Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Изменение линейных размеров сократительных белков 12
1.1.1 Миозин 12
1.1.1.1. Структура миозиновой нити 12
1.1.1.2. Экспериментальные данные по изменению длины миозина 15
1.1.1.3. Возмоэюные механизмы дискретного изменения длины миозина. 18
1.1.2. Актин 19
1.1.2.1. Структура актина 19
1.1.2.2. Экспериментальные данные об изменении длины актина 21
1.1.2.3. Возможные механизмы дискретного изменения длины актина. 23
1.1.3. Коннектин 25
1.1.3.1. Структура коннектина 25
1.1.3.2. Экспериментальные данные об изменении длины коннектина.26
1.1.3.3. Возможные механизмы дискретного изменения длины коннектина 28
1.2. Дискретное изменение длины мышечной системы на различных уровнях ее организации. Экспериментальные данные 29
2. Материалы и методы 40
2.1. Препараты 40
2.1.1. Препараты толстой нити мышц голубых мидий. 40
2.1.2. Препараты поясничных мышц кролика. 41
2.2 Растворы 42
2.2.1 Растворы для экспериментов с толстыми нитями голубых мидий 42
2.2.2. Растворы для экспериментов с пояснинымимышцами кролика 42
2.3. Экспериментальное оборудование 43
2.3.1. Установка для экспериментов с нитями миозина 43
2.3.2. Установка для экспериментов с поясничными мышцами кролика. 45
2.4. Протокол эксперимента 46
2.4.1. Механические испытания одиночных толстых нитей мышц мидий. 46
2.4.2. Механические испытания активированных и неактивированных одиночных миофибрилл поясничных мышц кролика. 46
2.5. Вычисление изменения длины образцов при их деформации 47
2.6. Вычисление ширины А-зоны 48
2.7. Определение размера ступеней 49
2.7.1. Метод наилучшего приближения 49
2.7.2. Автоматическое распознавание ступеней на трассах. 50
2.8. Статистический анализ 51
3. Особенности изменения длины одиночной миозиновои нити 59
3.1. Упругие свойства толстой нити 59
3.2. Особенности изменения длины толстой нити 60
3.2.1. Особенности изменения длины толстой нити при ее удлинении и укорочении. 61
3.2.2. Особенности изменения длины толстой нити в зависимости от экспериментального раствора 63
4. Изменение ширины а-зоны при деформации неактивированной миофибриллы 69
4.1. Зависимость ширины А-зоны от длины саркомера, определенная пороговым методом 69
4.2. Зависимость ширины А-зоны от длины саркомера, определенная методом минимума среднего риска 70
5. Особенности изменения длины одиночного неактивированного саркомера 75
5.1. Особенности изменения длины одиночного саркомера при его удлинении и укорочении 75
5.2. Особенности изменения длины одиночного саркомера при различных скоростях его деформации 76
5.3. Особенности изменения длины одиночного саркомера в зависимости от его начальной длины 78
5.4. Особенности изменения длины саркомера в зависимости от его текущей длины 81
6. Контрольные эксперименты 88
6.1. Динамика изменения длины толстой нити 88
6.2. Изменение ширины А-зоны при деформации неактивированной миофибриллы 92
6.3. Особенности изменения длины одиночного неактивированного саркомера 94
7. Обсуждение результатов 105
7.1. Особенности изменения длины миозиновой нити 106
7.1.1. Основные результаты 106
7.1.2. Возможные объяснения динамики изменения длины миозина 109
7.1.2.1. Уровень а- спирали. 109
7.1.2.2. Уровень миозиновой молекулы 112
7.1.2.3. Уровень миозиновой нити. 114
7.2. Особенности изменения ширины А-зоны при деформации пассивного саркомера 116
7.3. Особенности динамики длины пассивного саркомера 118
7.3.1. Основные результаты 118
7.3.2. Возможные объяснения дискретной динамики изменения длины пассивного саркомера. 122
7.3.3. Пассивные ступени саркомера как проявление динамики длины миозиновой нити. 124
Выводы 133
- Дискретное изменение длины мышечной системы на различных уровнях ее организации. Экспериментальные данные
- Растворы
- Особенности изменения длины толстой нити
- Особенности изменения ширины А-зоны при деформации пассивного саркомера
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Общепринято считать, что в процессе цикла укорочения-удлинения саркомера нити сократительных белков актина и миозина не изменяют свою длину, а лишь скользят друг относительно друга (Huxley et. al., 1954). Между тем, экспериментально установлено, что потенциальная возможность изменения длины существует для каждого мажорного белка саркомера. Так, способность актина претерпевать в ходе сокращения мышечного волокна конформационные изменения и укорачиваться была обнаружена в ряде исследований (Prochniewicz et.al., 1983; Wakabayashi, 1995). На основании экспериментов с изолированными актиновыми нитями с использованием метода оптической дифракции авторы заключили о возможности перехода типа «спираль-лента» в актине (Подлубная с соат., 1996). Последние данные механических испытаний одиночной актиновой нити показали возможность ее растяжения примерно на 2.5% (Liu et. al., 2002).
По аналогии с актином, нити миозина также способны изменять линейные размеры. На это обращали внимание много лет назад сотрудники лаборатории Г. Франка, которыми при активном укорочении саркомера было обнаружено уменьшение длины толстых нитей на 20-30 (Самосудова с соавт., 1962, 1975; Габелова с соавт., 1964). В недавних работах на изолированных миозиновых нитях было обнаружено, что их длина при деформации изменялась на 23 % для мышц голубых мидий и на 66% для мышц мечехвоста (Neumann et. al., 1998). Для синтетических миозиновых нитей скелетной мышцы в диапазоне физиологических нагрузок отмечено изменение длины филамента порядка 1-2% (Dunaway et. al., 2002).
Таким образом, способность нитей основных сократительных белков в той или иной мере изменять свою длину можно считать документально подтвержденным фактом. Вместе с тем, роль и значение этого феномена в обеспечении мышцей сократительной функции не ясна. Более того, складывается впечатление, что известные факты о непостоянстве длины контрактильных белков остаются вне поля зрения большинства исследователей, не говоря о том, что не принимаются в расчет при построении моделей мышечного сокращения. Несомненно, это тормозит развитие наших представлений о механизмах, лежащих в основе этого необычайно важного явления.
Настоящая работа направлена на изучение возможной роли миозина в регуляции особенностей изменения длины пассивного саркомера. В отличие от известных исследований, мы сконцентрировали основное внимание на динамических характеристиках процессов удлинения и укорочения одиночной нити миозина и одиночного саркомера. Для этого были использованы новые технологии и аналитические процедуры, обеспечившие измерение длины нитей и саркомеров в субнанометровом диапазоне.
Цель работы: исследовать влияние характера изменения длины миозиновой нити на движение границ неактивированного саркомера.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования: отработать технологию эксперимента для изучения динамики длины одиночной миозиновой нити; оценить упругие характеристики одиночной миозиновой нити; исследовать особенности изменения длины миозиновой нити при ее линейных деформациях удлинения/укорочения; исследовать влияние АТФ и Са2+ на характеристики изменения длины одиночной толстой нити; изучить поведение ширины А-зоны в неактивированном саркомере при различных деформациях; изучить особенности изменения длины одиночного неактивированного саркомера при его удлинении/укорочении; исследовать влияние скорости деформации миофибриллы на изменение длины одиночного саркомера в процессе его удлинения/укорочения; путем задания деформаций выяснить особенности изменения длины неактивированного саркомера в зависимости от его начальной и текущей длины; выполнить контрольные эксперименты для выяснения источников возможных артефактов.
Научная новизна:
Реализована методическая возможность для измерения динамики длины одиночной миозиновой нити запирательной мышцы (Anterior Byssus Retractor Muscle) моллюска Mytilus, а также одиночного саркомера скелетной мышцы кролика (Psoas muscle), в субнанометровом диапазоне на основе современных технических и аналитических решений.
Установлено, что изменение длины одиночного миозиновой нити в процессе ее линейного удлинения/укорочения носит ступенчатый характер. Размер ступеней для удлинения/укорочения миозиновой нити есть величина, кратная 2,7 нм, при этом минимальный размер ступени совпадает с величиной дискретизации и составляет 2,7 нм.
Продемонстрировано, что размер ступени для одиночного миозиновой нити не зависит от концентрации АТФ и Са 2+.
Обнаружено, что при деформациях неактивированного саркомера на 20% ширина его А-зоны не постоянна, но изменяется в среднем на 9 ± 2%.
Показано, что размер ступеней для неактивированного саркомера варьирует в диапазоне 2.0-2.5 нм и обратно пропорционально зависит от начальной и/или текущей длины саркомера.
Выявлено, что вне зависимости от скорости деформации пассивного саркомера размер ступени для удлинения и укорочения имеет равное значение при одинаковой длине саркомера.
Установлено, что для активированного саркомера скелетной мышцы вне зависимости от его длины и скорости деформации минимальный размер ступени при удлинении/укорочении составляет 2,7 нм.
Практическая значимость работы.
Отработана методика эксперимента для изучения механических свойств изолированной миозиновой нити, которая может быть использована в подобных исследованиях на различных белковых структурах.
Разработанные в работе новые алгоритмы для измерения длины одиночной нити, ширины А-зоны и автоматического определения размеров ступеней на трассах изменения длины волокна могут быть использованы для экспериментов с любыми типами мышц.
Полученные в ходе настоящего исследования результаты о дискретном характере изменения длины одиночной миозиновой нити и одиночного неактивированного саркомера, в том числе значения характерных размеров ступеней, а также найденные зависимости и особенности, должны быть учтены при моделировании процесса мышечного сокращения.
Апробация работы и публикации.
Апробация работы была проведена на междисциплинарном семинаре по проблемам биологической и медицинской физики в Уральском государственном университете им. A.M. Горького; а также на заседании секции по биологической подвижности в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
Основные результаты исследования были представлены на 5 Международных и 4 Всероссийских конференциях и нашли отражение в 13 публикациях, 3 из которых — статьи в иностранных рецензируемых журналах.
Структура и объем диссетации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, 4 экспериментальных глав, обсуждения результатов и выводов, списка цитируемой литературы (202 источника). Работа иллюстрирована 50 рисунками и содержит 159 страниц печатного текста.
Дискретное изменение длины мышечной системы на различных уровнях ее организации. Экспериментальные данные
В предыдущем разделе было показано, что каждый из белков саркомера способен изменять свою длину; более того, делать это ступенчатым образом. Далее приводятся литературные данные о том, что ступенчатое поведение мышечной системы было экспериментально продемонстрировано на различных уровнях ее организации. Надо отметить, что приведенные ниже результаты вызвали резкую критику со стороны приверженцев общепринятой теории мышечного сокращения (Huxley, 1986). Однако данные о дискретности изменения длины мышечной системы были получены с помощью целого ряда методик (Pollack, 1986; Goldman, 1987; Granzier et. al., 1987; Pollack et. al., 1988; Granzier et. al., 1990; Pollack et. al., 1998; Stehle et. al, 2000; Blyakhman et. al„ 2001). Первые данные по дискретному изменению длины мышцы были обнаружены в лаборатории академика Г. Франка, Исследования проводились с помощь метода дифракции видимого света на портяжной мышце лягушки. Было устрановлено, что изменение поперечной полосатости в процессе одиночного сокращения происходит в несколько этапов укорочения и частичного расслабления, и имеет дискретный вид. Этот результат трактовался как высокая степень синхронизации работы миозиновых мостиков (Франк, 1965). Позднее ступенчатая картина сокращения была зафиксирована с помощью метода лазерной дифракции в скелетной и сердечной мышцах (Pollack et. al., 1977). Дифракционная картина получалась при помощи гелий-неонового лазера; оптический сигнал усиливался системой линз и проецировался на 128-элементную фотодиодную матрицу, которая сканировалась каждые 0.2 миллисекунды. Один кард сканирования давал профиль интенсивности по отношению к пространственной частоте объекта. Длина саркомера вычислялась как расстояние между пиком интенсивности нулевого порядка и средним значением пика первого порядка (Iwazumi et. al., 1979). Этим же методом исследовалось распределение длин саркомеров растягиваемой болынеберцовой мышцы лягушки (Tameyasu et. al., 1982). На гистограммах разностей длин саркомеров наблюдался четкий пик, соответствующий 12-14 им, на основании чего был сделан вывод о том, что границы саркомера движутся дискретным образом с шагом 12-14 нм.
При помощи разработанной в работе (Myers et. al., 1982) методики было оценено в реальном масштабе времени изменение длины саркомера скелетных мышц лягушки (Jakobson et. al., 1983), Кард, получамый при сканировании проекции изображения полосатости мышцы фотоматрицы каждые 256 миллисекунд, представлял собой квазипериодический сигнал, частота которого совпадала с пространствнной частотой полосатой картины. После этого из сигнала выделялась главная частота, и затем она конвертировалась в длину саркомера. Было установлено, что длина саркомера меняется с дискретом 5,7 нм на половину саркомера. Полученный результат был подтвержден в работе (Tameyasu et. а!., 1985), в которой использовался метод высокоскоростной видеосъемки (порядка 200 кадров в секунду) и проводился покадровый анализ видеоизображений сокращающегося кардиомиоцита лягушки с оценкой изменения во времени расстояния между естественными внутриклеточными метками. Результаты показали, что размер ступеней, имевших место при электрической стимуляции волокна, составляет 11 нм. При помощи методики использования маркеров, нанесенных на мышцу или миофибриллу, также получены подтверждающие ранее объявленные данные (Edman et. al., 1982; Pollack, 1986). В качастве меток использовались стеклянные иголки или волоски животных (Granzier et. al., 1987). В работе (Granzier et. al., 1987) исследовалась динамика сокращениия одиночного волокна скелетной мышцы лягушки. Область фибриллы с парой меток освещалась гелий-неоновым лазером, затем изображение меток усиливалось, разделялось и направлялось на две независимые идентичные фотодиодные линейки, содержащие по 256 элементов. Цилиндрические линзы компрессировали изображение меток в точки, и среднее положение изображения на фотодиодной матрице считалось положением метки. Согласно анализу полученных данных, авторы сделали вывод о том, что длина неактивированного саркомера скелетной мышцы лягушки, а также сердечной мышцы меняется шагообразно. Прерывное изменения длины наблюдалось также в работе (Granzer et. al., 1985), где исследовалась динамика изменения длины саркомера при наложении деформаций растяжения и отпускания нестимулированного волокна. Эксперименты проводились на скелетных мышцах лягушки. Авторы использовали три независимых метода для определения изменения длины саркомера: «оп-Нпе»-метод, в котором длина саркомера расчитывалась из изображения от полосатости волокна; метод лазерной дифракции и метод слежения за длиной помеченных сегментов. В процессе налагаемого растжения-укорочения как длина саркоемра, так и длина волокна изменялись шагообразно. Было отмечене, что увеличение скорости деформации волокна приводит к росту размера ступеней и уменьшению продолжительности фаз постоянства длины. Ступенчатое изменения длины наблюдалось при различных длинах саркомера вплоть до 4 мкм. Помимо этого, дискретная природа изменения длины была получена и с помощью техники лазерной дифракции, обладающей высоким временным разрешением (Wussling et, al., 1989). В исследовании использовались одиночные клетки миокарда морской свинки. Также ступенчатое изменение длины было отмечено в работе (Granzier et. al., 1990), в которой исследовались одиночные волокна лягушки. Наблюдения проводились в фазы изотонического перехода, который имеет место при резком падении нагрузки на волокно. Авторы отмечают, что этот процесс носит дискретный характер.
Такой же характер поведения длины волокна наблюдалось и при изометрическом переходном режиме. В другой работе, где использовалась оптическая сканирующе-фотоумножительная система, была исследована динамика одиночного саркомера мышцы морского гребешка по профилю интенсивности, полученному при сканированиии каждые 5,4 мс фазовоконтрастного изображения полосатости миофибриллы (Tameyasu et. al., 1994). Фрагмент волокна активировался из состояния ригора методом быстрой сметы раствора. Процесс укорочения во фрагменте мышцы носил колебательный характер, и длина саркомера менялась шагообразно с размером дискрета порядка ОД 7 мкм. В последние годы произошло значительное усовершенствование техники анализа поведения саркомера в процессе его линейной деформации (Blyakhman et. al., 1999; Blyakhman et. al., 2001; Pollack, 2001). Так, в экспериментах на активированной летательной миофибрилле шмеля было обнаружено, что трасса изменения длины одиночного саркомера представляла собой периодические ступени, чередующиеся с паузами (Blyakhman et. al., 1999). Изображение периодичной полосатости летательной миофибриллы проецировалось на фотодиодную линейку. Длина саркомера определялась как расстояние между центральными линиями соседних А-зон, полученными методом центра масс (Yang et. al., 1998; Blyakhman et. al., 1999). Гистограмма распределения размеров ступеней, обнаруженных на индивидуальных трассах изменения длины саркомера, имела несколько регулярно расположенных пиков, имеющих значения, кратные 2,7 нм в случае механических испытаний активированных мышц (Blyakhman et. al., 1999; Yakovenko et. al., 2002). Такой же размер дискрета был получен на волокнах мышц лягушки (Edman et. al., 2001), где было показано, что амплитуда осциляции длины волокна при резком снятии нагрузки составляет 2,7 нм. Помимо прочего, большое внимание уделялось также и динамике длины пассивного саркомера (Block, 1995; Yang et. al., 1998; Blyakhman et. al., 2001; Segerson, 2002). Неактиврованные ригорные перетянутые миофибриллы летательной мышцы пчелы и поясничной мышцы кролика подвергались растяжению и укорочению в релаксирующем растворе (рСа2+ 4.0) (Blyakhman фet. al., 2001; Pollack, 2001). За длину саркомера бралось расстояние между центральными линиями соседних А-зон, полученными двумя методами: методом центра масс (Yang et. al., 1998) и методом минимума среднего риска (Blyakhman et. al., 1999; Sokolov et. al., 2003). Шаг изменения длины неактивированного летательного саркомера, рассчитанный при помощи метода центра масс, составил 2,46 нм (Yang et. al., 1998). При использовании же метода минимума среднего риска наименьший размер ступени был равен 2,3 нм для летательной мышцы пчелы (Blyakhman et. al., 1999) и 2,13 нм для поясниной мышцы кролика (Segerson, 2002).
Растворы
Большинство растворов были приготовлены с использованием препаратов фирмы «Sigma», «Fishen . Протоколы приготовления использованных растворов частично заимствованы из ранних работ (Sellers, 1991; Yang et. al., 1998; Liu et. al., 2004). 2.2.1 Растворы для экспериментов с толстыми нитями голубых мидий В экспериментах и при приготовлении препаратов были использованы следующие растворы. Экстракционный буферный раствор для толстых нитей (Mytilus) имел состав (в мМ): 10 PIPES (рН 7.0), 10 MgCl2, и 2 EGTA, 8 ATP, 2 ШТ. Растворы для проведения экспериентов: АВ-буфер (рН 7.4) состоял из (в мМ): 1 EGTA, 25 Imidazole, 25 KCI, 4 MgCl2 и 1 DTT. AB/BSA/GOC имел состав: 0.5 мг/мл BSA, Змг/мл glucose, 0.18 мг/мл glucose oxidase, 0.1 мг/мл catalase, 20 мМ DTT и 1.1 мМ СаСІ в АВ-буфере. Данный раствор использовался с двумя концентрациями АТФ - 25 мкМ (активирующий раствор) и 50 мкМ (раствор с удвоенной концентрацией АТФ). 2.2.2. Растворы для экспериментов с поясниными мышцами кролика. Для экспериментальных процедур были использованы следующие растворы. Ригорный раствор (в мМ): 50 Tris (рН 7.4), 100 NaCI, 2 КС1, 2 MgCl2 и 10 EGTA. Нормальный релаксирующий раствор (рН 7.0) (в мМ): 10 MOPS, 64.4 K+propkmate, 5.23 Mg2+prpinate, 9.45 Na2S04, 10 EGTA, 0.188 CaCI2, 7 ATP и 10 creatine phosphate. Активирующий раствор (рН 7.0) (в мМ); 10 MOPS, 45.1 K+propionate, 5.21 Mg2+propi mate, 9.27 Na2S04, 10 EGTA, 9.91 CaCl2, 7.18 ATP и 10 creatine phosphate. Глицериновый раствор: 50% глицерина и 50% ригорного раствора. 2.3. Экспериментальное оборудование. 2.3.1. Установка для экспериментов с нитями миозина. Измерительное оборудование было сконструировано на базе микроскопной системы Zeiss Axiovert 135 TV (Lui et. al., 2004) (Рис. 2.3), используемой для измерения перемещений и визуализаций-манипуляций в экспериментальной камере. Установка содержала: оптическую часть, включающую 100х масляную иммерсионную объективную линзу и встроенные линзы; измерительную часть - 1100-пикселовую фотодиодную матрицу (RL1024K, EG&G Inc., Reticon, С А), осциллограф, нанодатчики силы и референсный рычаг; устройства управления экспериментом - пьезоэлектрические микроманипуляторы, один из которых был подключен к пьезомотору, управляемому компьютером. Каплю с толстыми нитями осторожно помещали в экспериментальной камере (Рис. 2.4) вблизи неподвижного рефенсного рычага.
По прошествии 5 минут излишки миозиновых нитей вымывались из камеры с помощью буферного раствора перпендикулярно направлению рычага, что обеспечивало ортогональность крепления толстой нити. Затем с помощью микроманипулятора достигалось прикрепление второго конца нити к гибкому датчику силы, подложка которого соединялась с мотором (Рис. 2.5; слева). На мотор при помощи управляющего компьютера подавались виды деформирующего сигнала (Yang et. al., 1998). Обычно это были линейные деформации удлинения-укорочения образца. Перед снятием показаний со сканирующего устройства проделывалось регулирование интенсивности света и положения образца посредством датчиков силы для оптимизации качества сигнала. Референсный жесткий рычаг и гибкие нанодатчики силы были изготовлены методом литографии на кремнии (Fauver et. al., 1998) (Рис. 2.6). Их положение сканировалось с помощью фотодиодной матрицы (Рис. 2.5; справа). Зная жесткость рычагов датчика силы, можно по их отклонению рассчитать напряжение (силу), возникающее в нити при его деформации (Рис.2.7). Используя стандартные градуировочные системы, было найдено калибровочное увеличение, равное 99.7 нм/пиксел. Скорость непрерывного сканирования образца составляла 50 кГц, что обеспечивало временное разрешение 22 мс/скан при длине сканирования 1100 пиксел. В экспериментах использовались миозиновые нити длиной 17,7 ± 6,5 мкм и задавались деформации 13,1 ± 10,7 % от начальной длины нити. Изолированные одиночные миофибриллы помещались в экспериментальную камеру, сконструированную на основе фазово-контрастного иммерсионного микроскопа «Zeiss Axiovert-35» (Bartoo et. al., 1997). Вся экспериментальная установка, основными элементами которой являлись микроскоп, камера для образца, пьезоэлектрический мотор для задания механической деформации, микроманипуляторы и фотодиодная линейка (Рис. 2.8), располагалась на столе на воздушной подушке для избежания влияния вибраций на экспериментальный результат. Раствор миофибрилл помещался в специальную камеру, оборудованную двумя портами - входным и выходным - для смены раствора (Рис. 2.9), которая во время эксперимента не герметизировалась. Внутри этой камеры с помощью гидравлических манипуляторов (Narishige) один конец миофибриллы прикрелялся (привязывался) к неподвижнной стеклянной иголке, а второй - к иголке, движение которой осуществлялось посредством пьезоэлектрического мотора, что приводило к деформациям удлинения и укорочения миофибриллы. Изображение одиночной миофибриллы (см. Рис. 2.2) проецировалось на 1024-элементную фотодиодную матрицу (калибровочный множитель равен 8.17 пиксел/мкм), в результате сканирования которой получались трассы интенсивности вдоль миофибриллы (Рис. 2.10). А-зонам соответсвовали положительные (по интенсивности) сигналы, 1-зонам -отрицательные.
Набор электронно- оптических сигналов (изображений), полученных через каждые 50 мс в течение заданного изменения длины миофибриллы, изображен на Рис. 2.11. 2.4.1. Механические испытания одиночных толстых нитей мышц мидий. В ходе эксперимента использовались линейные деформации в форме трапеции, содержащие этапы: 15с фиксация нити на исходной длине, 12с растяжение, 15с остановка на новой длине, 12с отпускание (возврат в начальное положение) и 15с фиксация вновь на исходной длине. Скорость деформации составляла 0,01 - 0,40 мкм/с. Эксперименты проводились при комнатной температуре в релаксиругощем растворе, активирующем, или же активирующем с двойной концентрацией АТФ. В общей сложности было проанализировано 117 трасс, полученных при деформации 12 толстых нитей. 2.4.2. Механические испытания активированных и пеактивированных одиночных миофибрилл поясничных мышц кролика. Концы выбранной миофибриллы закреплялись стеклянными иголками. С помощью микроманипуляторов миофибрилла несколько раз обматывалась вокруг концов каждой из иголок. Обычно между иголками находилось 12-18 саркомеров ПМ. Эксперименты проводились в релаксиругощем (рСа2+ 8.0) и активирующем (рСа2+ 4.0) растворах при комнатной температуре. Качество образца проверялось при деформации в релаксиругощем растворе путем оценки неизменности ширины А- и I- зон после нескольких циклов удлинения/укорочения. В зависимости от протокола эксперимента раствор либо заменялся на активирующий, либо оставлялся релаксирующим; далее с помощью пьезоэлектрического мотора задавалось изменение длины. Протокол удлинения/укорочения проводился при различных начальных длинах саркомера: 1,8-3,3 мкм для пассивного волокна и 1,6-3,0 мкм для активированного. Скорость линейной деформации составляла 2-14 нм/сек/саркомер. В исследовании использовались трапецеидальные деформации, содержащие: 2с фиксация миофибриллы на исходной длине, 13с удлинение (или укорочение), 2с остановка на новой длине, 13с укорочение (или удлинение) и 2с фиксация на исходной длине. Всего было проанализировано 412 саркомеров из 63 пассивных миофибрилл и 34 саркомера из 11 активированных миофибрилл.
Особенности изменения длины толстой нити
Динамика длины миозиновои нити оценивалась только в периоды релаксации образца после нанесенной деформации. Сделано это было исходя из того, что в данные промежутки времени исключалось возможное влияния мотора на процесс изменения длины. На Рис. 3.3 показан типичный фрагмент трассы изменения длины нити после деформации растяжения. Хорошо видно, что длина меняется ступенчатым образом. Ступени, определенные при удлинении толстой нити, были отображены в отдельной гистограмме, показанной на Рис. 3.4 (светлая линия). В этом случае наблюдается 5 пиков со значениями размеров ступеней, кратных 2,7 нм в диапазоне от 1,5 нм до 15 нм; число отображенных ступеней - 830. Максимум первого пика приходится на 2,7 нм, а среднее для него равно 2,75 ± 0,04 нм. Наибольший второй пик имеет среднее значение 5,42 =Ь 0,04 нм, максимум его приходится также на 5,4 нм. Третий пик, высота которого меньше первых двух пиков, приходится на 8,23 ± 0,05 нм, максимум его соответствует 8,1 нм. Максимум четвертого пика расположен на 10,8 нм, среднее для него 10,74 ± 0,07 нм. В области 13,5 нм можно видеть еще один незначительный пик, его среднее значение равно 13,71 ±0,12 нм. Следует обратить внимание, что значения пиков кратны 2,7 нм — значению первого пика; для случая удлинения миозновой нити наиболее вероятным оказался размер ступени 5,4 нм. На Рис. 3.4 (темная линия) показаны все ступени, найденные при укорочении толстой нити. Гистограмма их распределения по размерам, содержащая 435 ступеней, также имеет 5 пиков с такими же вероятными значениями для них в диапазоне от 1 нм до 15 нм. Максимум первого пика соответствует 2,7 нм, среднее значение его 2,74 ± 0,05 нм. Среднее значение второго пика равно 5,26 ± 0,05 нм, максимум его приходится на 5,4 нм. Третий пик, максимум которого соотвутствует 8,1 нм, имеет среднее значение 8,12 ± 0,67 нм. Четвертый пик характеризуется средним значением 10,83 ± 0,08 нм и максимальным значением 10,8 нм. Небольшой пик в районе 13,5 нм имеет максимум в 13,6 нм, его среднее значение равно 13,41 ± 0,10 нм. Отметим, что размер дискрета кратен 2,7 нм и все пики соответствуют значениям, кратным 2,7. Также обратим внимание на то, что для данной гистограммы самым высоким является пик со значением 2,7 нм, то есть оно соответствует наиболее вероятному значению дискрета при удлинении нити. Из сравнительного анализа гистограмм распределения размеров ступеней, имеющих место при линейной деформации одиночных миозиновых нитей, можно заключить, что размер дикрета и вероятные значения ступеней, происходящих при деформации толстой нити, не зависят от направленности деформации, то есть от того, удлинялась ли нить или укорачивалась.
Хотя гистограммы для удлинения и укорочения толстой нити имеют разный вид, но размер дискрета и его наименьшее значения совпадают. На Рис. 3.5 представлена гистограмма распределения, вобравшая в себя ступени укорочения и удлинения; размер их варьируется от 1 нм до 17 нм. Гистограмма включает в себя 1228 найденных ступеней, полученных из анализа 112 трасс изменения длины толстой нити в ходе механических испытаний. Как хорошо видно на Рис. 3.5, гистограмма имеет 5 выраженных пиков, максимумы которых соответствуют 2,7 нм, 5,4 нм, 8,1 нм, 10,8 нм и 13,5 нм. Среднее значение первого пика соответствует 2,77 ± 0,01 нм; для второго пика средняя величина равна 5,40 ± 0,01 нм. Величина третьего пика приходится на 8,11 ± 0,02 нм; четвертый пик соответвует 10,76 ± 0,03 нм; среднее значение для пятого пика равно 13,59 ± 0,05. Следует отметить, что расстояние между пиками равно 2,7 нм, что совпадает с минимальным размером ступени. Для вышеописанной гистограммы распределения размеров ступеней была построена функция вероятности (Рис. 3.6). Как можно заметить, характер пиков и их соразмерность не изменились. Дискрет снова равен 2,7 нм. Рис. 3.7 демонстрирует сравнительный анализ распределения ступеней при удлинении-укорочении миозиновой нити, полученных при использовании различных экспериментальных растворов (различные концентрации АТФ и Са ). Гистограмма # 0 относится к условиям нулевой концентрации АТФ и Са и содержит 110 ступеней из 23 трасс; #1-25 мкМ АТФ и 1.1 мМ Са2+ (787 ступеней из 85 трасс); #2-50 мкМ АТФ и 1.1 мМ Са2+ (491 ступень из 66 трасс). На гистограмме # 0 (Рис. 3.7, светлая линия) в области 1 - 15 нм наблюдаются 5 хорошо выраженных пиков со значениями, кратными 2,7 нм. Среднее значение первого пика приходится на 2,81 ± 0,11 нм, максимум пика составляет 2,8 нм. Значение среднего для второго пика равно 5,31 ± 0,07 нм. Максимальное значение пика совпадает со средним и равно 5,4 нм. Максимум третьего пика попадает на 8,1 нм, его среднее значение - 8,08 ± 0,12 нм. Червертый пик имеет максимум в 10,7 нм, среднее значение для него 10,76 ± 0,11 нм. Пятый пик, высота которого примерно равна высоте третьего и четвертого, имеет максимальное значение 13,6, а среднее 13,57 ±0,12 нм. На гистограмме # 1 (Рис. 3.7; жирная серая линия) имеется 5 пиков, расположенных между 1 и 15 нм. Их максимумы приходятся на 2,6 нм, 5,4 нм, 8,1 нм, 10,7 нм и 13,5 нм. Средние значения для них соответствуют 2,76 ± 0,04 нм, 5,35 ± 0,04 нм, 8,16 ± 0,05, 10,77 ± 0,07 нм и 13,43 ± 0,09 нм. Как хорошо видно, пики располагаются примерно через 2,7 нм. На гистограмме # 2 на Рис. 3.7 (жирная линия) число наиболее ярко выраженных пиков соответствует 5, причем они равноотстоят друг от друга на расстоянии 2,7 нм и расположены между 1 и 15 нм. Первый пик имеет максимальное значение, равное 2,7 нм, совпадающее со средним значением 2,71 ± 0,05 нм. Второй пик имеет большую высоту; его значения — максимальное 5,4 нм, среднее 5,36 ± 0,04. Среднее значение третьего пика приходится на 8,26 ± 0,07 нм, максимальное значение для него равно 8,3 нм. Червертый пик имеет максимум в точке 10,8 нм, среднее значение 10,78 ± 0,06 нм. Максимальное значение пятого пика составляет 13,4 нм, его среднее значение 13,32 ±0,09. Из сравнительного анализа гистограмм распределения ступеней, полученных в различных экспериментальных растворах (активирующем, релаксном и активирующем с удвоенной концентрацией АТФ) видно, что изменение концентраций активирующих компонентов не привело к изменению минимального размера и дискрета изменения длины одиночной миозиновой нити.
Характер гистограмм не изменился - они содержат по 5 пиков, значения которых совпадают. Таким образом, изменение длины одиночной толстой нити запирателъной мышцы голубых мидий при удлинении-укорочении носит ступенчатый характер. Как для случая удлинения, так и укорочения размер ступени равен 2,7 нм и/или кратен этой величине и не зависит от скорости изменения длины. Минимальный размер ступеней и величина дискрета их распределения не зависят от концентрации АТФ и Са. В данном разделе приведены результаты анализа изменений ширины А-зоны саркомеров, имеющих место в условиях релакса при линейных деформациях саркомера. На Рис. 4.1 показан в качестве примера фрагмент миофибриллы скелетной мышцы кролика при двух фиксированных длинах саркомера (1.6 мкм - 1 и 3, 1.8 мкм для 2). Можно заметить, что ширина А-зоны в растянутом саркомере больше, чем при исходной длине (снимки 1 и 3). Также следует обратить внимание на то, что процесс изменения ширины А-зоны носит реверсивный характер. 4.1. Зависимость ширины А-зоны от длины саркомера, определенная пороговым методом. Для численной оценки ширины А-зоны измерения проводились в статическом режиме с использованием порогового метода (см. Методы). С его помощью были получены значения ширины А-зоны при различных степенях растяжения для 24 пассивных саркомеров. Пары «длина саркомера -ширина его А-зоны», полученные из динамики длины отдельных саркомеров, были отображены в виде зависимостей, часть из которых отображена на Рис. 4.2 (показано индивидуальное изменение ширины А-зоны и длины саркомера в ходе механических испытаний для 5 саркомеров; коэффициенты корреляции для них: 0.999, 0.968, 0,993, 0,992, 0,939). На Рис. 4.3 представлен результат анализа зависимости ширины А-зоны от длины саркомера в различные моменты механических испытаний при трапецеидальной деформации, сделанный по 2874 состояниям 98 саркомеров. Кривая, полученная при использовании порогового метода («ручной анализ»), имеет прямую зависимость ширины А-зоны от степени растяжения саркомера (коэффициент корреляции 0.88). На график нанесены средние значения ширины А-зоны для каждого диапазона длин саркомеров. При изменении длины саркомера на (20±2)% ширина А-зоны прямо пропорционально изменялась на (8±2)% по оценкам, сделанным при помощи порогового метода. 4.2. Зависимость ширины А-зоны от длины саркомера, определенная методом минимума среднего риска.
Особенности изменения ширины А-зоны при деформации пассивного саркомера
Исходя из того, что одиночная толстая нить способна изменять свою длину, было резонно исследовать механическое поведение нитей в составе А-зоны при деформациях саркомера. Для этого мы измеряли ширину А-зоны при растяжении и укорочении пассивного саркомера. В работе был использован новый алгоритм для определения ширины А-зоны в динамическом режиме. Метод расчета основан на нахождении оптимального положения изображения выбранной А-зоны относительно первой производной от предыдущего во времени изображения с шагом 45 мс. Дифференциальное приближение обеспечило более высокую разрешающую способность по сравнению с использованием простого порогового метода и метода центра масс. Установлено, что при растяжении саркомера на 20% происходит рост ширины А-зоны в среднем на 9.0 ± 2.1%. Данный результат был получен с помощью нового алгоритма для различных видов деформации - как трапецеидальной, так и ступенчатой формы (см. Рис. 4.5 и 6.12). В качестве контрольных тестов были использованы оценки ширины А-зоны визуально, путем учета мнения сторонних наблюдателей, а также использования порогового метода. С его помощью получено, что при 20% удлинении саркомера ширина А-зоны увеличивается в среднем на 8.6 ± 2.4% (см. Рис. 4.3 и 6.11). Сравнение результатов измерений двумя методами показало их хорошее совпадение. Возможность изменения ширины А-зоны в процессе активации саркомера была отмечена в исследованиях на мышцах моллюсков (Dewey et. al., 1977), летательной мышце пчелы (Pollack et al., 1988), скелетной мышце лягушки (Самосудова и Франк, 1971; Galey, 1964). Представленные в данной работе результаты, свидетельствующие об изменении ширины А-зоны в неактивированном образце при его линейных деформациях, получены впервые. Суть этого явления, вероятно, определяется перечисленными в предыдущем разделе механизмами, объясняющими изменение длины толстой нити. Например, скольжение полярно ориентированных стержневых частей молекул миозина (ЛММ) к центру протофибриллы (Самосудова с соавт., 1975) с одновременным увеличением диаметра и числа субъединиц в каждой толстой протофибрилле. Другая гипотеза основана на том, что укорочение толстых нитей идет за счет их спирализации (Самосудова с соавт., 1971). В работе (Габелова с соавт., 1964) была предложена идея, когда толстые протофибриллы в саркомере находятся в растянутом состоянии при наличии взаимодействия между нитями, и укорочение происходит вследствие того, что связи разрываются.
Также предлагалась идея, что изменение длины толстых нитей может происходить при расщеплении концов толстых нитей на более тонкие, возможно, даже отдельные миозиновые молекулы (Самосудова с соавт., 1971). Таким образом, результаты по изменению ширины А-зоны, полученные с использованием различных видов деформаций неактивированных саркомеров и различных аналитических подходов обработки данных, свидетельствуют об ее непостоянности: наблюдается рост ширины А-зоны при увеличении длины саркомера. Исходя из поставленной цели настоящей работы, мы исследовали динамику длины пассивного саркомера, подразумевая при этом наличие определенного влияния на этот процесс миозиновых нитей. Так, при механических испытаниях релаксирующего саркомера поясничной мышцы кролика было обнаружено, что границы одиночных саркомеров движутся во время наложения линейной деформации прерывным образом (см. Рис. 5.1). В серии экспериментов по укорочению одиночного неактивированного саркомера было показано, что размер дискретизации ступени для начальных длин саркомеров порядка 1,8 - 2,4 мкм составляет 2,5 нм (см. Рис. 5.2). При анализе трасс растяжения сарокомера было обнаружено, что размер ступени равен 2,5 нм при тех же начальных длинах саркомера (см. Рис. 5.2). Как при растяжении так и при укорочении было исследовано влияние скорости линейной деформации миофибриллы на размер ступени изменения длины саркомера. Так, для саркомера с начальной длиной 1,8 - 2,4 мкм было показано, что увеличение скорости укорочения с 1-3 нм/с до 8-11 нм/с приводит к появлению дополнительного пика на гистограмме распределения ступеней, величина которого кратна 2,5 нм, но не влияет на величину минимального размера ступени дискретизации длины саркомера. (см. Рис. 5,3). Построение отдельных гистограмм для серий саркомеров, имеющих различные начальные длины, позволило обнаружить, что при росте начальной длины саркомера происходит увеличение размера ступени. Так, для скорости деформации 2 нм/с при длинах саркомера 1,8 -2,4 мкм размер минимальной ступени составляет 2,5 нм, также наблюдаются ступени с кратными значениями. Минимальный вероятный размер ступени при начальных длинах саркомера 2,4 - 2,7 мкм равен 2,3 мкм, а при длинах 2,7 -3,0 мкм размер ступени уже составляет 2,2 нм. При начальных длинах саркомера 3,0 — 3,3 мкм ступень дискретизации характеризуется размером 2,0 нм (см. Рис. 5.4). При увеличении скорости деформации до 8 нм/с наблюдалась перегруппировка соотношения высот пиков, иногда их числа, но не величин ступеней, характерных для той или иной группы начальных длин саркомеров. Для группы с наименьшими рассмотренными начальными длинами саркомера 1,8- 2,4 мкм размер ступени составил 2,5 нм, для группы с наибольшими начальными длинами величина ступени равна 2,0 нм (см. Рис. 5.6). Подобная тенденция уменьшения размера дискретизации была продемонстрирована в зависимости от длины саркомера, при которой произошла та или иная ступень (см. Рис. 5.7). При аналогичном разбиении саркомеров по текущим длинам в диапазонах 1,8 - 2,4 мкм, 2,4 -2,7 мкм, 2,7 — 3,0 мкм и 3,0 - 3,3 мкм были продемонстрированы следующие минимальные размеры ступеней: 2,6 нм, 2,4 нм, 2,2 нм и 2,0 нм. Подводя итоги, можно сделать несколько заключений. Во-первых, пассивный саркомер поясничной мышцы кролика изменяет длину ступенчато при линейных деформациях (см. Рис. 5.1). Во-вторых, при одинаковой начальной или текущей длине саркомера размер ступени не зависел от направления движения саркомера, будь то его удлинение или укорочение (см. Рис. 5.2). В-третьих, величина ступени также не меняется при увеличении скорости деформации (см. Рис. 5.3). И, наконец, в-четвертых, размер ступени обратно пропорционально зависел от начальной и текущей длины саркомера (см. Рис. 5,4, 5,6 и 5.7), что является наиболее интересным результатом. С целью исключения влияния систематического артефакта на результаты исследований был проведен ряд контрольных экспериментов.
Большая часть тестов описана ранее (Yang et. al., 1998; Blyakhman et al., 1999). В частности, артефакт появления ступеней за счет трансляции образца вдоль дискретной фотодиодной матрицы был исключен с помощью изменения увеличения микроскопа в 1,6 раза, при этом произошло увеличение уровня шума, обусловленное снижением интенсивности попадающего на линейку света; несмотря на это наблюдалось качественное и количественное сходство трасс (Blyakhman et. al., 1999). Кроме того, сама линейка заменялась на недискретный приемник информации, которым служило сканирующее зеркало (Yang et. al., 1998). Артефакт появления ступеней за счет дефектов в элементах фотодиодной линейки был проверен посредством смещения приемника таким образом, чтобы изображение саркомера попадало на различные регионы вдоль линейки, где ожидаемые дефекты были бы различными (Yang et. al., 1998). Линейность мотора тестировалась измерением траектории движения ближайшей к мотору А-зоны (Blyakhman et. al., 1999). В этих эксперментах было показано, что движение А-зоны происходит гладким образом благодаря ее близости к непрерывно движущемуся мотору. Отдельно оценивался механический шум системы как потенциальный источник артефакта (Blyakhman et. al., 2001). Для этого на саркомер накладывалась ступенчатая деформация укорочения, размер ступеней которой слегка (порядка 0,5 нм) отличался от ожидаемого физиологического размера. Тогда гистограмма распределения размеров ступеней изменения длины саркомера содержала два пика, один из которых соответствовал наложенным, а другой спонтанным ступеням. Это позволило сделать вывод о том, что качество сигнала достаточно для того, чтобы достигать разрешения 0,5 нм. В другом эксперименте линейная деформация была наложена на флуктуирующий шум, моделируя тем самым свободную от ступеней деформацию.
