 цитохалазинов. Ранее предполагалось большое значение этого фермента для катализа окисления Байера-Виллигера, в ходе которого может окисляться атом С-9 [140-141].
Гриб Aspergillus sp., изолированный из донных осадков, собранных в Корейском проливе у города Пусана (Южная Корея), продуцировал четыре новых алкалоида: оксепин-содержащие пиразинпиримидины протубоксепины А (233) и В (234) и дикетопиперазины протубонины А (235) и В (236) [145]. Плоская структура протубонина В ранее была опубликована в патенте [146], но абсолютная конфигурация его стереоцентров определена корейскими учеными впервые. Протубоксе-пин А (233) показал слабую цитотоксичность в отношении клеточных линий HL-60, MDA-MB-231, НерЗВ, 3Y1 и К562 (ИК50 75 - 250 мкМ).
Повторное исследование этого изолята позволило выделить новые хинолино-новые производные афлахинолоны C-G (237-241) [147]. Соединения проявили слабое цитотоксическое действие на клетки К562, B16F10, HL-60, MDA-MB-231 и НерЗВ с ИК50 80 мкМ. лОН
Дополнительные исследования штамма A. carbonarius, продуцировавшего ди-мерные нафто-у-пироны 63 и 64, привели к выделению нового у-пирона карбонарона А (242) и родственного а-пиридона карбонарона В (243). Оба соединения проявили избирательную антипролиферативную активность в отношении клеток линии К562 (ИК5о 56.0 и 27.8 мкМ). Следует отметить, что бензилзамещенные у-пироны ранее из природных источников не выделялись [148].
Алкалоид пеницинолин Е (244) с редким для природных соединений пирро-лил-4-хинолиноновым скелетом продуцировался грибом Penicillium sp. (грунт, залив Цзяочжоу, Желтое море, Китай) [149]. Авторами показано, что отсутствие карбоксильной группы в положении 3 пеницинолина Е по сравнению с известными аналогами приводит к резкому уменьшению цитотоксичности соединения в отношении ряда линий опухолевых клеток.
P. citrinum, изолированный из грунта, собранного у острова Ланкви (Китай) продуцировал эпимерные тумоновые кислоты К (245) и L (246) [150]. Следует отметить, что ранее тумоновые кислоты выделялись только из цианобактерий. OMe
Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus versicolor КММ4647
Предполагаемый путь биосинтеза Ранее было показано, что многие грибные бензофураны образуются из орто-пренилированных фенолов, которые могут являться продуктами как шикиматного, так и полиацетатного пути биосинтеза [34, 194-195]. Мы предполагаем, что в случае оксирапентинов орто-пренилированный фенольный предшественник і-l окисляется и пренилируется с образованием дипренилгидрохинона і-2. Модификация одного из пренильных остатков происходит через окисленный интермедиат і-3, который под действием дегидрогеназы (DHG) и ацетиленазы превращается в метил-бутенинильную боковую цепь і-4. Хиноновое производное і-5, полученное ИЗ І-4, подвергается окислению монооксигеназой (MOG) с образованием триэпоксида і-6. Гидролиз эпоксида боковой цепи в i-7 с последующей циклизацией в пирановый цикл приводит к образованию оксирапентинового скелета в i-8 [196]. Ацилирова-ние кетона i-8 приводит к оксирапентину А (323), а восстановление дает оксирапентин Е (316), который при при ацилировании образует оксирапентин В (313), а при селективном гидролизе эпоксидгидролазой (EHL) и ацилировании - оксирапентин J (321). Гидролиз обоих эпоксидных циклов оксирапентина Е через менее устойчивый карбокатион при С-8 приводит к полиолу і-9. В результате ацилирова-ния і-9 по 4-ОН, 6-ОН или 8-ОН с дальнейшей циклизацией ацетата на две других гидроксильных группы образуется оксирапентин D (315). Согласно нашему предположению, последовательное действие EHL и редуктазы на эпоксид при С-7-С-8 в i-8 приводит к интермедиату i-10, боковая цепь которого после гидратации тройной связи циклизуется на гидроксил при С-6 с образованием оксирапентина К (322) (рис. 15).
Предшественником оксирапентина К равновероятно может выступать пероксид і-ll, образующийся при действии диоксигеназы (DOG) на двойную связь С-7-С-8 (рис. 16). Оксирапентины с z/иодиолами при С-7 и С-8 могут быть образованы действием редуктазы на пероксид в і-ll. Образующийся при этом оксирапентин G (318) является прямым предшественником оксирапентинов F (317) и I (320), а гидролиз EHL эпоксида оксирапентина F приводит к образованию оксирапентина Н (319). o-o
Образование оксирапентина С (314) также предполагается из предшественника і-1, окисление которого происходит в opwo-положение (относительно имеющегося гидроксила) с образованием дипренилированного о-резорцина і-12. Образование метилбутенинильной боковой цепи происходит сходным с описанным на рис. 15 путем. Кето-таутамер і-14 под действием EHL превращается в триэпоксид і-15, который после частичного восстановления редуктазой дает диол і-16. Гидролиз і 16 EHL с образованием фуранового кольца А и дальнейшее ацилирование приводит к образованию оксирапентина С (рис. 17). Бензопирановое производное акремин S (326) очевидно имеет общий с окси-рапентинами предшественник i-l, который при метилировании в wapa-положение к гидроксильнои группе и дальнейшем окислении дает промежуточное производное i-18. Это производное в свою очередь окисляется MOG до интермедиата i-19. EHL расщепляет одну из связей эпоксида с образованием карбокатиона циклизующего-ся в пятичленное кольцо на гидроксильную группу. Дальнейшее дегидрирование приводит к акремину S (рис. 18).
Образование поликетидов подобных исарикетидам А и В подробно описано в литературе [34]. В случае исарикетидов предшественником видимо является линейный пентаацетат i-20, метилирующийся по 6 положению. Декарбоксилирование i-21 приводит к симметричному тетракетону i-22, который подвергается окислению по метильным группам с образованием карбоновой кислоты і-23. В результате восстановления двух карбонильных групп и дегидратации полученного тетраола i-24 образуется непредельная кислота i-25. Ее енольный таутомер i-26 окисляется мо-нооксигеназой до эпоксида i-27. Гидролиз эпоксида эпоксидгидролазой инициирует перегруппировку [34], приводящую к образованию дикарбоновой кислоты i-28. Дегидратация i-28 происходит с образованием дигидропиранового цикла. Метилирование карбоксильных групп в i-29 приводит к исарикетиду В, а дополнительное ацилирование - к исарикетиду А (рис. 19).
Из гриба A. carneus были получены три новых соединения - варатерпол В (329), глицерилдиорциновая кислота (330) и декумбенон D (331). Совместо с ними также были выделены семь известных соединений - декумбенон В (332), версиол (333), этилаверантин (334), 6,8-диметилаверуфин (335), стеригматоцистин (336), аверсин (337) и радиклоновая кислота (338).
Брутто-формула соединения 329 была определена как С15Н20О5 на основании пика HRESIMS 281.1391 ([М-Н]+), а также подтверждена данными 13С ЯМР. Спектр Н ЯМР соединения 329 содержит сигналы тризамещенного бензольного кольца (8н 7.24, 7.35, 7.42), девяти алифатических протонов (8н 103, 1.15, 1.36, 1.40, 1.51, 1.78, 1.95, 3.25, 3.34) и двух метильных групп (8Н 0,82, 1.59). Данные 13С ЯМР указывают на наличие двух метильных (8с 16.9, 28.8) и четырех метиленовых (5с 22.5, 34.6, 43.7, 68.4) групп, одного sp -гибридизованного метинового атома углерода (5С 36.8), трех метиновых (5С 118.6, 121.5, 127.6) и трех четвертичных ароматических атома углерода (5с 133.2, 137.3, 156.8), оксигенированного четвертичного атома углерода (5с 77.9) и карбоксильной группы (5с 171.3).
Выделение соединений из гриба Wardomyces inflatus
По окончании культивирования мицелий гриба вместе со средой дважды экстрагировали этилацетатом (0.2 л). Экстракт концентрировали в вакууме, полученный сухой остаток (0.5 г) растворяли в системе этанол-вода (1:4, 25 мл) и последовательно экстрагировали гексаном (3x25 мл), этилацетатом (3x25 мл) и н-бутанолом (2x25 мл). Этилацетатный экстракт упаривали досуха, остаток (163 мг) хроматографировали на колонке с силикагелем (1.5x10 см) в системе гексан-этилацетат (ступенчатый градиент, 1:0—»0:1).
Фракцию, элюированную системой гексан-ЕЮАс, 85:15 (20.6 мг), делили на колонке с сефадексом LH-20 (1x60 см) в системе СНСІ3-ЕЮН (1:1) и методом ВЭЖХ на колонке Supelco Discovery С18 в системе метанол-вода (55:45). В результате получили соединения 313 (5.4 мг), 316 (6.7 мг) и 317 (5.2 мг).
Другую фракцию, также элюированную системой гексан-ЕЮАс, 85:15 (24.8 мг), делили на колонке с сефадексом LH-20 (1x60 см) в системе СНС13-ЕЮН (1:1). В результате получили смесь (1 мг) соединений 313, 316 и 324. Рехроматография одной из фракций, элюированных на сефадексе LH-20, на колонке с силикагелем (1x20 см) в системе гексан-ЕЮАс (ступенчатый градиент, 1:0—»72.5:27.5) привела к выделению соединения 325 (2.6 мг, система гексан-ЕЮАс, 72.5:27.5).
Получение (S)- и (7?)-МТРА-эфиров оксирапентина В (313). К раствору ок-сирапентина В (2 мг) в пиридине добавили несколько кристаллов 4-диметиламинопиридина (ДМАП) и (і?)-МТРА-С1 (20 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. После упаривания растворителя остаток хроматографировали на колонке с Si02 (гексан-ЕЮАс, 95:5). Получили 2.5 мг (5 МТРА-эфира (313а). (Я)-МТРА-эфир (313Ь) (2.6 мг) синтезировали сходным образом, используя (5)-МТРА-С1.
Получение (S)- и (7?)-МТРА-эфиров оксирапентина F (317). К раствору оксирапентина F (2 мг) в пиридине добавили несколько кристаллов 4-диметиламинопиридина (ДМАП) и (і?)-МТРА-С1 (20 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 45 мин при комнатной температуре. Продукты реакции хро-матографировали на колонке с Si02 в системе гексан-ЕЮАс (90:10) получили 1.4 мг (5)-МТРА эфир (317а). ( )-МТРА-эфир (317Ь) (1.0 мг) синтезировали таким же способом, используя (5)-МТРА-С1.
Получение (S)- и (7?)-МТРА-эфиров оксирапентина К (322). К раствору ок-сирапентина К (1 мг) в пиридине добавили несколько кристаллов 4-диметиламинопиридина (ДМАП) и (і?)-МТРА-С1 (15 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученный (5)-МТРА-эфир (322а) хроматографировали на колонке с Si02 в системе гексан-ЕЮАс (85:15). ( )-МТРА-эфир (322Ь) синтезировали таким же способом, используя (5)-МТРА-С1. Получили 0.30 мг соединения 322а и 0.65 мг соединения 322Ь.
Бесцветный кристалл был выращен из системы н-гексан-ЕЮАс. Кристаллографические данные: С18Н2з065; Mr 343.36; Т = 173(1) К; длина волны 0.71073 А (Мока); моноклинная сингония; пространственная группа С2; параметры элементарной яйчейки а = 20.4238(8) А, Ъ = 10.9328(4) А, с = 7.9989(3) А, р = 98.231(2); объем 1767.67(12) A3; Z = 4; Dca\c = 1.290 мг/м3; коэффициент поглощения 0.098 мм" l; F(000) = 732; размеры кристалла: 0.35 х 0.25 х 0.10 мм; число измеренных отра 135 жений: 8624; число независимых отражений: 2147 [i?(int) ) 0.0218]. Полные кристаллографические данные оксирапентина В (313), включая координаты атомов, длины связей и величины углов, температурные параметры и дополнительные детали эксперимента депонированы в Кембриджском центре кристаллографических данных (CCDC 828131).
Кристаллографические данные для оксирапентина Н (319). Бесцветный кристалл был выращен из EtOAc. Кристаллографические данные: С18Н2б08; Mr 370.39; Т = 140(2) К; длина волны 0.71073 А; моноклинная сингония; пространственная группа Р2\, параметры элементарной яйчейки а = 9.9116(2) А, Ъ = 7.0940(1) А, с = 26.0972(5) А, р = 94.539(1); объем 1829.21(6) A3; Z = 4; Dcalc = 1.345 Mg/m3; коэффициент поглощения 0.106 mm"1; F(000) = 792; размеры кристалла: 0.36 х 0.29 х 0.18 мм; число измеренных отражений: 41996; число независимых отражений: 6809 [i?(int) ) 0.0213]. Полные кристаллографические данные оксирапентина Н, включая координаты атомов, длины связей и величины углов, температурные параметры и дополнительные детали эксперимента депонированы в Кембриджском центре кристаллографических данных (CCDC 974425).
Кристаллографические данные для оксирапентина А (323). Бесцветный кристалл был выращен из системы н-гексан-ЕЮАс. Кристаллографичекие данные: Сі8Н2оОб;Мг 332.34; Т= 173(1) К; длина волны 0.71073 А; тригональная сингония; пространственная группа Р3221; параметры элементарной яйчейки а = 11.0033(4) А, с = 24.7496(10) А; объем 2595.04(10) A3; Z = 6; са1с = 1.276 мг/м3; коэффициент поглощения 0.096 mm"1; F(000) = 1056; размеры кристалла: 0.40 х 0.30 х 0.25 мм; число измеренных отражений: 25404; число независимых отражений: 2083 [i?(int)) 0.0247]. Полные кристаллографические данные оксирапентина А, включая координаты атомов, длины связей и величины углов, температурные параметры и дополнительные детали эксперимента депонированы в Кембриджском центре кристаллографических данных (CCDC 828130).
Получение ацетатов оксирапентинов В (313) и Е (316). Вещества 313 и 316 (по 5 мг) растворили в пиридине (1 мл), добавили Ас20 (по 0.2 мл) и оставили на ночь при комнатной температуре. Реакционные смеси концентрировали в вакууме. В результате получили соединение 316а (по 5 мг из каждого оксирапентина).
По окончании культивирования мицелий гриба вместе со средой дважды экстрагировали этилацетатом (2.0 л). Экстракт концентрировали в вакууме, полученный сухой остаток (1.5 г) растворяли в системе этанол-вода (1:4, 0.15 л) и последовательно экстрагировали гексаном (3x0.15 л), этилацетатом (3x0.15 л) и н-бутанолом (2x0.15 л). Этилацетатный экстракт упаривали досуха, остаток (0.7 г) хроматографировали на колонке с силикагелем (2x10 см) в системе гексан-этилацетат (ступенчатый градиент, 1:0—»0:1).
Фракцию, элюированную системой гексан-ЕЮАс, 95:5 (135.3 мг), делили на колонке с сефадексом LH-20 (1x60 см) в системе СНСІ3-ЕЮН (1:1), на колонке с силикагелем (1x20 см) в системе гексан-ЕЮАс (95:5), а также методом препаративной ТСХ в системе толуол-изопропанол (9:4). В результате получили соединения 333 (10.2 мг), 334 (4.2 мг), 335 (1.3 мг) и 336 (21.7 мг).
Фракцию, элюированную системой гексан-ЕЮАс, 90:10 (79.0 мг), делили методом ВЭЖХ на колонке Supelco Discovery С18 в системе метанол-вода (80:20). В результате получили соединения 330 (3.1 мг), 331 (1.5 мг) и 332 (10.0 мг).
Фракцию, элюированную системой гексан-ЕЮАс, 85:15 (63 мг), делили методом ВЭЖХ на колонке Supelco Discovery С18 в системе метанол-вода (60:40). В результате получили соединения 337 (5.8 мг) и 338 (6.6 мг).
Фракцию, элюированную системой гексан-ЕЮАс, 67:33 (14.3 мг), делили на колонке с сефадексом LH-20 (1x60 см) в системе СНСІ3-ЕЮН (1:1), а также методом препаративной ТСХ в системе толуол-изопропанол (2:3). В результате получили соединение 329 (1.4 мг).
