Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Ферментные системы метаболизма ксенобиотиков 12
1.2. Экспериментальные методы исследования метаболизма лекарств 15
1.3. Компьютерные методы исследования ферментов биотрансформации 20
1.3.1. Модели, основанные на структуре лигандов 20
1.3.2. Получение трехмерных структур цитохромов Р450 20
1.3.3. Описание взаимодействия белков и лигандов 21
1.3.4. Применение QSAR методов для предсказания биотрансформации 23
1.3.5. Компьютерные программы для моделирования взаимодействия лигандов с цитохромами Р450 24
1.3.6. Квантовохимические модели окисления под воздействием цитохрома Р450 26
1.3.7. Базы данных биотрансформации 28
1.3.8. Экспертные системы для предсказания метаболизма 29
1.3.9. ДСМ метод 36
1.4. Основные цитохромы Р450, ответственные за метаболизм лекарств в организме человека и их компьютерное исследование 38
1.4.1. Цитохром Р450 ЗА4
1.4.2. Цитохром Р450 2С9 42
1.4.3. Цитохром Р450 2С19 43
1.4.4. Цитохром Р450 2D6 45
1.4.5. Цитохром Р450 1А2 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1. Программный комплекс ISIS BASE, ISIS DRAW, ISIS HOST 50
2.2. База данных Symyx Metabolite Database 51
2.3. База знаний Cytochrome P450 Knowledgebase (CPK) 52
2.4. База данных Metabolism V 2002.1 52
2.5. Литературные источники информации 53
2.6. Программа PASS 53
2.7. Программа METAPREDICT 54
2.8. Программа МОРАС 6.0 57
2.9. Поле сил Tripos 59
2.10. Методы оценки точности прогноза 60
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Создание баз данных о метаболизме ксенобиотиков 62
3.1.1. БД по взаимодействию ксенобиотиков с цитохромами Р450 62
3.1.2. БД биотрансформации 63
3.2. Прогноз субстратов, ингибиторов и индукторов цитохромов Р450 65
3.2.1. Обучающая выборка 65
3.2.2. Обучение компьютерной программы PASS 66
3.2.3. Тестовая выборка для оценки предсказательной способности 69 PASS
3.2.4. Тестирование предсказательной способности алгоритмов 69 PASS
3.3. Построение и верификация прогноза сайтов P450CARBONOX 72
3.3.1. Унифицированный способ записи биотрансформации P450CARBONOX 72
3.3.2. Подготовка выборок P450CARBONOX 78
3.3.3. Выборки для прогнозирования сайтов P450CARBONOX 80
3.3.4. Обучение компьютерной программы METAPREDICT 80
3.3.5. Тестовые выборки для верификации прогноза сайтов 81 P450CARBONOX
3.3.6. Верификация прогноза сайтов P450CARBONOX 82
3.4. Сопоставление статистического и квантовохимических методов прогноза ароматического гидроксилирования 85
3.4.1. Обучающая выборка для программы METAPREDICT
3.4.2. Квантовохимические модели 86
3.4.3. Тестовые выборки для сравнения с квантовохимическими моделями 86
3.4.4. Сопоставление точности прогноза с помощью различных моделей 87
3.5. Прогноз взаимодействия ксенобиотиков с цитохромом Р450 ЗА4 98
Выводы 109
Список опубликованных работ 111
Список литературы 114
Приложение 130
- Компьютерные программы для моделирования взаимодействия лигандов с цитохромами Р450
- Основные цитохромы Р450, ответственные за метаболизм лекарств в организме человека и их компьютерное исследование
- Сопоставление статистического и квантовохимических методов прогноза ароматического гидроксилирования
- Сопоставление точности прогноза с помощью различных моделей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Многие ксенобиотики, включая лекарства, подвергаются биотрансформации в организме человека. Информация о метаболитах лекарственных препаратов чрезвычайно важна, поскольку их биологическая активность, токсичность и биодоступность могут значительно отличаться от таковых у исходных веществ. Такая информация также используется при создании пролекарств с целью оптимизации фармакокинетических параметров исходной субстанции и фармакодинамических характеристик активного метаболита.
В организме человека лекарства метаболизируются несколькими ферментными системами, основной из которых является суперсемейство цитохромов Р450 (Archakov А., Degtyarenko К., 1993). Около 75% лекарств метаболизируется питохромами Р450, в основном ЗА4, 2С9, 2С19, 2D6 и 1А2 (Williams J. et al, 2004). Эти ферменты осуществляют: ароматическое гидроксилирование, алифатическое гидроксилирование, N-деалкилирование, N-деметилирование, С-окисление с образованием альдегидов, кетонов, карбоновых кислот, О-деалкилирование, О-деметилирование, разрыв сложноэфирной связи, дегалогенирование (Guengerich F., 2001). Общим этапом перечисленных типов биотрансформации является окисление атома углерода субстрата цитохромом Р450 (сокращенно P450CARBONOX, от англ. Р450 carbon oxidation). Данные типы биотрансформации в совокупности составляют около 70% реакций, катализируемых указанными выше цитохромми Р450; поэтому предсказание реакций биотрансформации, проходящих через этап P450CARBONOX является важной задачей для прогнозирования метаболитов. Многие ксенобиотики являются субстратами нескольких цитохромов Р450. Под воздействием одного и того же цитохрома субстраты могут подвергаться одной или более реакциям; в то же время некоторые из реакций биотрансформации осуществляются более чем одним цитохромом и, напротив, некоторые реакции являются уникальными для конкретной изоформы. Поэтому особый интерес представляет прогноз биотрансформации ксенобиотиков под воздействием различных цитохромов Р450 человека.
Исследование указанных выше пяти изоформ цитохрома Р450 важно для оценки возможных межлекарственных взаимодействий из-за проявления ксенобиотиками ингибирующей и индуцирующей активности по отношению к цитохромам, поскольку одновременный прием пациентами нескольких препаратов может приводить к усилению либо ослаблению ожидаемых фармакологических эффектов (Hansten P. et al, 2006).
Экспериментальное исследование метаболизма ксенобиотиков и межлекарственного взаимодействия является дорогостоящим и трудоемким (Wang J. et al, 2007). Компьютерные методы позволяют прогнозировать биотрансформацию для многих тысяч химических структур, в том числе виртуальных, еще не синтезированных. Для
прогнозирования взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450 предложено много подходов, различающиеся используемыми описаниями молекул и реакций, и математическими методами, включая ДСМ-метод (Джон Стюарт Миль) (Финн В.К., 2009), MetaDrag (Ekins S. et al, 2005), MetaSite (Craciani G. et al, 2005), CATABOL (Jaworska J. et al, 2002), COMPACT (Lewis D. et al, 2001), TIMES, МЕТА, METEOR, MetabolExpert (Kulkarni S. et al, 2003) и др.
Ю.В. Бородиной, А.В. Рудик с соавторами, была предложена методика предсказания биотрансформации ксенобиотиков по структурным формулам с использованием MNA (Multilevel Neighborhood of Atom, дескрипторы многоуровневых атомных окрестностей) и RMNA (Reacting Multilevel Neighborhood of Atom, дескрипторы многоуровневых атомных окрестностей реакций) дескрипторов (Borodina Yu. et al, 2003, 2004; Рудик A., 2007) на основе алгоритмов программы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances). Однако в этих работах не реализовано прогнозирование взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450 человека, прогноз биотрансформаций не учитывал видовую и ферментную специфичность, а прогноз метаболитов осуществлялся только для четырех типов биотрансформации.
Цель работы: реализовать компьютерный прогноз взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450 человека в качестве субстратов, ингибиторов и индукторов, и прогноз сайтов окисления в молекуле субстрата.
Задачи исследования:
Создать базы данных, содержащие информацию о структурах и биотрансформации ксенобиотиков, и данные об их взаимодействии с цитохромами Р450 ЗА4, 2С9, 2С19, 2D6 и 1А2 человека для формирования обучающих и тестовых выборок при реализации и верификации компьютерного прогноза.
Реализовать и верифицировать компьютерный прогноз взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450 человека в качестве субстратов, ингибиторов и индукторов с использованием созданных баз данных и компьютерной программы PASS.
Разработать унифицированный способ записи биотрансформации с учетом положения окисляемого атома углерода при взаимодействии с цитохромами Р450; реализовать и верифицировать прогноз сайтов окисления в молекуле субстрата.
На примере реакции ароматического гидроксилирования провести сопоставление прогноза сайтов окисления разработанными нами методами с квантовохимическими моделями.
Научная новизна. Впервые реализован компьютерный прогноз взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450 ЗА4, 2С9, 2С19, 2D6 и 1А2 человека в качестве субстратов, ингибиторов и индукторов. Предложен новый метод прогноза сайтов
биотрансформации, проходящих через стадию окисления атома углерода (P450CARBONOX), позволяющий предсказывать реакции ароматического и алифатического гидроксилирования, N-деалкилирования, N-деметилирования, С-окисления с образованием альдегидов, кетонов, карбоновых кислот, О-деалкилирования, О-деметилирования, разрыва сложноэфирной связи и дегалогенирования.
Научно-практическая значимость. Результаты работы могут быть использованы для прогноза метаболизма органических соединений при поиске и создании новых лекарств, оценки риска воздействия ксенобиотиков на организм человека, анализа межлекарственного взаимодействия при назначении пациентам нескольких лекарственных препаратов одновременно.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на симпозиумах «Биоинформатика и компьютерное конструирование лекарств», состоявшихся в рамках Российских национальных конгрессов «Человек и лекарство» XII (Москва, 2005 г.), XIII (Москва, 2006 г.), XIV (Москва, 2007 г.), XV (Москва, 2008 г.); на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г.), IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), научной конференции ИБМХ РАМН (Москва, 2007 г.), 4-ом Международном симпозиуме «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы (CMTPI-2007)» (Москва, 2007 г.), на Германской конференции по хемоинформатике (Гослар, Германия, 2008 г.).
Работа выполнена при поддержке грантов Международного фонда технологий и инвестиций (МФТИ) № DPG.55229907.00106 и № DPG.55229907.00190; Государственного контракта ГК № 02.740.11.0306.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ в российских и зарубежных научных изданиях, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, 14 публикаций в сборниках трудов научных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 25 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 147 источников, и приложения.
Компьютерные программы для моделирования взаимодействия лигандов с цитохромами Р450
Для изучения взаимодействия,субстрата и фермента используются методы молекулярного докинга и молекулярной динамики. При описании взаимодействия цитохромов Р450 и лигандов необходимо оценить роль пространственных и энергетических факторов, при этом вклад этих факторов отличается для различных цитохромов Р450. Для определения оптимальной геометрии возможного молекулярного комплекса белок-лиганд используются программы автоматического докинга, которые при помощи так называемых скоринговых функций (англ. score - счет), определяют наиболее энергетически выгодные конформации лиганда в активном центре.
Подход, который мог бы дать исчерпывающее описание взаимодействия низкомолекулярного лиганда и фермента in silico, и предсказание биотрансформаций, должен учитывать реакционоспособность фермента, структуру активного центра фермента, расположение и конформацию связанного в активном центре лиганда, возможность того, что субстрат может связываться в активном центре множественным образом (при этом связывание может происходить опосредованно через молекулы воды), региоспецифичную реакционоспособность, присущую самому субстрату (причем реакционоспособность может меняться в зависимости от конформации, принимаемой молекулой субстрата), и наконец, аффинность продукта, который должен высвободиться из активного центра фермента. В настоящее время не существует ни одного метода, охватывающего весь комплекс описанных выше условий [64]. Продолжительность расчетов и необходимость использования мощных вычислительных ресурсов все в меньшей степени становятся факторами, лимитирующими развитие и применение методов молекулярного моделирования, поскольку в последнее время высокопроизводительные компьютеры становятся все более доступными для исследователей. Тем не менее, проблема нехватки вычислительных ресурсов для квантовохимических расчетов и для трехмерного молекулярного моделирования остается. К ограничениям описанных методов также можно отнести необходимость контроля процесса моделирования со стороны специалиста. Скоринговые функции, используемые в молекулярном докинге, не являются достаточно точными. Большинство алгоритмов докинга не учитывают гибкость и подвижность самого активного центра цитохрома.
Количественные взаимоотношения структура-активность (QSAR - англ. сокр. от Quantitative Structure-Activity Relationships) используются для нахождения взаимосвязей между структурой молекул и проявляемыми ими свойствами в биологических системах. Поиск количественных соотношений структура-свойство основан на применении методов математической статистики и машинного обучения для построения моделей, позволяющих по описанию структуры химических соединений предсказывать их свойства, например, взаимодействие с цитохромами и биотрансформацию низкомолекулярных соединений [13]. Построение QSAR моделей для оценки метаболизма лекарств осуществляется с использованием ряда методов: множественная линейная регрессия, метод проекции на скрытые переменные (Projection of Latent Structures - PLS), искусственные нейронные сети, метод опорных векторов. QSAR модели могут быть использованы для предсказания связывания субстратов в активном центре [65], а также ингибирования [66] и индукции [67] цитохромов Р450 [68]. QSAR методы, такие как метод опорных векторов, метод К-ближайших соседей, метод дерева принятия решений и др. применяются для классификации субстратов различных цитохромов [69]. Трехмерные QSAR (3-D QSAR) методы широко используются для оценки взаимодействия лигандов, (субстратов и ингибиторов) с активным центром цитохрома. Льюисом и соавт. [70] был проведен анализ небольшого набора субстратов цитохрома Р450 2С9 и данных об их связывании с ферментом, с использованием метода множественной пошаговой регрессии. Этот анализ показал, что аффинность связывания субстратов в активном центре зависит от липофильности и кислотности лигандов, и количества доноров водородных связей. Существуют QSAR модели для активных центров других изоформ (см. раздел 1.4.). Но для каждого отдельного цитохрома, метаболизирующего лекарства; нужно строить специальную QSAR модель с использованием различных дескрипторов и разных математических методов. Поскольку суперсемейство цитохромов Р450 катализирует большое количество реакций, проходящих по разным механизмам для разнообразных химических классов, классические QSAR методы не могут быть применены корректно для веществ, принадлежащих к различным классам, поскольку для их использования необходимо наличие одинаковых механизмов действия и структурно-сходных молекул [64].
Программа COMPACT. COMPACT - акроним от англ. «computer-optimised molecular parametric analysis of chemical toxicity». Система была разработана Льюисом и сотр. в университете Саррей [71, 72]. Программа COMPACT оценивает способность ксенобиотиков образовывать комплексы с подсемействами 1А и 2Е цитохромов Р450. Подсемейство 1А в основном взаимодействует с липофильными полиароматическими/гетероароматическими молекулами, такими, как бенз(а)пирен, молекулы которых характеризуются небольшой длиной и высокими значениями отношения площади к длине. Цитохромы из подсемейства 1А могут присоединять в качестве субстратов нейтральные и основные молекулы. Цитохром Р450 2Е1 экспрессируется в большом количестве в организме человека. Среди субстратов 2Е1 в основном органические растворители и анестетики, небольшие спирты и множество нитрозаминов и азо-канцерогенов. Цитохром Р450 2Е1 также участвует в метаболизме многих эндогенных веществ, таких, как продукты пероксидации липидов, кетонов и жирных кислот. Среди лигандов цитохрома Р450 2Е1 есть небольшое количество лекарств. COMPACT использует пространственные и электронные параметры.
Основные цитохромы Р450, ответственные за метаболизм лекарств в организме человека и их компьютерное исследование
Цитохром Р450 ЗА4 является мембраносвязанным белком, расположенным в эндоплазматическом ретикулуме. Молекулярная масса 57299 Д, в первичной структуре содержится 502 аминокислоты. Ген CYP3A4 расположен в длинном плече седьмой хромосомы (7q22.1) [97].
Подсемейство ЗА цитохромов Р450 - наиболее экспрессируемое в печени и кишечнике. Два цитохрома Р450 ЗА были описаны в литературе: ЗА4 и ЗА5. Примерно 2/3 цитохромов печени принадлежат к подсемейству Р450 ЗА. Цитохром Р450 ЗА5 чаще встречается у подростков, полиморфно экспрессируемый и не индуцируемый, в отличие от ЗА4, глюкокортикоидами. Существует еще одна эмбрионально экспрессируемая изоформа - ЗА7 (составляет 50% фетальных цитохромов Р450) [26].
Следует подчеркнуть, что цитохром Р450 ЗА4 метаболизирует разнообразные по структуре вещества. Среди них можно выделить трициклические структуры класса, бензодиазепинов: мидазолам, триазолам, алпразолам; класс стероидов: кортизол, тестостерон, будесонид, тирилазад, преднизолон, метилпреднизолон, этинилэстрадиол. Можно выделить более десятка различных классов органических соединений, которые окисляются под воздействием ЗА4: а-аминокислоты, третичные амины, сульфамины, сульфоны, сульфоксиды, ароматические азотсодержащие гетероциклы, амиды, имиды, фосфорорганические соединения, кислородсодержащие гетероциклы, эфиры, стероиды [98].
В июне 2004 года сразу две группы исследователей независимо опубликовали полученные ими методами РСА трехмерные структуры цитохрома Р450 ЗА4 [59, 99]. Оба белка, выделенные, а затем закристализованные этими группами исследователей, не являются нативными белками человека. Дело в том, что обе группы исследователей прибегли к генетическим модификациям белков с целью повысить их растворимость, что необходимо для получения кристаллов. Генетические модификации белков были у обеих групп разные. В частности, этим можно объяснить некоторые различия в полученных ими моделях пространственной структуры белка. В работе Скотт и соавт. [63] представлен анализ и сопоставление моделей пространственной структуры цитохрома Р450 ЗА4. Рассмотрим некоторые выводы авторов относительно топографии ЗА4 вообще и размера активного сайта фермента в частности (см. приложение Б, рисунок Б1).
Самой интересной особенностью цитохрома Р450 ЗА4 является размер и форма полости активного центра фермента, расположенной рядом с гемовым железом. Объем активного центра важен, так как известно, что ЗА4 метаболизирует некоторые объемные субстраты, такие, как бромокриптин (Mr 654), эритромицин (Mr 734) и циклоспорин (Mr 1203) [100]. Две вышеупомянутые исследовательские группы заявили о различных полученных значениях объема полости активного центра: 1386 А3 [59] и 520 А3 [99]. Анализ показал, что эта разница не является следствием каких-либо различий в полученной структуре. Это результат различных подходов к расчету объемов при определении полости активного центра и канала, ведущего из нее [63]. Результаты докинга, произведенного Яно и сотр. [59] свидетельствуют о том, что активный центр способен взаимодействовать с молекулами по размеру гораздо большими, чем эритромицин. Большая полость активного центра цитохрома Р450 ЗА4 также согласуется с положительной кооперативностью, наблюдаемой при присоединении и/или окислении нескольких субстратов. Например, окислительные реакции для прогестерона и тестостерона описываются сигмоидными графиками в координатах скорости реакции и концентрации субстрата [101]. Эта гомотропная кооперативность может быть объяснена одновременным связыванием более чем одной молекулы в активном центре фермента. Если активный центр фермента велик, то молекула субстрата в нем может принимать как продуктивное (приводящее к окислению субстрата), так и не продуктивное (не приводящее к окислению субстрата) положение. Присоединение дополнительной молекулы субстрата может способствовать метаболизму путем стабилизации первой молекулы субстрата в продуктивной ориентации. Некоторые экспериментальные и расчетные данные также свидетельствуют об одновременном присоединении нескольких молекул субстрата [102]. Так как эритромицин может быть локирован в активный центр цитохрома Р450 ЗА4, несколько молекул тестостерона (Mr 288) или прогестерона (Mr 314) потенциально могут быть размещены в активном центре, хотя ни та, ни другая группы не проводили таких исследований [59, 99]. Кроме того, цитохром Р450 ЗА4 может проявлять и гетеротропную кооперативность, означающую, что несколько типов лигандов могут быть одновременно связаны в активном центре фермента. Такие молекулы, как а-нафтофлавон и тестостерон могут играть роль эффекторов, стимулируя метаболизм других субстратов [103]. Данные о гомотропной и гетеротропной кооперативности показывают, что цитохром Р450 ЗА4 может связывать одновременно три молекулы [104]. Таким образом, исследования, опубликованные Yano [59], указывают, что активный центр фермента может связать одновременно а-нафтофлавон и тестостерон. Форма активного центра также имеет значение при анализе функционирования цитохрома Р450 ЗА4. Разные субстраты могут быть метаболизированы. ЗА4 без конкурентного ингибирования друг другом [105]. Это свидетельствует о том, что оба вещества присоединяются рядом с гемовым железом. Существенно, что «дно» активного центра ЗА4, расположенное рядом с гемом, в силу своего большого размера, допускает такое связывание, в отличие от цитохрома Р450 2С8, также имеющего большой объем активного центра, но зауженное пространство рядом с гемом.
Знание трехмерной структуры фермента, характеристика его активного центра необходимы при изучении механизма действия фермента, его взаимодействия с субстратом. До получения трехмерных структур цитохрома Р450 ЗА4 было предпринято много попыток охарактеризовать структуру его активного центра [106]. В частности Льюис и соавт. [107] использовали трехмерную модель, построенную по гомологии с бактериальным цитохромом CYP102, и определили следующие требования, налагаемые на субстраты структурой активного центра ЗА4: наличие акцептора водородной связи на расстоянии 5.5-7.8 А от сайта метаболизма, и ЗА от кислорода, ассоциированного с гемом.
Смит и соавт. [108] детально рассмотрели характеристики активного центра цитохрома Р450 ЗА4. В работе использовалась модель фермента, построенная по гомологии с растворимым бактериальным цитохромом. Они предположили, что гидрофобные взаимодействия принимают участие во взаимодействии фермента и субстрата. Также эти авторы пришли к заключению, что конформационная подвижность активного центра фермента, отмечаемая во многих работах, может быть причиной широкой субстратной специфичности цитохрома Р450 З А4.
Сопоставление статистического и квантовохимических методов прогноза ароматического гидроксилирования
Цитохром Р450 1А2 является мембраносвязанным белком, расположенным в эндоплазматическом ретикулуме. Молекулярная масса 58294 Д,. первичная структура содержит 515 аминокислот. Ген CYP1A2 расположен в длинном плече пятнадцатой хромосомы (15q24.1) [128]. Данный белок экспрессируется в печени и составляет примерно 12% всех изоформ цитохрома. Это основной фермент, вовлеченный в метаболизм теофиллина, кофеина, имипрамина и пропанола. Он также участвует в метаболизме эндогенных субстратов, таких, как 17-бета эстрадиол, уропорфириноген [129, 130]. Селективный ингибитор обратного захвата серотонина флувоксамин является сильным ингибитором цитохрома Р450 1А2. Фармакокинетические исследования показали, что при одновременном приеме флувоксамина и кофеина концентрация последнего в крови резко повышается, что может привести к интоксикации кофеином [131]. Также известно, что этот изофермент катализирует N-окисление гетероциклических ароматических аминов с образованием генотоксичных метаболитов. Интересным фактом является, что индукция цитохрома Р450 1А2 зависит от диеты человека [132].
Если классифицировать субстраты цитохрома Р450 1А2 по химической структуре, то можно заметить, что этот цитохром окисляет ароматические первичные, вторичные и третичные амины, амиды, азотсодержащие ароматические гетероциклы, феноксазины, стеролы (стерины). Цитохром Р450 1А2 метаболизирует также ксантины - кофеин и теофиллин [98].
В 2007 году методом РСА была расшифрована пространственная структура цитохрома Р450 1А2 в комплексе с альфа-нафтофлавоном [62] (см. рис. Б5 приложения Б). Полость активного центра цитохрома Р450 1А2 узкая, планарная, ограничивающая доступ молекул воды. Идентифицировано несколько аминокислотных остатков, определяющих взаимодействие с лигандом, среди них Phe-226, ответственных за гидрофобное взаимодействие. Эти особенности, в основном, определяют субстратную специфичность фермента, возможности его взаимодействия с небольшими планарными молекулами.
Ранее, до расшифровки пространственной структуры, группа исследователей Санз и соавт. [133] изучала ингибирование N-деметилирования кофеина производными ксантина с использованием молекулярного электростатического потенциала (МЕР). Эта же группа сообщала о QSAR моделях, построенных с использованием множественной пошаговой регрессии, для 44 хинолинов, которые часто обуславливают эффекты межлекарственного взаимодействия [134]. Флавоноиды, регулирующие активность цитохрома-Р450 1А2, были также исследованы на предмет ингибирования N-деметилирования кофеина [135]. Предложенная модель устанавливает взаимосвязь 1С5о N-деметилирования кофеина со следующими дескрипторами, описывающими флавоноиды: взаимоотношение объема к поверхности молекулы, коэффициент Гаммета для В-кольца флавоноидов и электронная плотность атома С4 . В соответствии с данной моделью, чем меньше отношение объема к площади, т.е. чем более плоской является молекула, тем сильнее ингибирование цитохрома Р450 1А2. Было построено еще несколько моделей, описывающих ингибиторы 1А2 [136, 137]. Методы опорных векторов, К - ближайших соседей и дерево принятия решений были успешно применены для определения ингибиторов цитохромаР450 1А2 [66].
Оценку связывания субстратов в активном центре цитохрома Р450 1А2 с .использованием QSAR методов произвела группа Льюиса и соавт. [70]. В работе была использована множественная пошаговая линейная регрессия. Модель строили на основе 11 субстратов CYP1A2. Корреляция составила R2 = 0,97 (стандартная ошибка = 0,42). Большинство субстратов обладало следующими особенностями: молекулы субстратов плоские, полярные, прямоугольные, могут быть акцептором электронов, могут образовывать водородные связи.
Цитохромы Р450 ЗА4, 2С9, 2С19, 2D6 и 1А2 играют важнейшую роль в метаболизме лекарств в организме человека и в процессе межлекарственного взаимодействия. Эти ферменты активно изучаются исследователями, моделируется их активность и структура. Субстратная специфичность этих ферментов широка, имеет место различие во взаимодействии с разными классами ксенобиотиков. Расшифровка методами РСА трехмерных структур этих белков позволила более глубоко проанализировать их функционирование. Вместе с тем, компьютерные методы, наиболее часто используемые для прогноза взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450, обладают определенными недостатками: фармакофорные модели узко специализированы и отображают статическую картину распознавания лиганда, не учитывая формы активного центра цитохрома; при использовании QSAR методик для различных цитохромов необходимо отдельно подбирать параметры моделей; применение квантовохимических методов требует серьезных вычислительных ресурсов, эти модели не учитывают распознавание лиганда и его ориентацию в активном центре; использование генетических модификаций и методик компьютерного моделирования вносит неточность в получаемые в ходе рентгеновской кристаллографии пространственные структуры белка; трехмерное моделирование является ресурсоёмким и не учитывает всей сложности процессов, происходящих в ходе взаимодействия лигандов с цитохромами Р450; экспертные системы для предсказания биотрансформации дают большое количество ложно-положительных предсказаний, с получением сотен возможных метаболитов, для отсеивания которых необходимо применение экспертных правил и фильтров.
Предложенная ранее методика компьютерного прогноза биотрансформации ксенобиотиков по структурным формулам [20, 21], реализованная в программе METAPREDICT, не предсказывала взаимодействия с цитохромами Р450. Поэтому имеется необходимость реализации компьютерного прогноза взаимодействия ксенобиотиков с цитохромами Р450 человека в качестве субстратов, ингибиторов и индукторов, и прогноза сайтов окисления в молекулах субстратов под воздействием различных цитохромов Р450.
Сопоставление точности прогноза с помощью различных моделей
Из приведенных в таблицах 15-19 данных следует, что наилучшая средняя точность прогноза (83%) получена с использованием RMNA дескрипторов второго уровня (таблица 16), но при этом чувствительность не высока (SENS=0,49). Наиболее сбалансированный по специфичности и чувствительности прогноз (SENS=0,63, SPEC=0,80, YDN=0,43) получен с использованием RMNA дескрипторов третьего уровня (таблица 17).
RMNA дескрипторы первого уровня описывают непосредственное окружение отдельных атомов, что, как , следует из результатов теста, недостаточно для прогноза сайтовL окисления. RMNA дескрипторы последующих уровней охватывают окрестности большего размера (см.,рис. 14). Проведенная нами верификация прогноза сайтов P450CARBONOX свидетельствует о хорошей предсказательной способности при использовании RMNA дескрипторов второго и третьего уровней. Результаты эксперимента позволяют прийти к заключению о правомочности применения предложенного нами унифицированного способа записи P450CARBONOX для окисления атома углерода, и о возможности предсказания сайтов окисления атомов углерода под воздействием различных цитохромов Р450 1А2, 2С9, 2С19, 2D6 и ЗА4.
Поскольку для прогнозов сайтов биотрансформации в литературе нередко используются квантовохимические методы, представляло интерес сопоставить с ними предложенный нами статистический подход. Такое сопоставление было нами проведено на примере реакции ароматического гидроксилирования.
Ароматическое гидроксилирование является одной из наиболее часто встречаемых биотрансформаций ксенобиотиков, и составляет примерно 20% всех реакций, осуществляемых цитохромом Р450 в организме человека. Точность предсказания сайтов биотрансформации ароматического гидроксилирования, с помощью статистической модели (программа METAPREDICT) была сопоставлена с точностью прогноза ароматического гидроксилирования, полученной с использованием двух квантовохимических моделей активных частиц кислорода, образованных в результате взаимодействия с гемовым железом цитохрома Р450. Для сравнения были использованы оксеноидная модель [77] и модель метокси радикала [80]. реакций биотрансформации ароматического гидроксилирования были взяты из БД Metabolism V 2002.1. При помощи реализованной в программе METAPREDICT процедуры генерации метаболитов, была создана обучающая выборка с использованием RMNA дескрипторов четвертого уровня. Использовался этот уровень дескрипторов, поскольку ранее А.В. Рудик [23] было показано, что для получения точного прогноза ароматического гидроксилирования следует использовать четвертый уровень дескрипторов, что связано с тем, что в данном случае необходимо учитывать большее количество соседей атома, чтобы учесть ароматическое кольцо целиком. При использовании RMNA дескрипторов 4-го уровня также более полно учитываются заместители в бензольном кольце. Информация об участии ферментативных систем не учитывалась, поскольку БД Metabolism V2002.1 её не содержит.
Согласно оксеноидной модели [77], роль цитохрома Р450 состоит в разрыве молекулы Ог с образованием «активного кислорода» (оксена) в атомарном или близком к атомарному состоянии, который и связывается с субстратом. Модель применима для прогнозирования ароматического гидроксилирования производных бензола, для которых ключевой стадией, запускающей процесс метаболизма, является образование интермедиата с тетраэдрически координированным атомом углерода.
В модели метокси радикала [80] вместо активного оксена, как в оксеноидной модели, используется метокси радикал, выступающий в роли окисляющей частицы цитохрома Р450. Модель метокси радикала применима для предсказания сайтов ароматического гидроксилирования замещенных бензолов, а также ненасыщенных полициклических и гетероциклических соединений.
Согласно этим двум моделям, чем меньше разность энергий образования интермедиата и исходного субстрата (АН), тем легче должно идти гидроксилирование по данному положению. Подробное описание этих моделей представлено в п. 1.3.6. диссертации.
В состав тестовых выборок были включены молекулы, относящиеся к различным химическим классам, которые, помимо сайтов, для которых известно, что они подвергаются гидроксилированию, также обладают несколькими потенциальными сайтами ароматического гидроксилирования, не описанными в литературе. В итоге было создано три тестовых выборки: 1) замещенные бензолы, 15 молекул выборки представлены в таблице 20; 2) ненасыщенные полициклические и гетероциклические соединения, 17 молекул выборки представлены в таблице 21; 3) субстраты цитохрома Р450 2D6, 15 молекул выборки представлены в таблице 22 (источник выборки - БД Metabolite [82]). 3.4.4. Сопоставление точности прогноза с помощью различных моделей Были сопоставлены две различные квантовохимические модели и статистический метод программы METAPREDICT. Нашей задачей было сравнение для каждого из трех методов способности прогнозировать экспериментально наблюдаемые реакции тестовых выборок. С этой целью, мы для всех возможных сайтов ароматического гидроксилирования для одного субстрата ввели ранги в соответствии с рассчитанными величинами АР (= Pt - Pf, чем выше величина АР, тем вероятнее прохождение реакции см. п. 2.7.) и АН (разность энергий образования интермедиата и исходного субстрата) (см. таблицы 20 - 22). Для результатов, полученных с помощью программы METAPREDICT ранг 1 присваивается наибольшему значению АР, для квантовохимических методов - наименьшему значению АН. В идеальном случае реальные (наблюдаемые в эксперименте) позиции гидроксилирования должны иметь более высокий (в идеале - первый) ранг по сравнению с реакциями, не і обнаруженными в эксперименте.
![Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс]](/i/i/4419/185836.png "Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс] Высоцкий Александр Юрьевич")
