Введение к работе
Актуальность исследования.
Хронические нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера (БА), хорея Гентингтона и другие относятся к социально значимым заболеваниям, на лечение и исследование которых тратятся огромное количество денег во многих государствах [Голубев и др., 1999; Шток и др., 2002; Marras, Tanner, 2004; Левин, Федорова, 2006; Гаврилова, 2007, Угрюмов, 2010].
Вопрос об этиологии нейродегенеративныx заболеваний до сих пор остается нерешенным, хотя считается, что важнейшими факторами риска являются генетическая предрасположенность и эндогенные вещества, запускающие нейродегенеративный процесс. Так, в случае БП мутации в генах -синуклеина, Паркина и других генов приводят к возникновению мутантных токсических белков, которые вызывают гибель специализированных нейронов нигро-стриатной дофаминергической системы и развитие болезни Паркинсона [Григорян, Базян, 2007; Базян, Григорян, 2010].
Несмотря на огромные усилия, которые тратятся различными государствами на паркинсонизм, проблема лечения этого заболевания встречает все еще большие трудности. На самом деле это и понятно, так как дегенерацию и выпадение целой нейромодуляторной системы мозга, практически невозможно восстановить, несмотря на все предпринимаемые до сих пор усилия. В основном пытаются компенсировать функцию выпавшей нигростриатной ДА-ергической системы мозга введением L-ДОФА, предшественника синтеза ДА, легко проходящего через гематоэнцефалический барьер. До сих пор L-ДОФА остается одним из основных препаратов лечения паркинсонизма, но его длительное применение вызывает нарушение моторной функции. Поэтому, в ряде экспериментальных исследований L-ДОФА нормализует вызванные паркинсонизмом изменения [Lindefors 1993; Levy et al., 1995; Vila et al., 1996; Katz et al, 2005; Stephenson et al., 2005; Wang et al., 2007], а в других случаях усугубляет их [Corvol et al., 2004; Jenner, 2003; Rinne et al., 2004; St-Hilaire et al., 2005; Aubert et al., 2005].
Другой подход, который находится в центре внимания исследователей, это исследование и использование компенсаторных процессов, не в разгар нейродегенеративных заболеваний, а в их начальных стадиях, например при досимптомной стадии паркинсонизма. Досимптомная стадия паркинсонизма это та стадия, когда уже начались нейродегенеративные процессы, но симптомы паркинсонизма еще не проявляются. Можно предположить, что отсутствие симптомы паркинсонизма связаны с коменсаторными процессами, которые протекают в мозге. Усиление этих компенсаторных процессов может оттянуть клиническую стадию паркинсонизма. Этот вопрос очень мало изучен на современном этапе и для его реализации необходимо подобрать хорошую экспериментальную модель паркинсонизма.
Есть несколько моделей паркинсонизма с использованием специфических токсинов. Протоксина МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) привлек внимание исследователей болезни Паркинсона в связи с тем, что являющийся примесью синтетического героина, вызывает у наркоманов и лиц, участвующих в производстве этого наркотика, неврологические симптомы, характерные для болезни Паркинсона: брадикинезию, ригидность и тремор (Langston et al., 1983, 1999). МФТП проходит в мозг, и связывается с активными центрами окислительного фермента моноаминоксидазы-В (МАО-В), локализованного в микроглии. При посредстве МАО-В протоксин превращается в N-метил-4-фенил-2,3-дигидропиридин-ион (МФДП+), который окисляется до конечного продукта - МФП+, обладающего селективной нейротоксичностью по отношению к ДА структурам. МФП+ активно транспортируется в нейроны ДА транспортером. В нейронах МФП+ входит в митохондрии и селективно тормозит митохондриальное дыхание на уровне комплекса 1 электронной транспортной цепи, вызывая оксидативный стресс и нарушения кальциевого гомеостаза. Это приводит к дегенерации ДА нейронов или посредством некроза или апоптоза (Langston, et al., 1983; Gerlach, Riederer 1996; Przedborski еt al., 2000). Экспериментально показано, что МФТП селективно моделирует ключевой патогенетический механизм БП - гибель нигростриатных дофаминергических нейронов, дефицит дофамина в стриатуме, при последующем проявлении паркинсонистических симптомов - тремор, ригидность, замедленность движения, семенящую походку, постуральную нестабильность [Кучеряну и др., 2010].
Наилучшие модели БП при использовании МФТП получается на мышах линии C57BL/6 и на обезьянах. Введение токсина [German, еt al., 1996] в больших дозах (50-300 мг/кг) мышам линии C57BL/6 приводило к почти полному истощению (до 95%) уровня стриатного дофамина и к выраженной гибели (от 55 до 75%) нейронов ниграстриатной системы. Но обычно для исследования миткродиализа у мышей в МФТП модели предварительно вводят животным различные вещества, увеличивающие концентрацию ДА так как выход ДА у мышей очень маленький и использование МФТП практически невозможно. Например, психостимулятор модафинил [Fuxe еt al., 1992], антагонист NMDA рецептора AP-5 [Richard еt al., 1995] или тирамин, резко повышающий концентрацию ДА в мозге [Schmidt, Ferger, 2004]. Мы полагали, что было бы гораздо лучше исследование концентрации ДА и его метаболитов в стриатуме под влиянием МФТП без дополнительного повышения концентрации ДА. В связи с этим были поставлены следующие цели и задачи исследований.
Цель исследования.
Изучить динамику развития паркинсонизма на нейротоксической модели у мышей линии С57BL/6.
Задачи исследования.
-
Увеличить чувствительность хроматографического метода определения концентрации ДА и его метаболитов, 3,4-дезоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК), при электрохимическом детектировании настолько, чтобы можно было прямо определять значительные уменьшения концентраций этих веществ в стриатуме мышей, без дополнительного его усиления.
-
Определение межклеточной концентрации ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме свободноподвижных мышей методом микродиализа, в разные интервалы времени (сразу, через 7 суток, через 30 суток) после инъекции МФТП, в дозе 20 мг/кг при внутривенном введении.
-
Выяснение корреляции между наличием двигательных расстройств и концентраций ДА и его метаболитов в межклеточной среде стриатума в эти интервалы времени.
-
Исследование межклеточной концентрации ДА, его предшественника L–ДОФА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме мышей линии C57BL/6 методом микродиализа через 14 дней после подкожного введения МФТП в дозе 12 мг/кг.
Научная новизна.
Метод хроматографии модифицирован таким образом (подобран состав подвижной фазы, тип колонки, снята преколонка), что его чувствительность возросла на 2 порядка (в 100 раз). Это позволило с помощью метода микродиализа in vivo определить межклеточную концентрацию ДА в стриатуме мышей, после воздействия МФПТ, без дополнительного увеличения концентрации ДА предварительным введением фармакологических агентов, искусственно повышающих концентрацию ДА в стриатуме мышей.
Впервые исследована динамика нарушения поведения мышей после однократного введения МФТП в дозе 20 мг/кг и выяснена корреляция между наличием двигательных расстройств и межклеточных концентрацией дофамина и его метаболитов в те же интервалы времени
Впервые исследована досимптомная стадия паркинсонизма и показано, что через 14 суток после однократной подкожной инъекции МФТП в дозе 12 мг/кг наблюдается двукратное уменьшение межклеточной концентрации дофамина в стриатуме, но при этом не наблюдается каких либо двигательных нарушений.
Теоретическое и научно-практическое значение работы.
Повышение чувствительности хроматографического метода позволит широко использовать метод in vivo микродиализа для определения межклеточную концентрацию ДА в различных структурах мышей, даже в тех случаях, когда концентрация ДА значительно понижена предпринятыми воздействиями.
До сих пор специальное внимание не уделялось досимптомной стадии паркинсонизма, при которой, вероятнее всего, компенсаторные процессы наиболее выражены. Отсутствие двигательных расстройств, возможно, связано с высокой интенсивностью компенсаторных процессов, которые препятствуют проявлению симптомов паркинсонизма на фоне выраженного дефицита межклеточной концентрации ДА в стриатуме. Можно полагать, что целенаправленное усиление компенсаторных механизмов нивелирует уже имеющиеся нарушения и растянет развитие болезни на годы.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Поведенческие и биохимические показатели активности мышей под воздействием введения МФТП находятся в зависимости от дозы токсического вещества, характера его введения (однократно или многократно) и времени последующего тестирования этих показателей.
-
Однократное подкожное введение малой дозы (12 мг/кг) МФТП через 14 суток формирует экспериментальную модель досимптомной стадии паркинсонизма, сопровождаемое уменьшением межклеточной концентрации ДА в стриатуме и отсутствием нарушения поведения. Отсутствие нарушений поведения в модели досимптомной стадии паркинсонизма обусловлены компенсаторными механизмами, которые очень важно и удобно исследовать на данной модели паркинсонизма.
Апробация работы.
Апробация работы прошла 16.12.2010 г. на совместном заседания кафедры анатомии и физиологии человека и животных биолого-химического факультета ГОУ ВПО «Московский Педагогический Государственный Университет» и лаборатории нейрохимических механизмов обучения и памяти Учреждения Российской Академии Наук «Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН». Материалы исследований были представлены, доложены и обсуждены на конференции молодых ученых в Учреждении Российской Академии Наук «Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН» (Москва, 2008 г.), конференции «Интеграция научных исследований в рамках реализации приоритетных направлений науки» (Москва, МПГУ, 2009 г.), международной конференции «Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии, экологии и биотехнологии», посвященной 85-летию кафедры органической и биологической химии и 90-летию ссо дня рождения профессора МПГУ Юрия Борисовича Филипповича» (Москва, МПГУ, 2009 г.), конференции молодых ученых в Учреждении Российской Академии Наук «Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН» (Москва, 2009 г.), конференции «Интеграция научных исследований в рамках реализации приоритетных направлений науки». (Москва, МПГУ, 2010 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ, в т.ч. 3 в реферируемых журналах из списка ВАК РФ по направлению «Биология».
Структура и объем диссертации.
