Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Вариационное моделирование в описании стационарной стадии роста сообщества микроорганизмов 16
1.1. Краткий обзор литературы 16
1.2. Культивирование микроорганизмов без пополнения запасов ресурсов (предпосылки модели) 23
1.3. Формулировка экстремальной задачи 24
1.4. Теорема стратификации 27
1.5. Теорема о максимуме относительных численностей групп организмов, образующих сообщество 29
Глава 2. Математические аспекты вариационного моделирования 31
2.1. Явные формулы для расчетов областей лимитирования и относитель ных численностей групп организмов в частных случаях 31
2.1 1. Решение для случая w =2, ж =2 31
2.1.2. Решение для случаям» = 3, т = 2 34
2.1.3. Решение для случая w = 3, т = 3 36
2.1.4. Решение для случая w = 2, т = 3 40
2.2. Особенности вырожденных случаев 42
2.2.1. Число лимитирующих ресурсов больше или равно числу групп организмов в сообществе 42
2.2.2. Задача о «близких» группах микроорганизмов 45
2.2.3. Метод расчета лимитирующего ресурса для монокультур 46
2.3. «Теорема Гиббса» 48
2.4. Теорема о монотонном возрастании энтропии {«теорема Больцмана») 51
2.5. Анализ чувствительности модели 54
2.6. Модельные возможности регулирования состава сообщества 57
Глава 3. Приложение вариационной модели потребления и роста к описанию стационарной стадии развития сообщества диссоциантов Pseudomonas aeruginosa 66
3.1. Материалы и методы 66
3.1.1. Диссоцианты Pseudomonas aeruginosa и их свойства 66
3.1.2. Методы культивирования и измерений 67
3.1.3. Методы экспериментального определения лимитирующего ресурса (метод добавок) 74
3.2. Определение потребностей 75
3.3. Выявление лимитирующих ресурсов 82
3.4. Состав поликультур 91
3.5. Культивирование на средах с заданными условиями лимитирования (опыты 2002-2003 гг.) 99
Заключение 117
Выводы 118
Список литературы 120
Приложение 138
- Культивирование микроорганизмов без пополнения запасов ресурсов (предпосылки модели)
- Теорема о максимуме относительных численностей групп организмов, образующих сообщество
- Число лимитирующих ресурсов больше или равно числу групп организмов в сообществе
- Методы экспериментального определения лимитирующего ресурса (метод добавок)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди современных проблем биологии центральное место занимает проблема адекватного экологического прогноза. В приложении к экологии сообществ, в частности микробиологических, она может быть переформулирована как проблема строгого количественного предсказания (расчета) численностей видов, образующих сообщество, как функций, аргументами которых являются факторы, определяющие жизнедеятельность организмов. Среди таких факторов одно из первых мест занимает обеспеченность особей ресурсами среды. Критерием адекватности расчетных схем может служить умение управлять структурой сообщества или, другими словами, умение поддерживать необходимый состав сообщества, представленного группами организмов в необходимых пропорциях. Интерес к подобным прикладным задачам связан с тем, что параметры биологических процессов и урожай продуцируемых веществ сильно зависят от доли, которая в биомассе сообщества приходится на те или иные виды организмов. Особая ситуация в микробиологических биотехнологиях возникает из-за явления диссоциации микроорганизмов. При этом активность диссоциантов, их физиологические особенности, влияющие на продуцирование биологически активных веществ, различны, что приводит к необходимости контролировать состав возникающей поликультуры.
Для исследования возможностей описания микробиологических культур с точки зрения указанных проблем прогноза и управления в диссертационной работе используется вариационная модель потребления и роста для экологических сообществ. Эта модель позволяет по известным потребностям физиологически различающихся групп организмов рассчитывать области лимитирования для
любых сочетаний ресурсных факторов в среде и численности популяций сообщества на стационарной стадии роста как функции лимитирующих рост ресурсов. Подход, лежащий в основе вариационной модели, берет свое начало в классической статистической физике, в которой каноническое распределение (стационарное состояние идеального газа) получается решением задачи на максимум энтропии при условии, что задана средняя энергия газа. В рамках используемой в диссертационной работе модели стационарное состояние сообщества микроорганизмов описывается решением задачи на условный экстремум функции обобщенной энтропии.
В отличие от широко применяемых в математической биологии методов моделирования, использующих аппарат теории дифференциальных уравнений (обыкновенных или с частными производными) и позволяющих исследовать динамику процессов, протекающих в биологической системе, указанный подход дает лишь стационарное состояние, в которое система приходит с течением времени. В тоже время, используя вариационное моделирование, можно избежать ряда трудностей в изучении динамических моделей, связанных с их чрезвычайной громоздкостью, неопределенностью множества параметров, невозможностью применения традиционных методов сокращения числа переменных, обусловленной спецификой задач и т. п.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является предоставление точного метода предсказания факторов, ограничивающих рост смешанной культуры микроорганизмов, и количественного расчета долей каждой из групп клеток, образующих сообщество, на стационарной стадии роста. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
получить явные формулы для расчетов границ областей лимитирования, на которые распадается пространство потребляемых ресурсов в зависимости от начальных условий культивирования и потребностей клеток в питательных веществах;
вывести явные формулы или предъявить системы уравнений, из которых возможно рассчитП*ь~тШюсйтельныё численности каждой группы клеток на стационарной стадии роста;
изучить некоторые частные случаи экстремальной задачи, особенности функционала обобщенной энтропии и вариационной модели;
обработать данные экспериментов прошлых лет по культивированию моно- и смешанных культур бактерий диссоциантов Pseudomonas aeruginosa',
разработать и реализовать схему проведения новых экспериментов, с учетом необходимых дополнений к методикам;
провести расчеты, используя разработанный механизм, для смешанной культуры диссоциантов бактерий Pseudomonas aeruginosa, и продемонстрировать адекватность полученных теоретических предсказаний лимитирующих ресурсов и состава микробиологического сообщества экспериментальным данным.
Научная новизна работы. В диссертационной работе получен ряд новых результатов, связанных как с математическими аспектами вариационной модели потребления и роста, так и с экспериментальными исследованиями в области выращивания культур диссоциантов бактерий P.aeruginosa.
Предъявлены способы расчетов границ областей лимитирования и численностей организмов на стационарной стадии роста для частных случаев. По-
лучено решение экстремальной задачи в зависимости от следующих факторов: соотношение между количеством групп микроорганизмов и числом потребляемых ими ресурсов, соотношение между величинами потребностей клеток, принадлежащих разным слагающим сообщество группам. Кроме того, изучен вопрос об ограничении запасами питательных веществ роста монокультур, Перечисленные результаты позволяют сделать более простым и доступным применение вариационной модели для изучения традиционных лабораторных объектов исследования.
В диссертационной работе-впервые доказаны теоремы о свойствах экстремальной задачи и функционала обобщенной энтропии («теорема Гиббса» и «теорема Болыщана»), имеющие перспективу применения в различных областях естествознания.
Впервые проведен анализ чувствительности вариационной модели, что чрезвычайно важно для дальнейшего анализа соответствия теоретических и экспериментальных данных.
Изучены возможные пути регулирования состава сообщества, предостав
ляемые вариационной моделью. :
Значительная часть диссертационной работы посвящена изучению стационарной стадии развития культур диссоциантов бактерий P.aeruginosa. Необходимо отметить, что в подавляющем большинстве случаев моделирование бактериальных сообществ ориентировано на методы проточного культивирования, а работы по моделированию стационарных состояний в условиях культивирования бактерий без возобновления запасов ресурсов практически отсутствуют. Кроме того, настоящее исследование ориентировано на изучение не изолиро-
ванных культур, а сообщества физиологически различающихся групп организмов.
Впервые получены количественные данные о потребностях диссоциантов в основных питательных веществах с учетом физиологических особенностей бактерий, влияющих на соотношение оптической плотности культуры и количества клеток. Рассчитаны границы областей лимитирования и относительные численности диссоциантов на стационарной стадии развития смешанных культур на основе данных о модельных параметрах-потребностях. Проведена проверка адекватности теоретических расчетов и результатов экспериментов. Существенно, что для опытного выявления факторов, ограничивающих рост сообщества, был применен специально разработанный метод добавок. Полученные результаты позволяют говорить, что вариационная модель достаточно хорошо предсказывает характер лимитирования и состав смешанных культур бактерий на стационарной стадии роста.
Научная и практическая иенностъ работы. Вариационное моделирование нашло свое применение в различных областях биологии, однако, несмотря на ряд достоинств, по-прежнему остается мало востребованным методом моделирования. Основной причиной этого является трудность в выборе целевой функции. Используемая в диссертационной работе вариационная модель основана на принципе максимума обобщенной энтропии, который является развитием формализма Джейнса. Результаты настоящей работы могут быть использованы для описания различных биологических объектов, удовлетворяющих предъявляемым моделью требованиям. Кроме того, возможно их применение и в других областях естествознания, где решаются подобные экстремальные задачи.
Экспериментальным объектом диссертационной работы являются смешанные культуры диссоциантов P.aeruginosa. Представители рода Pseudomonas широко используются в различных биотехнологических процессах: в химических производствах, в биогидрометаллургии, в производстве химических препаратов для сельского хозяйства, при получении полимеров, для повышения нефтеотдачи пластов, при переработке и удалении отходов и веществ, загрязняющих среду, в том числе нефтяных загрязнений. В связи с этим большое значение приобретают все полученные в процессе исследования сведения об этих организмах.
В работе описан возможный способ создания сообщества одноклеточных организмов с нужными свойствами путем изменения отношений питательных веществ в среде. Полученные результаты позволяют говорить о перспективах решения не только задач, связанных с биологической утилизацией многокомпонентных загрязнений, но и с проблемами создания кормовой базы растительноядных рыб в рыбоводных хозяйствах, в задачах борьбы с эвтотрофированием водоемов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. В зависимости от начального состава среды рост бактерий P.aeruginosa может быть ограничен одновременно углеродом, азотом и фосфором, попарными комбинациями этих веществ или каждым веществом в отдельности. Вариационная модель процессов потребления и роста и полученные по результатам экспериментов значения потребностей позволяют адекватно предсказывать ресурсы, ограничивающие рост моно- и смешанных культур диссоциантов бактерий P.aeruginosa, растущих без пополнения запасов ресурсов.
Кроме потребностей диссоцантов P.aemginosa в питательных веществах, которые ограничивают рост смешанной культуры, состав смешанной культуры микроорганизмов на стационарной стадии роста однозначно определен соотношением запасов этих ресурсов в среде в начале культивирования. Вариационная модель процессов потребления и роста позволяет адекватно предсказывать относительные численности диссоциантов бактерий P.aemginosa в смешанных культурах на стационарной стадии роста в зависимости от запасов лимитирующих ресурсов в среде и значений потребностей клеток в этих ресурсах.
По данным микробиологических экспериментов можно провести измерение значений потребностей R-, S- и М-диссоциантов бактерий Pseudomonas aeruginosa в углероде, азоте и фосфоре. Эти значения определяют, какие из потребляемых ресурсов будут полностью исчерпаны в процессе роста моно- или смешанных культур, какой общей численности будет достигать сообщество и какую долю будут составлять клетки каждого диссоцианта на стационарной стадии роста. —г^--~
Экстремальный принцип, лежащий в основе используемой вариационной модели, допускает интерпретацию в виде принципа минимального потребления лимитирующих рост ресурсов и в виде энтропийной параметризации изменения запасов ресурсов в"срёдё=г
Апробация работы и публикаиыи. Работа была доложена на семинаре сектора информатики и биофизики сложных систем кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. "М.В.Ломоносова, на V Международном конгрессе по математическому моделированию (Дубна, 2002), на X Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование.» (Пущино, 20-25 ян-
варя 2003 г.). По теме диссертации опубликованы или приняты к печати 13 работ (из них 3 тезисов конференций).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа представляет собой рукопись на 137 страницах, включая 14 рисунков и 20 таблиц. В списке литературы содержится 168 наименований.
Общая характеристика и этапы работы. Задачу предсказания числен
ностей видов, образующих сообщество, и контролирования его состава можно
решать различными путями. Результаты, достигнутые в области управления
структурой фитопланктонных сообществ (Левич с соавт., 1997), позволили
предположить, что применение аналогичных методов для исследования культур
бактерий, а именно, вариационной модели потребления и роста, также окажется
удачным. Схожесть объектов с точки зрения модели (одноклеточные организ
мы, размножающиеся делением, конкурирующие за несколько взаимонезаме-
няемых ресурсов), одинаковые методы культивирования (выращивание без по
полнения запасов ресурсов, в течение которого не производится добавления или
изъятия и клеток, и веществ), а также накопленный к моменту начала над дис
сертационной работой экспериментальный материал стали аргументами в поль
зу попытки описать развитие культуры диссоциантов P.aeruginosa с помощью
вариационной модели. ~
Все исследование можно разделить на две части: изучение некоторых математических аспектов моделирования и работа непосредственно с данными по культивированию бактерий.
Для того чтобы описать развитие сообщества диссоциантов с помощью вариационной модели потребления и роста, сначала необходимо бьшо получить явные формулы для расчетов границ областей лимитирования и численностей групп клеток. При этом обратить внимание на те ситуации, которые имеют место в лабораторных экспериментах. Следующей задачей стал анализ чувствительности модели. Проведенное исследование впоследствии позволило судить о степени согласованности теоретических и экспериментальных результатов.
По результатам лабораторных экспериментов с монокультурами бьшо необходимо определить параметры модели, которые представляют собой потребности диссоциантов в углероде, азоте и фосфоре. Затем, основываясь на данных опытов с добавками как для моно-, так и для смешанных культур, проверить соответствие предсказываемых теоремой стратификации лимитирующих ресурсов экспериментальным данным. И, наконец, для различных вариантов поликультур (для всех попарных смесей и смеси трех диссоциантов) провести проверку адекватности теоретических расчетов состава сообщества на стационарной стадии роста результатам опытов.
Первым этапом работы с 'экспериментальными данными стала систематизация и анализ результатов опытов по культивированию моно- и смешанных культур R-, S-, М-диссоциантов P.aeruginosa, которые были проведены в период с 1999 по 2001 гг. Главная задача состояла в том, чтобы отобрать из большого массива данных те, которые удовлетворяют предпосылкам вариационной модели. Для расчетов потребностей диссоциантов по данным экспериментов, в которых проводили химические определения состава среды, достаточно было проследить, чтобы изменение количества клеток и уровней содержания питательного вещества фиксировалось заодиТГи тот же промежуток времени. В том слу-
чае, если определение химического состава культуральной жидкости не проводили, сначала следовало проверить: достигнута ли стационарная стадия (и известно ли количество клеток на этот момент); вызвана ли остановка роста именно исчерпанием рассматриваемых питательных веществ (другими причинами может быть нарушение температурного режима культивирования, закисление среды, недостаточная аэрация, слишком высокая плотность культуры для используемых пробирок и др.). Затем, по различным косвенным признакам сделать вывод о том, какие питательные вещества могли быть полностью исчерпаны в каждом из опытов. Знание лимитирующего ресурса, т.е. полностью потребленного из среды, позволяет рассчитать величину потребности как отношение его содержания в начале опыта к количеству клеток, достигнутому культурой к моменту остановки роста.
После того, как были получены значения потребностей в углероде, азоте и фосфоре, по полученным формулам рассчитали границы областей лимитирования и относительные численности клеток диссоциантов на стационарной стадии роста. Для сравнения теоретических расчетов с экспериментальными данными необходимо было удостовериться: в опытах с добавками вещества вносили в тот момент, когда культура уже достигла стационарной стадии, а процессы лизиса еще не значительны (для проверки адекватности предсказания ограничивающих рост факторов); определение состава сообщества (рассев) проводили на стационарной стадии роста (для проверки адекватности предсказания относительных численностей).
Этот этап работы с экспериментальными данными позволил: получить данные о потребностях диссоциантов в основных компонентах питания;
сделать вывод о довольно хорошей согласованности теоретических и экспериментальных данных;
определить, какие уточнения необходимо внести в методики проведения опытов для того, чтобы как можно больше результатов были пригодны для анализа в рамках исследуемой вариационной модели.
После того, как были полностью обработаны данные экспериментов прошлых лет был проведен следующий этап работы по выращиванию моно и смешанных культур R-, S- и М-диссоциантов P. aeruginosa. Основной целью было: опираясь на данные о потребностях, составить среды, ограниченные по каждому из питательных веществ (с точки зрения вариационной модели потребления и роста), и проверить наличие заданного условия лимитирования по результатам опытов с добавками (как для моно-, так и для смешанных культур). Затем для каждой среды рассчитать состав смешанных (парных и тройной смесей) культур на стационарной стадии развития, их оптическую плотность к моменту остановки роста, вызванной исчерпанием ресурсов, и сравнить полученные данные с результатами эксперимента. Кроме того, по данным опытов с монокультурами рассчитывали потребности диссоциантов в углероде, азоте и фосфоре и сравнивали их значения с полученными ранее.
В процессе обработки данных этого этапа были получены результаты, свидетельствующие о необходимости не рассматривать в проведенных опытах содержание фосфора в среде как фактор, способный ограничивать рост культур. В связи с этим были пересмотрены все экспериментальные данные с точки зрения двух возможных лимитирующих ресурсов: углерода и азота. Результаты оказались следующими: в 83% опытов с добавками и 85% опытов со смешан-
ными культурами различия между предсказаниями модели и экспериментальными данными не превышают пределов, допустимых с учетом ошибок измерений.
Полученные данные о величинах потребностей и произведенные расчеты численностей диссоциантов в каждой из областей лимитирования позволили проанализировать возможные пути регулирования состава культур с помощью изменения отношения запаса ресурсов. Регулирование состава возможно лишь в задаваемых моделью пределах. Оказалось, что для диссоциантов, обладающих имеющимися значениями потребностей, нельзя изменить доминирующую группу клеток. Однако, при "подходящих" значениях потребностей, варьируя соотношение питательных веществ в среде, на стационарной стадии роста можно получать различные распределения групп по рангам (от наименее до наиболее многочисленной).
Культивирование микроорганизмов без пополнения запасов ресурсов (предпосылки модели)
Сообщество микроорганизмов, состоящее из одной (монокультура) или нескольких групп клеток (смешанная культура), помещают в замкнутую среду, содержащую различные компоненты питания, необходимые для его развития. Считается, что ресурсы не могут заменить друг друга, так как выполняют различные функции по отношению к росту. В процессе культивирования, включающем в себя деление клеток и их гибель (поглощения одних организмов другими не происходит), не производят добавления или изъятия ресурсов и микроорганизмов каким-либо искусственным способом. При таком росте сообщество развивается до наступления стационарной фазы. Продолжение культивирования приводит после некоторого времени пребывания в стационарной фазе к естественной деградации сообщества (фаза отмирания). Стационарная стадия развития сообщества, состоящего из w групп микроорганизмов, которые потребляют т взаимонезаменимых ресурсов, может быть описана решением следующей задачи на условный экстремум (Левич, 1982; Левичссоавт., 1994; 1997): Здесь и, - искомая численность каждой из групп клеток сообщества на стационарной стадии роста; # - потребляемое из среды количество k-ото ресурса, необходимое для деления клетки группы і, в расчете на одну клетку (потребность организма группы і, в ресурсе к), Lk - содержание ресурса к в среде в начале культивирования (L 0). Предполагается, что наборы потребностей клеток из различных групп (?;» ?") i-Uw непропорциональны друг другу. Это связано с тем, что в рамках рассматриваемой модели именно отсутствие пропорциональности обеспечивает различимость групп клеток. В качестве целевой функции Н{п), п = (и,t...,nw\ использован так называемый функционал обобщенной энтропии, а ограничения представляют собой законы сохранения. Важно отметить, что функционал Н(«) не постулирован, а выведен, на основе категорно-функторного метода сравнения математических структур (Левич, 1982). Само сообщество описано математической структурой множеств из и элементов, разбитых на w непересекающихся классов размером н, to (« = и,.). Допустимыми преобразованиями для этих объектов являются инъ- ективные, сюръективные, не всюду определенные и не функциональные соответствия (такой тип преобразования адекватно отражает условия эксперимента, описанные в п.1.2). Логарифм удельного числа допустимых преобразований данного состояния системы, названный обобщенной энтропией, является мерой структурированности состояний системы. Экстремальный принцип, формализуемый задачей (1.1), постулирует, что динамические системы из заданного состояния переходят в состояние с экстремальной (в пределах, допустимых имеющимися ресурсами) структурой. (Подробное описание оснований для подобной формулировки и вывода функционала содержится в работе А.П.Левича (1982).)
Нулевая численность всех групп микроорганизмов, образующих сообщество, осуществляет глобальный минимум целевой функции H(n,,...,nw) = 0 (если положить, что по определению при и = 0 выполняется равенство и In и = 0). Поскольку этот тривиальный случай не представляет интереса, в дальнейшем вместо задачи на экстремум (1.1) будет рассматриваться задача на нахождение максимума функции Н(п). Существенно, что ограничения задачи (1.1) записаны в виде неравенств. Тем самым учтен тот факт, что ресурсы не могут заменить друг друга, а, следовательно, для остановки роста сообщества достаточно исчерпания хотя бы одного ресурса и наступление стационарной стадии вовсе не означает, что все компоненты питания потреблены полностью. Решение задачи (1.1), получившее название «формула структуры сообщества», задается формулой Множители Лагранжа Хк и полная численность п как функции потребляемых ресурсов L ищутся из алгебраических уравнений Показано, что это решение задачи (1.1) всегда существует, единственно и осуществляет максимум функционала Н(п) (Левич с соавт., 1994). Необходимо сделать несколько замечаний, принципиальных с точки зрения возможности применения вариационной модели для анализа экспериментальных данных о развитии сообщества: решением экстремальной задачи является состояние сообщества именно на стационарной фазе роста; предполагается, что достижение стационарной стадии обусловлено именно исчерпанием одного (или нескольких) из исследуемых ресур сов, а не какими-либо другими причинами (выполнение этой предпо сылки необходимо учитывать при выборе методики культивирования, ориентированной на соответствие с рассмотренной моделью).
Теорема о максимуме относительных численностей групп организмов, образующих сообщество
Анализ формулы структуры сообщества 1.2) показал, что решение вариационной задачи (1.1) обладает свойством, имеющим важное прикладное значение. Доля каждой группы микроорганизмов сообщества njn и полная численность клеток всего сообщества и являются известными функциями начальных концентраций ресурсов в среде L . Знание указанной зависимости позволяет предлагать пути направленного управления долями различных групп микроорганизмов в смешанных культурах с помощью подбора начального соотношения потребляемых клетками ресурсов. Более точно параметры управления задает теорема о максимуме видовых обилий (Левич с соавт., 1993; Levich, 2000). Согласно полученным результатам относительные численности групп клеток, образующих сообщество, зависят только от отношений полностью потребляемых ресурсов среды; относительная численность заданной группы клеток принимает наибольшее значение при отношениях в среде ресурсов, равных отношениям потребностей в них данной группы. Кроме того, можно отметить, что относительные численности остаются инвариантными при преобразованиях потребностей вида qf-Kxq , а 0, Теорема стратификации, а также теорема существования и единственности (Левич с соавт., 1994) дают алгоритм решения вариационной задачи (1.1). Сначала следует найти границы областей, на которые, согласно теореме стратификации, разбито пространство ресурсов. Затем в каждой из областей необходимо решить задачу с равенствами (1-3). Причем, в случае, когда количество лимитирующих факторов совпадает с числом групп микроорганизмов, образующих сообщество, достаточно решить систему равенств-ограничений. Ниже приведены решения задачи для частных случаев. Пусть задано сообщество, состоящее из двух групп клеток, потребляющих два ресурса: і) и L1. Пусть известны потребности микроорганизмов в ресурсах q\ }, к = 1, 2; і = 1,2 (индекс к нумерует ресурсы, индекс і - группы). Согласно вариационной модели сообщества, численность каждой из групп клеток на стационарной стадии роста рассчитывается следующим образом.
Сначала необходимо определить области, на которые, согласно теореме стратификации, распадается пространство ресурсов. Пусть х0 - корень уравнения хщ +хЯі = 1, Пространство ресурсов распадается на 3 области, в одной из которых лимитирующими оказываются оба ресурса (область І), а в двух других - один ресурс (в области II - Л1, в области III - L1). Найдем относительные численности групп микроорганизмов на стационарной стадии роста в каждой из областей отдельно. Рис. 2.1. Стратификация пространства потребляемых ресурсов при т = 2. В области I лимитируют оба фактора, в II - L , в ПІ -і) L2 Пусть задано сообщество, _срстоящее из трех групп микроорганизмов, потребляющих два ресурса: і) и L2. Пусть известны потребности клеток в ресурсах:! ч\ } =1,2; / = 1,2, 3 (индекс к нумерует ресурсы, индекс і - группы). Согласно вариационной модели, численности групп клеток, составляющих сообщество, на стационарной стадии роста определяются следующим образом. Три области, на которые разбивается пространство ресурсов, задаются аналогично предьщущему случаю. Пусть х0 - корень уравнения хЧ} + хь +х9 =1, а у0 - корень уравнения у + у91 + уЯі = 1. Тогда коэффициенты угла наклона прямых, ограничивающих области лимитирования (рис. 2.1), задаются выражениями: В области со значениями — = % из промежутка [У, Т/] лимитирующими явля- ются оба ресурса, при -j v лимитирует фактор L , при — ] - L . Найдем относительные численности групп микроорганизмов в каждой из областей. В областях лимитирования одного фактора, относительные численности групп клеток, составляющих сообщество, на стационарной стадии роста ищутся следующим образом. Пусть задано сообщество, состоящее из трех групп микроорганизмов, потребляющих три ресурса: L , L , і . Пусть известны потребности клеток в ресурсах:! qk }, к = 1, 2, 3; і = 1, 2,-3 (индекс к нумерует ресурсы, индекс і - группы). Согласно теореме стратификации пространство ресурсов разбивается на 7 областей. В одной лимитируют три ресурса, в трех областях по два, в трех - по одному ресурсу (рис. 2.2). Страты описываются следующим образом. Пусть z, к = 1,2,3- корень Аналогично рассматриваем уравнения lzf +- z\lzf + z zf =1 и z z 1 + z Z32 + z3z5 = 1, получаем функции Zj = z,(z3) и z3 = z3(z2). Получаем еще две линии в сечении П = const.
Число лимитирующих ресурсов больше или равно числу групп организмов в сообществе
Пусть количество лимитирующих ресурсов (т.е. тех, для которых ограничения-неравенства стали равенствами) больше или равно числу групп микроорганизмов, образующих сообщество. Тогда соответствующая редуцированная вариационная задача (1,3) теряет смысл, поскольку численности групп задаются системой ограничений-равенств, при условии ее совместности: Выпишем условия совместности системы ресурсных ограничений, при выполнении которых имеет место задача (2.1). Из любых w уравнений выражаются численности и() / = 1, w: n QjQ, где Q - определитель матрицы, составленной из значений потребностей w групп клеток в выбранных w ресурсах, Q, -определитель матрицы, в которой на Ї-ОМ месте стоит столбец, составленный из набора ресурсов L , k-ix,...iw (выбранные w ресурсов), а остальные столбцы составлены из соответствующих потребностей (напомним, что в условиях рассматриваемой модели значения потребностей микроорганизмов из различных групп непропорциональны друг другу).
Подставив полученные численности щ в оставшиеся і/-и уравнений системы ограничений, получим искомые соотношения между ресурсами: Таким образом, в случае, когда количество групп микроорганизмов, составляющих сообщество, w меньше или равно числу потребляемых ресурсов т, в стратах размерности w выполняются условия совместности системы уравнений Из этой же системы находятся численности групд клеток на стационарной стадии роста. Рассмотрим случай «две группы микроорганизмов - три ресурса». В предыдущем пункте 2.1.4 были получены формулы для расчета границ областей лимитирования и относительных численностей групп на основе теоремы стратификации. В частности, выписаны уравнения кривых, задающих страт размерности 3, который по результатам вычислений с конкретными числовыми значениями потребностей имел вид отрезка. Причина подобного вырождения состоит в следующем. В области лимитирования трех ресурсов имеет место системы вида (2.1): Согласно полученным условиям совместности подобной системы ресурсных ограничений, должны выполняться следующие соотношения: которые при условии I3 = const задают прямую на плоскости {V; V}. Прямая подстановка в это соотношение выражений для параметров і) и L2, задаваемых формулами Х\ = Xi = пУнкта 2.1.4, показывает, что ко- ординаты точек границ криволинейного треугольника, удовлетворяют полученному уравнению прямой.
Итак, в ситуации, когда число групп микроорганизмов, образующих сообщество, меньше числа потребляемых им ресурсов, страты размерности большей, чем число групп, имеют вырожденный вид. В частности, область лимитирования тремя питательными компонентами сообщества, состоящего из двух групп клеток, является частью плоскости вместо криволинейного конуса (или отрезком вместо криволинейного треугольника в сечении i3 = const). Пусть сообщество состоит из двух групп клеток, потребляющих два ре-сурса L и! . Кроме этого, пусть потребности организмов разных групп близки к пропорциональным, т.е. q\ jq\ — d, q\ jq\ — d + є, где є « d. Согласно полученным алгоритмам нахождения областей лимитирования и относительных численностей групп на стационарной стадии роста (см. п. 2.1, Левич с соавт., 1994), коэффициенты угла наклона прямых, ограничивающих страты, вычисляются по формулам
Методы экспериментального определения лимитирующего ресурса (метод добавок)
Для экспериментального определения ресурса, ограничивающего рост культуры, проводили так называемые опыты с добавками. На первом этапе проведения экспериментов в момент предполагаемого достижения стационарной стадии культуру разделяли на четыре пробирки. В три из них вносили добавки - глюкозу, нитрат или фосфат, - четвертую оставляли без изменений (контроль). Количество добавляемых веществ равнялось их первоначальному содержанию в среде. Культуру оставляли расти еще четыре часа, затем проводили измерение оптической плотности. Если добавление компонента питания в среду приводило к возобновлению деления клеток, то этот ресурс считали лимитирующим. В случае если внесение вещества не приводило к росту культуры, считали, что этот фактор не ограничивал развития сообщества. В более поздних опытах методика эксперимента была несколько изменена. Вносили не три, а семь возможных комбинаций добавок - каждое вещество в отдельности, парные комбинации и все три - для проверки возможности многофакторного лимитирования. Кроме того, было увеличено время экспозиции культуры с добавками с четырех до 12 часов. Это было сделано с целью избежать влияния лагфазы. Под потребностью организма понимается количество ресурса, необхо димое для роста вида, в расчете на одну клетку. Таким образом, получить соот ветствующие величины потребностей диссоциантов в источниках питания мож но по формуле qf = , где AL- количество потребленного из среды вещества, L - компонент питания, Ап{ количество вновь образовавшихся клеток за тот же период времени, индекс і характеризует диссоциант. Потребности R-, S- и М-диссоциантов бактерий P. aeruginosa определяли по результатам анализа данных экспериментов с монокультурами, проведенных в период 1999 г. по 2001 г. По данным опытов, в динамике которых определяли концентрации питательных веществ, потребности рассчитывали, исходя из соответствующих измерений величин AL и Дя
В большинстве экспериментов химическое определение концентраций питательных веществ в динамике культивирования не проводили. Поэтому для определения количества потребленного ресурса, используемого при расчетах потребностей, руководствовались следующим: если остановка роста произошла по причине исчерпания некоторого питательного вещества, то количество потребленного к концу роста культурой этого ресурса можно считать равным его содержанию в среде в начальный момент культивирования. При этом для вычисления потребности необходимо использовать количество клеток, выросших за тот же период времени, то есть к моменту достижения стационарной фазы. Итак, для расчета потребности диссо-цианта в некотором ресурсе необходимо выполнение следующих условий: число выросших клеток данного диссоцианта следует определять в стационарной фазе роста; остановка роста (достижение стационарной стадии) должна быть обусловлена исчерпанием в среде именно этого ресурса. Таким образом, экспериментальная задача состояла в необходимости зафиксировать достижение стационарной стадии.
Для этого измерения оптической плотности проводили с интервалом в несколько часов в течение двух -двух с половиной суток. Задача анализа полученных данных состояла в выявлении лимитирующего рост ресурса. Для ее решения были применены три подхода. Первый основан на априорном представлении о том, какой питательный компонент мог бы ограничивать рост культуры на среде с заданным составом. Исходную (указанную в разделе "Культивирование бактерий") среду, основываясь на опыте культивирования P.aeruginosa, принимали за сбалансированную (при выращивании бактерий на такой среде все питательные вещества полностью исчерпываются одновременно). А среду, где содержание некоторого ресурса было снижено по сравнению с исходной, считали лимитированной по этому ресурсу. Второй путь — проверка пропорциональности оптической плотности культуры в стационарной фазе начальному количеству ресурса в среде в серии опытов с различными начальными содержаниями ресурса. При этом одна из сред в серии согласно первому подходу могла быть признана лимитирующей по рассматриваемому ресурсу. Третий подход основан на методе добавок (см. пункт 3.1.3). Возобновление роста после добавки ресурса принимали за экспериментальное доказательство его лимитирующей роли. Были проведены 26 опытов с культурой R-диссоцианта, 34 опыта с S-диссоциантом, 28 — с М-диссоциантом. В табл.3.3 приведены уровни содержания питательных веществ в начале эксперимента (в расчете на элемент), значения оптической плотности культуры (показания нефелометра, умноженные на 100) и уровня рН в стационарной фазе роста (или в конечный момент культивирования). Исходная среда в табл:3.3 приведена под номером 1. По данным табл.3.3 судили о наличии пропорциональности оптической плотности культуры начальному количеству ресурса в среде. Среды, при культивировании на которых применяли метод добавок, отмечены символом п п. Необходимо отметить ряд причин, по которым часть экспериментальных данных исключали из дальнейшего рассмотрения: не во всех опытах конечный момент культивирования соответствовал стационарной стадии (это означает, что культура не достигла максимально возможной на данной среде численности клеток); в некоторых экспериментах в процессе культивирования вместо исходной монокультуры возникала смесь диссоциантов (Милько, Опарина, 2004) (эти данные не подходят для определения потребностей, поскольку по ним невозможно определить в каком количестве потребляются ресурсы каждым из диссоциантов). Таким образом, были выбраны данные тех опытов, по которым можно рассчитывать потребности. Полученные по результатам этих экспериментов значения потребностей приведены в табл.3.4. Рассчитанные величины были усреднены, для средних были рассчитаны 95%-е доверительные интервалы (табл.3.5). Для указанных расчетов применялось стандартное приложение Microsoft Excel 7.0 (анализ - описательная статистика). В конце 2002 г. - начале 2003 г. на основе рассчитанных потребностей (табл.3.5) была составлена среда, (0.225% глюкозы, 0.03% нитратов и 0.004% фосфатов), на которой были проведены дополнительные опыты по культивированию R- и S-диссоциантов для экспериментальной проверки полученных величин. Начальные запасы ресурсов были в среднем пропорциональны установленным значениям потребностей диссоциантов (сбалансированная среда). По данным указанного опыта были получены следующие данные: потребность в углероде составила 122-10"12мг/кл и 345-10"12мг/кл для R- и S-диссоцианта соответственно; в азоте - 5.75 10"12мг/кл и 2410 12мг/кл; в фосфоре - 0.85-10"12мг/кл и 3.5-10"12мг/кл. Сравнение приведенных величин потребностей со значениями в табл.3.5 показывает их близость в пределах погрешностей определения. Отметим, что ранее были получены оценки потребностей диссоциантов P. aeruginosa в глюкозе, нитратах и фосфатах на основе данных 1997-1999 гг. (Максимов с соавт., 2001). Однако, при расчетах этих значений для перевода оптической плотности в численность для всех диссоциантов использовался один и тот же коэффициент.
В работе было высказано намерение осуществить "дифференцированную калибровку" показаний нефелометра для каждого из диссоциантов, что и проделано в настоящем исследовании. Уточненные значения потребностей в расчете на элемент содержатся в табл.3.6. Как видно из сравнения представленных в данной работе величин потребностей и опубликованных раньше, имеет место их взаимное соответствие (с учетом погрешностей вьгчис- лений, которые достигают 50% (Максимов с соавт., 2001)), за исключением значений потребностей М-диссоцианта. Это различие можно объяснить следующим обстоятельством. В опытах 1997-1999 гг. наблюдался очень плохой рост указанного диссоцианта. Так, оптические плотности, которых достигала М-культура в прежних и нынешних опытах, примерно одинаковые, а содержание ресурсов в средах опытов 1997-1999 гг. было в 5-Ю раз выше. И наоборот, при одинаковом содержании питательных веществ в более поздних опытах оптическая плотность достигала значений в несколько раз превышающих уровень ранних экспериментов. Вероятно, остановка роста культуры М-диссоцианта в ранних опытах связана с образованием клетками муравьиной кислоты и, как следствие, снижением уровня кислотности среды (указанная особенность клеток М-диссоцианта была обнаружена позднее (Мялько, Красильникова, 1999)). Итак, можно сделать вывод о том, что в экспериментах 1997-1999 гг. остановка роста М-диссоцианта происходила по причине, не связанной с исчерпанием ресурса из среды, и предположение о том, что ресурсы были полностью потреблены из среды, было неверным, а рассчитанные величины потребностей оказались завышенными.
