Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1. Гиппокамп как модель для исследования синапсов в ц.н.с. 9
2. Структура и функции дендритных шипиков гиппокампа 12
2.1. Современные методы анализа дендритных шипиков 12
2.1.1 Окраска по Гольджи 12
2.1.2 Электронная микроскопия 13
2.1.3 Конфокальная микроскопия и молекулярно-биологические методы 13
2.1.4 Трехмерная реконструкция и стереологичеекий анализ 15
2.2. Классификации дендритных шипиков 16
2.3. Структура синаптического комплекса 19
2.3.1 Постсинаптическос уплотнение 19
2.3.2 Цитоскелет и цитоплазма 22
2.3.3 Эндоплазматический ретикулум 23
2.3.4 Белок синтезирующие компоненты шипиков 24
2.3.5 Митохондрии 25
2.3.6 Мулыивезикулярные тельца 25
2.3.7 Пресиналтические везикулы 26
2.3.8 Астроциты 27
2.3.9 Химический синапс и синаптическая щель 28
2.4. Генезис дендритных шипиков 29
2.5. Функциональная роль дендритных шипиков 31
2.5.1. Большинство синапсов гиппокампа располагаются на дендритных шипиках 31
2.5.2. Шипики увеличивают плотность синапсов па дендрите 33
2.5.3. Шипики - сайты возбуждающих входов гиппокампа 33
2.5.4. Шипики могут модулировать активность синапсов 34
2.5.5. Шипики обеспечивают специфичность синапсов через молекулярную компартментализацию и локальный синтез белков 34
2.5.6. Защитная функция шипиков 35
3. Пластичность дендритных шипиков 37
3.1. Длительная потснциация 37
3.2. Обучение 38
3.3. Патологии нервной системы 39
3.4. Циклические изменения дендритных шипиков 39
4. Гибсрнация и гипотермия как естественные модели для изучения синапсов в различных функциональных состояниях 40
2. Материалы и методы исследования 43
1. Биологические модели, подготовка животных 43
2. Приготовление образцов для световой и электронной микроскопии 45
3. Метод получения серийных улыратонких срезов 48
4. Электронная микроскопия 50
5. Трехмерная реконструкция и количественный стереологическии анализ дендритных шипиков и синаптических структур 52
6. Методы статистической обработки количественных данных и программное обеспечение 53
3. Результаты и обсуждение 54
1. Обратимая ретракция дендритных шипиков как один из морфологических принципов, лежащих в основе синаптическои пластичности ц.н.с. 54
2. Трехмерная организация тонких и грибовидных дендритных шипиков в зависимости от функционального состояния ц.н.с. 62
2.1. Изменение объема и площади поверхности дендритных шипиков при гибернации и гипотермии 62
2.2. Изменение формы дендритных шипиков при гибернации и гипотермии 66
3. Мультисинаптичсские дендритные шипики и аксональные бутоны 74
4. Организация митохондрий в дендритах и аксонах 77
5. Разработка программного обеспечения для трехмерных реконструкций и анализа трехмерных объектов 81
Заключение 85
Выводы 86
- Структура и функции дендритных шипиков гиппокампа
- Пластичность дендритных шипиков
- Приготовление образцов для световой и электронной микроскопии
- Трехмерная организация тонких и грибовидных дендритных шипиков в зависимости от функционального состояния ц.н.с.
Введение к работе
Традиционно, проблемы обучения, памяти и забывания связывают с нейронной пластичностью, в основе которой лежат изменения в синапсах. Согласно Bailey с соавторами (Bailey and Kandel, 1993; Bailey et al., 2000) пластичность синапсов можег быть разделена на 2 категории: 1) изменение уже существующих синапсов; и 2) изменение межнейронных связей, за счет образования новых синапсов или потери существующих. Считается, что 90% всех возбуждающих аксо-дендритпых синапсов гиппокампа располагается на дендритных шипиках. Таким образом, предполагается, что синаптическая пластичность связана с пластичностью дендритных шипиков. К сожалению, размеры дендритных шипиков очень малы, что не позволяет адекватно оценить их светомикроскопическими методами, включая конфокальную микроскопию. Вместе с тем, результаты количественного анализа и моделирования различных субклеточных структур па основе одиночных ультратонких срезов дают слишком большую ошибку (Coggeshall and Lekan, 1996). Кроме того, иногда невозможно точно идентифицировать дендритный шипик на одиночном срезе.
С появлением современных компьютеров, и специального программного обеспечения, а также с развитием технологий изготовления серийных ультратонких срезов, стало возможным получать точные количественные характеристики дендритных шипиков и других объекгов. В последнее время появляется все больше работ, посвященных трехмерным (3D) реконструкциям и стереологическому анализу дендритных шипиков и других компонентов синаптического аппарата. Подавляющее большинство этих работ связано с изучением пластичности синапсов in vitro, в то время как исследованиям in vivo уделяется намного меньше внимания.
Данная работа посвящена исследованию синапсов в поле СА1 гиппокампа in vivo. Поле СА1 было выбрано не случайно, так как оно содержит в молекулярном слое наиболее характерные для центральной нервной системы (ц.н.с.) синапсы, которые интенсивно исследуются как in vitro, так и in vivo (Fiala et al., 1998; Sorra and Harris, 1998; Harris, 1999; Hering and Sheng, 2001; Segal and Andersen, 2000). В качестве животных моделей были выбраны гибер нация якутского суслика (Citellus undulatus) и гипотермия крыс. Гибер нация сусликов и гипотермия у крыс позволяет получить альтернативные функциональные состояния нервной ткани с низкой эффективностью синаптической передачи при гипотермии/гибернации и нормально функционирующими синапсами в нормотермии, У гиберпирующих сусликов температура мозга падает до 0С, а у крыс искусственно вызванная гипотермия понижаег температуру мозга до 16-18С (Калабухов, 1985; Игнатьев, 1992). При таких температурах эффективность синаптической передачи резко снижается, тогда как последующее восстановление животных до нормотермии индуцирует нормальную работу синапсов. Это позволяет провести сравнительные исследования синапсов в нормотермии и в условиях низкой функциональной активности - гипотермии/гибернации. Электронно-микроскопические (ЭМ) исследования таких синапсов с использованием серийных ульгратонких срезов позволяют осуществить поиск морфологических коррелятов синаптической передачи на субмикрошюм уровне.
Целью настоящей работы явилось сравнительное количественное и качественное исследование in vivo организации асимметричных аксо-дендритпых синапсов в поле СА1 гиппокампа гибернирующих сусликов и гпотермпых крыс с использованием серийных ультратонких срезов и трехмерных реконструкций дендритных шипиков и синаптических органелл.
Исходя из этого нами были поставлены следующие задачи: 1. На основе серийных ультратонких срезов и 3D реконструкций провести количественный стереологический анализ in vivo 4 категорий синапсов в поле СА1 гиппокампа у гибернирующих сусликов и гипотермных крыс в альтернативных физиологических состояниях: гипотермия - нормотермия.
Провести количественный сравнительный анализ плотности синапсов в поле СА1 сусликов и крыс в альтернативных физиологических состояниях.
Выполнить 3D реконструкции дендритных шипиков, постеинаптических уплотнений и других синаптических структур в поле СА1 гип по пампа крысы и суслика.
Разработать программное обеспечение для анализа полученных трехмерных объектов.
В ходе настоящей работы установлено, что при снижении синаптической активности in vivo при гибернации и гипотермии происходят обратимые изменения в структуре синапсов: ретракция (втягивание) отдельных категорий дендритных гаи пиков, изменения их формы и объема. В поле СА1 впервые обнаружены мультисинаптические дендритные шипики, что расширяет наше представление об организации синапсов в ц.н.с. Показано существование мультисинаптических бутонов в поле СА1. Полученные 3D реконструкции митохондрий показывают, что в отличие от пресинаптических бутонов в дендритах существует сложная митохондриальная сеть, состоящая из гигантских ветвящихся митохондрий. Все эти данные свидетельствуют о более сложной организации и работе синапса, чем в классической модели Хебба (1961)
Структура и функции дендритных шипиков гиппокампа
С тех пор как дендритные шипики были открыты более 100 лет назад (Tanzt Е, Ramon-y-Cajal, 1893), серебрение по Гольджи долгое время было единственным методом их исследования. Это одна из наиболее ранних и часто используемых методик, разработанная Гольджи в 1880 г. Этим методом окрашиваются клеточные тела и отростки (аксоны и дендриты) в золотистый с коричневым опенком цвет. До настоящего времени неизвестны причины, почему прокрашиваются не все, а только небольшая часть клеток в популяции. Однако, если бы прокрашивались все клетки - ткань становилась бы непрозрачной и недоступной для исследования. При помощи мегода Гольджи было получено множество данных об архитектуре отростков нейронов из разных областей нервной системы. Во многих исследованиях для анализа дендритных шипиков по-прежнему применяется способ серебрения или хромирования нейронов по методу Гольджи и его модификациям (Horner, 1993). В частности, при помощи метода серебрения по Гольджи-Кокс были впервые получены данные по ретракции дендритных шипиков (Popov at al., 1992). Первый просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп был разработан немецкими учеными Руска и Кноль в 1931 г. Эффективное использование электронной микроскопии трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) началось с 1950 г (Миронов и др., 1994). Позже было разработано множество модификаций ТЭМ, таких как электронно-микроскопическая гистохимия, иммупоэлектронная микроскопия, электронно-микроскопическая авторадиография, замораживание скалывание - травление и др. (Миронов и др., 1994). С использованием всех этих методов было получено большое количество данных об ультраструктуро нейронов и, в частности, синапсов. С развитием компьтернои техники и метода серийных срезов появилась возможность моделировать различные субклеточные структуры, в том числе дендритные шипики, и их динамические изменения. 2.1.3. Конфокальная микроскопия и молекулярно-биологические методы.
С разработкой лазерной сканирующей микроскопии появилась возможность исследовать трехмерную структуру клеток. Однако, для идентификации конкретных структур необходимо внедрять в клетки специальные флуоресцирующие маркеры, что, само по себе может, нарушить исходную структуру. Кроме того, отдельные структуры, такие как дендритные шипики, слишком малы, чтобы можно было точно охарактеризовать их, используя только конфокальную микроскопию. В последние годы разработаны уникальные методы прижизненного анализа дендритных шипиков. Одним из таких методов является локальная суперфузия в пирамидные нейроны поля СА1 в органотипических культурах гиппокампа флуоресцентного красителя кальцеина с последующим получением трехмерных изображений с помощью двухфотошшго лазерного сканирующего конфокального микроскопа (Engert and Bonhoeffer, 1999). Было показано, что индукция длительной потенциации (longerm potentiation, LTP) в противоположность её блокировке, вызывает достоверное увеличение числа новых шипиков (Hngert and Bonhoeffer, 1999). Другим методом прижизненного исследования поведения дендритных шипиков является экспрессия гена GFP (green fluorescence protein) белка в нейронах. В исследовании (Maletic-Savatic at al., 1999) в качестве вектора, несущего ген GFP, был использован нейротропный рекомбинантный обол очечный РНК-овый вирус Синдбис, которым заражали СА1 пирамидные нейроны в органотипической культуре срезов гиппокампа. Концентрация вирусов подбиралась из расчета инфицирования от 1 до 10 нейронов на слайс (Maletic-Savatic at al., 1999). Было установлено, что инфицированные нейроны сохраняли активность в течение, по крайней мере, 3 дней. При этом использовали гиппокампы крыс на седьмой день постнаталыюго развития, так как выживаемость нейронов, полученных от взрослых крыс, была крайне низкой. С использованием двухфотонной сканирующей лазерной конфокальной микроскопии был проведен анализ трехмерной организации дендритных шипиков на глубине от 50 до 200 мкм в гиппокампальпых срезах. Обнаружено, что на дендритах возникают филоподии только в тех случаях, когда стимулирующий электрод располагался на расстоянии около 30 мкм от исследуемой зоны дендритов. Присутствие на этих структурах "головок" авторы трактовали в пользу образования новых зрелых дендритных шипиков в ответ на поеттетаническую стимуляцию и активацию ионотрошшх N-Memn-D-аспарагиновых (NMDA) рецепторов. Эти результаты прямо коррелируют с данными по суперфузии нейронов с помощью флуоресцентных красителей (Engert and Bonhoeffer, 1999). Наряду с таким бесспорным достоинством, как возможность прижизненного исследования субклеточных структур, существенным недостатком любого с вето- микроскопического метода является относительно низкая разрешающая способность, которая теоретически не может быть больше половины длины волны используемого света.
Даже в лучшем случае, при использовании специальных компьютерных программ в двухфотонной лазерной конфокальной микроскопии разрешение принципиально не может превышать 300-400 нм. В электронной же микроскопии при использовании метода ультратонких срезов разрешение обычно лучше 2-3 нм. Возможные артефакты при химической фиксации образцов мозга могут быть устранены параллельным использованием криофиксапии и криоультратомии быстро замороженной нервной ткани. 2.1.4. Трехмерная реконструкция и стереологический анализ. Как оказалось, результаты количественного анализа и моделирования различных субклеточных структур, в частности, синапсов на основе одиночных срезов дают слишком большую ошибку (Coggeshall and Lekan, 1996). Во многих работах (Coggeshall and Lekan, 1996; Chicurel and Harris, 1992; Fiala and Harris, 2001 (1,2); Geinisman at al., 1991, 1996; Harris, 1999 (1,2); Harris and Kater, 1994; Moser at al., 1994; Sorra at al., 1998; Spacek and Harris, 1997, 1998; West, 1999) подробно обосновывается значение количественного стереологического анализа как непредвзятого метода, так и необходимость получения трехмерных реконструкций. В настоящее время количественный стереологический анализ проводят на серийных срезах. Для того, чтобы точно охарактеризовать к какому типу, например к какой категории шипи кои, относится тот или иной объект, необходимо проследить его структуру на нескольких последовательных срезах, поскольку часть этого объекта, представленная на одиночном срезе не дает достаточной информации о его структуре (рис. 2). С другой стороны, трехмерная реконструкция позволяет охарактеризовать форму объекта, его объем, площадь поверхности, взаимоотношения с другими объектами. В последние годы на базе IBM PC разработаны относительно простые и всем доступные программы для проведения трехмерных реконструкций, позволяющие выполнять как стереологический анализ, так и трехмерную реконструкцию любых биологических объектов по серийным срезам (Fiala and Harris, 2001(1,2)).
Пластичность дендритных шипиков
Согласно (Bailey and Kandel, 1993; Bailey et al., 2000) пластичность синапсов может быть разделена на 2 категории: 1) изменение уже существующих синапсов; и 2) изменение межнейронных связей, за счет образования новых синапсов или потери существующих. Поскольку около 90% всех синапсов гиппокампа располагается на дендритных шипиках (Harris and Kater., 1994), и, как было показано выше (см. раздел 2.5.), форма и размер шипиков обуславливают функциональность синапсов, изменение синапсов непосредственно связано с изменением дендритных шипиков. В ранних исследованиях на мозге in vivo с использованием импрегнации серебром по метолу Гольджи было показано, что изменения в морфологии дендритных шипиках кореллируют с развитием, обучением, и старением животных (Purpura, 1974; Globus et al., 1973; Scheibel ct al., 1975). Было обнаружено, что в процессе старения кортикальные нейроны теряют до 50% дендритных шипиков, в то время как при обучении плотность дендритных шипиков возрастала (Feldman and Dovvd, 1975; Scheibel et al., 1975). 3.1. Длительная потенциация. Длительная потенциация (LTP), которая, как предполагается, является одним из механизмов памяти, приводит к изменению числа и структуры синапсов (Malenka and Nicoll, 1999; Bliss and Collingridge, 1993; Bliss and Lomo, 1973). Вместе с тем, согласно другим данным (Sorra and Harris, 1998) через 2 часа после LTP увеличения плотности синапсов не происходит. Более того, интенсивная активация гиппокампальных нейронов приводит к уменьшению плотности синапсов (Korkotian and Segal, 1999; Halpain et al., 1998; Jiang et al., 1998; Drakew et al., 1996). Однако, через 24 часа после LTP in vivo происходит увеличение числа синапсов (Weeks et al., 1998, 1999). Аналогичные данные были получены Geinisman (Geinisman et al., 1996) через 13 дней после индукции LTP. Muller (Muller at a 1,, 2000) было предложено, что увеличение числа синапсов после LTP происходит в течение длительного времени (не менее суток), что затрудняет изучение этого процесса на переживающих срезах гиппокампа. Более того, глобальное уменьшение активации синапсов, после приготовления срезов гиппокампа, уже само приводит к увеличению плотности синапсов (Kirov and Harris, 1999). 3.2. Обучение. Ранее было обнаружено (Hebb, 1949), что крысы, после обучения в обогащенной среде (enriched environment) лучше справляются с поведенческими задачами.
Недавно Rampon (Rampon et aL, 2000), с помощью стерео логического анализа, было показано, что после обучения в сложном окружении плотность синапсов в поле СА1 гиппокампа увеличивается на 20%, кроме того теми же авторами было показано, что увеличивается пропорция неперфорированных постсинаптических уплотнений, которые располагаются на тонких и пеньковых шипиках, а также на стволе дендрита. Таким образом, происходит не только изменение плотности синапсов, но возрастают определенные категории дендритных шипиков, в то время как число синапсов на грибовидных дендритных шипиках, на которых, как правило, располагаются перфорированные постсинаптические уплотнения, не изменяется (Rampon et al., 2000; Rampon and Tsien, 2000). Рядом авторов (Moscr et al., 1994; Trommald et al.,1996) было предложено, что увеличение числа синапсов при LTP и обучении происходит через образование разветвленных шипикои, из которых затем образуются шипики, контактирующие с тем же самым аксоном. Дендритные шипики отсутствуют, или их структура существенно нарушена при различных заболеваниях нервной системы, таких как синдром Дауна, унаследованный алкоголизм или унаследованные заболевания нервной системы (Hinton et al., 1991; Williams et al., 1990; Scheibel et al., 1974; Rothman and Olney, 1986; Purpura, 1974). Общей особенностью отсутствия шипиков является неспособность филоподий сформировать нормальные дендритные шипики. Эти патологии указывают на то, насколько важно для функционирования мозга нормальное протекание синаптогенеза и поддержание функциональной структуры шипиков. Кроме того, дендритные шипики могут быть потеряны дендритами после эпилептических приступов, инсультов, опухолей мозга, вследствие слабоумия или хронического алкоголизма (Williams et al., 1990; Scheibel et al., 1974; Rothman and Obey, 1986; Purpura, 1974). Как предполагается (Segal et al., 2000; Segal, 1995), одним из объяснений потери шипиков при "сверхактивации" синапсов, в частности эпилептических приступов, может быть накопление в шипиках токсичных для них концентраций кальция, что приводит к дегенерации шипиков и нарушению нормального функционирования нервной системы. 3.4. Циклические изменения дендритных шипиков. Изменения в дендритных шипиках происходят не только при обучении, старении или патологиях нервной системы. Впервые динамические изменения дендритных шипиков были показаны при гибернации (Popov, Bocharova 1992, Popov et al. 1992). Используя импрегнацию по Гольджи, было показано уменьшение количества синапсов и изменение морфологии дендритов при гибернации с последующим восстановлением при возвращении к нормотермии. Поскольку гибериация, как будет показано ниже, представляет собой цикличный процесс, при гибернации происходят циклические изменения плотности синапсов. Wool ley and McEwen показали, что у самок крыс в эструсе происходит увеличение плотности синапсов, обусловленное повышением уровня стероидного гормона эстрадиола (Woolley and McEwen, 1993). Причем увеличение плотности синапсов происходит за счет увеличения аксо-шипиковых синапсов, но не аксо-дендритных, что свидетельствует об образовании новых шипиков. (Woolley and McEwen, 1992). Такое увеличение плотности синапсов на физиологическом уровне кореллирует с повышением возбудимости (Woolley and McEwen, 1993).
Таким образом, дендритные шипики представляют собой динамичные, а не статичные образования, количество и структура которых находится в зависимости от физиологического состояния, процессов обучения, забывания или различных патологий. Однако, следует отметить, что в настоящее время пересматриваются многие ранее полученные данные, поскольку ранние работы с использованием электронной микроскопии выполнялись по случайным срезам, что, как показано в разделе 2.1.5., не позволяют адекватно оценить плотность синапсов, размеры и форму дендритных шипиков. 4, Гибернация и гипотермия как естественные модели для изучения синапсов в различных функциональных состояниях. Под терминами гибернация и гипотермия подразумеваются такие состояния организма, которые характеризуются пониженной температурой тела и значительным снижением физиологической активности. Их различие состоит в том, что гибернация является частью жизненного цикла зимоспящих животных, то есть они входят в состояние гибернации спонтанно и это считается приспособительной реакцией организма на условия внешней среды (Игнатьев и др. 1998). На протяжении многих лет известно, что подобные реакции можно вызвать у гомойотермных животных, не гибернирующих в естественных условиях (Майстрах 1964, Игнатьев и др. 1998). Одним из ігаиболее интересных объектов исследования является якутский суслик (Citellus undulatus), так как в состоянии гибернации температура тела суслика составляет в среднем 4 С, а в некоторых случаях достигает О С, или даже небольших отрицательных величин (Popov et al., 1992, Игнатьев и др. 1998). В течение гибернации, во время баута, наблюдается крайне низкая электрическая активность мозга, которая очень быстро меняется, в случае спонтанного или искусственно вызванного пробуждения (Игнатьев 1998). Таким образом гибернирующие животные предоставляют возможность сравнить морфологию определённых нейронов мозга в таких альтернативных функциональных состояниях, как нормальное и неактивное. Спонтанное пробуждение сусликов происходит периодически и таким образом период гибернации разделён на чередующиеся между собой бауты гибернации и короткие периоды нормотермии (Игнатьев 1998). С начала пробуждения, в течение двух часов суслики восстанавливают нормальную температуру тела и просыпаются. В 1992 году Попов с соавторами обнаружили, что в поле САЗ гиппокампа якутского суслика, который является естественным гибернатором, в ходе периода гибернации происходят значительные изменения
Приготовление образцов для световой и электронной микроскопии
Перед эвтаназией животным вводили гексенал из расчета 70 мг/кг массы животного. Наркотизированных животных помещали на стол спиной вниз, лапы фиксировали булавками. Пред варите л ыгуго фиксацию мозга проводили методом перфузии кровеносного русла. Метод перфузии используется для того, чтобы максимально быстро зафиксировать тот или иной орган, используя кровеносную систему животного для доставки фиксатора в ткань. Фиксация мозга методом перфузии широко применяется при фиксации ткани для электронной микроскопии. Перфузия. Освобождали сердце животного, вскрывая ножницами брюшную полость и грудную клетку. Далее надрезали правое предсердие, затем левый желудочек. Перфузию осуществляли через пластиковую канюлю, введённую в аорту. Сначала кровеносную система отмывали от крови физиологическим раствором, содержащим 10тМ фосфатный буфер рП=7.4 и гепарин 120 ед/л, в течение не более 5 минут. Окончание промывания определяли по выходу раствора и просветлению ткани печени, затем животные перфузировали фиксирующим раствором содержащим: 1) 0.9%NaCl 2) 10 mM фосфатный буфер 3) 3% формальдегид 4) 0.5% глутаральдегид 5) гепарин 120 ед/л в течение не менее 5 минут, точное время определяли по появлению ригидности мышц шеи и пояса передних конечностей. Температура обоих растворов была понижена до 20 С для улучшения сохранности тканей мозга. Давление растворов подаваемых в кровеносное русло крыс и сусликов составляло 50 мм водяного столба. После перфузии животных декапитировали, вскрывали черепную коробку и выделяли головной мозг. Затем выделяли гиппокамп (правый и левый). Далее выделенные гиппокампы фиксировали в растворе содержавшем: 1) 3% формальдегид 2) 2,5% глутаральдегид 3) О.Ш Na-какодилатный буфер (рН = 7.4) в течение 1-2 часа, после чего гиппокампы нарезали на сегменты, толщиной 0.5-1 мм и помещали на дофиксацию в тот же фиксатор на 2-4 часа. После фиксации в 2.5% глутаровом альдегиде, сегменты гиппокампов троекратно промывали в 0.1 М Na-какодилатном буфере (рН 7.4) и затем постфиксировали в растворе содержавшем: 1) 1%OS04 2) 0.1 М Na-какодилатный буфер (рН 7.4) в течение не менее 6 часов при комнатной температуре. Далее проводили обезвоживание, и замещение воды смолой ("проводка") путем проведения образцов по раду следующих растворов (Таблица 1). Процедуру проводили при комнатной температуре под вытяжкой. После "проводки" избыток смеси смола/ацетон в образцах удаляли с помощью фильтровальной бумаги. Образцы помещали в индивидуальные контейнеры и заключали в 100% смолу.
Контейнеры с образцами выдерживали при температуре 37СМ0С в течение одного часа, а затем помещали в термостат с температурой 60 С на 36-48 часов для полимеризации. Для приготовления серий ультратонких срезов использовался ультрамикротом "Ultracut Е" Reihert-Jung, (Австрия) и стеклянные ножи изготовленные на станке для изготовления стеклянных ножей "Knife Maker" Reihert-Jung, (Австрия). Для получения серий с нужного участка сначала срезали несколько полутонких срезов (толщина среза = 1 мкм), которые затем окрашивали метиленовым сипим или толуидиновым сипим. На этих срезах под микроскопом определяли местоположение требуемого участка па блоке приблизительно 150-200 мкм от сом нейронов поля СА1 гиппокампа (Fiala et al., 1998; Попов, 2003) (рис. 4). Затем на найденном участке специальным образом готовили отвесный столбик высотой около 50 мкм, который на всем протяжении имел прямоугольное сечение: одна сторона такого прямоугольника была 10-20 мкм, а другая не менее 100 мкм. Ультратонкие срезы толщиной 60 - 70 нм готовили в автоматическом режиме на ультрамикротоме, экспериментально подбирая оптимальную скорость резки, чтобы исключить вибрацию. Полученные в виде непрерывной ленты срезы располагались на поверхности ванночки ножа. Ленту с помощью ресничек разбивали па серии срезов, состоящих обычно из 35-50 срезов. Не теряя ориентации, такие ленточки снимали на специальные медные или никелевые бленды, покрытые плёнкой из пиолоформа. Подготовка пленок из пиолоформа Для приготовления пленок использовали 1-1.5% раствор пиолоформа в хлороформе. Предметные стекла очищали от пыли и жира при помощи бритвенных лезвий и специально очищенной бумаги. Затем предметные стекла опускали в раствор пиолоформа и немедленно аккуратно извлекали. После высыхания хлороформа на предметном стекле образовывалась плепка пиолоформа. Далее пленки снимали на дистиллированную воду, на пленки укладывали бленды. Сверху на бленды помещали парафильм, затем бленды с пленками помещали в чашки Петри для хранения. Перед просмотром в электронном микроскопе срезы контрастировали раствором уранилацета (насыщенный раствор на 70% спирте) в течение 10-20 минут, трижды промывали в дистиллированной воде и высушивали. Дополнительно окрашивали в течение 10-20 минут в растворе цитрата свинца, трижды промывали в дистиллированной воде и высушивали. Для приготовления раствора цитрата свинца 1.33 г РЫЧОз и 1.76 г безводного трёхзамещённого цитрата натрия смешивали с 30 мл Н20, затем к получившейся творожистой массе добавляли 8 мл 1М NaOH, после чего раствор доводили до общего объема 50 мл и интенсивно размешивали до полного просветления. Для приготовления насыщенного раствора уранилацетата в 70 % раствор этилового спирта добавлялся уранил ацетат в избытке. Исследование ультратонких серий в электронном микроскопе. Исследование ультратонких срезов проводили на электронном микроскопе JEOL 1200-ЕХ (Япония) в ФИБХ РАН. Предварительно была определена оптимальная светочувствительность для пленок (фототехническая пленка ФТ-41МД, светочувствительность 6,5) и микроскопа. Для этого один и тот же участок образца снимали при разной светочувствительности (sensitivity). Затем негативы проявляли при комнатной температуре в свежем проявителе. В микроскопе выставляли такую чувствительность (в нашем случае - 10), при которой наблюдали наиболее качественные негативы при выдержке в проявителе 4 минуты. Тестирование увеличения проводили с помощью специальной реплики 2160 линий/мм. Для каждой серии было приготовлено не менее 50-120 идентичных участков, которые были отсняты на фотопленку при увеличении хбООО. Обработка негативов. Отснятые негативы обрабатывали в темной комнате на темно красном свету. Негативы проявляли в течение 4 минут в свежем проявителе (состав проявителя и закрепителя указан ниже), затем промывали в проточной воде в течение не менее 30 секунд, далее закрепляли в закрепителе в течение 6-10 минут, промывали в проточной воде, а затем в дистиллированной воде.
Готовые негативы высушивали в шкафу (SO-250, Hlectromedicine) в потоке теплого воздуха. 6 г. 67.5 г. 12 г. Зг. 60 г. До 3-х литров 750 г. 75 г. 10 мл. До 3-х литров Состав проявителя. Метол Na2S03 Гидрохинон КВг Na2C03 Дистиллированная вода Состав закрепителя. Na2S203 Na2S03 Ледяная уксусная кислота Дистиллированная вода 5. Трехмерная реконструкция и количественный стереологический анализ дендритных шипиков и синаптических структур. Ввод в компьютер и выстраивание изображений. Серии негативов сканировали просвечивающим сканнером Mustek 1200 на разрешении 900 dpi, после чего изображения инвертировали и настраивали с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop 6.0. Для компенсации деформаций ткани в процессах резки, контрастирования и микроскопирования осуществляли выстраивание (выравнивание) изображений. Для выстраивания изображений использовали специальное программное обеспечение IGL Align 1.0lb и SEM Align 1.26b разработанное Dr. John Fiala (Бостонский университет, США) (http://www.synapses.bu.udu/). Стереологический анализ. Стереологический анализ проводили, как на фотографиях отпечатанных с негативов, так и на выстроенных сериях. Па среднем срезе серии отыскивали и нумеровали все синапсы, затем каждый из этих синапсов прослеживали на прилегающих срезах серии, где в случае обнаружения рядом с ним выставлялся тот же номер. Критерием идентификации синапса являлось присутствие как постсинаптического уплотнения со стороны постсиналтической части, так и присутствие, по крайней мере, 2-3 пресинаптических везикул (пузырьков) с аксональной стороны. Далее делали заключение о том, к какой категории относится данный синапс согласно классификации дендритных шипиков по Peters, Kaisermajrm-Abramof (Peters, Kaiscrmann-Abramof 1970), после чего информация об этом синапсе заносили в специальную таблицу. После идентификации всех шипиков па среднем срезе брался следующий срез, на нём отыскивали непронумерованные шипики, которые обрабатывали таким же образом.
Трехмерная организация тонких и грибовидных дендритных шипиков в зависимости от функционального состояния ц.н.с.
3D реконструкции позволяют получить количественные и качественные характеристики синапгических структур. Чтобы определить влияет ли гибернация и гипотермия на трехмерную структуру дендритных шипиков, нами были выполнены 3D реконструкции нескольких сотен тонких и грибовидных шипиков. Тонкие и грибовидные шипики были выбраны потому, что при нормотермии это наиболее распространенные типы шипиков в иоле СА1. Основной характеристикой тонких шипиков является их длина, тогда как для грибовидных шипиков более интересны изменения их формы и объема, поскольку отношение объема головки шипика к объему ножки у грибовидных шипиков существенно больше, чем у тонких. На рис. 10 и 11 показаны изменения объемов и площадей поверхностей грибовидных и тонких дендритных шипиков при гиберпации и гипотермии. На рис. 12 показаны трехмерные реконструкции дендритных шипиков. Видно, что при гипотермии наблюдается тенденция к уменьшению объемов тонких и грибовидных шипиков при гибернации сусликов, в то же время при гипотермии крыс объемы шипиков достоверно увеличиваются. Уменьшение объема тонких шипиков при гипотермии может быть связано с тем, что ретракция некоторых тонких шипиков проходит не полиостью. Вероятно, некоторые гонкие шипики укорачиваются, при этом должна уменьшаться длина ножки шипика. Как известно, ножки шипиков могут замедлять перенос возбуждения от синапсов к дендриту (Segev and Rail, 1988, 1998). Чем длиннее ножка шипика, тем с большим запаздыванием происходит перенос сигнала, от головки шипика к дендриту. Таким образом, ретракция дендритных шипиков, а также укорачивание их ножек, при гипотермии может модулировать кооперативную работу синапсов в условиях низкой синаптической активности. Известно, что для нормального функционирования шипика необходимы высокие концентрации кальция (Segal, 1995). Harris (1999) была предложена модель, согласно которой повышение концентрации кальция в шипике вследствие повышения синаптическои активности приводит к удлинению шипиков.
Таки образом, можно предположить, что снижение синаптическои активности, в свою очередь, приводит к ретракции шипиков, через снижение концентрации кальция в шипике. 2.2. Изменение формы дендритных шипиков при гибернации и гипотермии. Проблема изменчивости формы и изменения размеров морфологических объектов - одна из фундаментальных проблем биологии (Павлинов и Ми кеш и на, 2002). Объемы разных шипиков значительно варьируют (более чем в 10 раз) (Harris et al., 1992; Harris and Kater, 1994; Trommald and Hulleberg, 1997). Ранее Desmond and Levy (1986; 1988) с использованием "несерийных" срезов было показано, что LTP индуцировала переход дендритных шипиков в зубчатой фасции из выпуклой формы в вогнутую. Desmond and Levy (1986; 1988) предположили, что переход формы шипика от выпуклой к вогнутой связан с увеличением площади контакта постсинаптической мембраны шипика с пресинаптическим бутоном. Однако, до сих пор задача об изменении формы дендритных шипиков при различных физиологических воздействиях не решена. И вопросы более точной постановки этой задачи и нахождения адекватных методов ее решения остаются актуальными. Одной из характеристик изменения формы шипиков является изменение площади поверхности. Однако, поскольку площадь поверхности шипика сложным образом зависит как от формы шипика, так и от его объема, то вычленить компонент изменения формы можно только тогда, когда мы перейдем к ее описанию, которое не опирается явным образом на размер шипика. Поэтому, мы нормируем все размеры шипиков, то-есть приводим их к одному и тому же объему. В программах для трехмерных реконструкций объемы и площади поверхностей шипиков вычисляются и можно по значениям величин объемов и площадей вычислить коэффициенты пересчета площади поверхности для каждого шипика при объеме, приведенном к одинаковому значению (нормализация по объему). Объем шипика определяется по формуле 1. Для автоматизации расчетов нами была разработана программа для автоматического пересчета площади поверхности по формуле (6). По полученным нами 3D реконструкциям шипиков определяем площадь поверхности каждого шипика, отнормиропаниого к объему в 1 MKMJ. ИЗ полученных 3D реконструкций видно, что в популяции ш и пиков можно выделить два качественных класса : "объемные" и "плоские" дендритные шипики, (рис 13). Из рисунков 14 -17 видно, что при гибернации сусликов происходит уменьшение площади поверхности тонких и грибовидных шипиков, они принимают сферическую форму. Из рисунков 14, 16 видно, что распределение площади поверхности нормализованных по объему грибовидных шипиков неоднородно. Для тонких шипиков (рис. 15, 16) такое распределение менее выражено. Эти данные согласуются с визуальным разделением форм шипиков на два класса. В последние годы показано, что в поле СА1 гиппокампа присутствуют мультисинаптические аксональные бутоны (Shepherd and Harris, 1998; Geinisman et al., 2001), образующие синапсы с несколькими дендритными шипиками (рис. 18). При выполнении трехмерных реконструкций дендритов, аксонов и дендритных шипиков нами были также обнаружены мультисинаптические дендритные шипики - образующие синапсы как с одним и тем же, так и с разными аксонами. Такие шипики были обнаружены при разных состояниях (нормотермия, гипотермия) как у крыс, так и у сусликов. Вместе с тем число таких шипиков, так же как и разветвленных шипиков крайне мало - меньше 0.5 %, что затрудняет их статистический анализ.
Обнаруженные мультисинаптические шипики контактируют с разным числом аксональных бутонов - от двух до восьми. На рис, 19 показан один из примеров, когда дендритный шиник образует синапсы с 8-ю аксонами. Полученные нами результаты расширяют наши представления об организации синапсов гшшокампа. До настоящего времени было общепринято, что один дендритный шипик образует один синапс. Рядом авторов (Moser et al., 1994; Trommald et al.,1996) было предложено, что увеличение числа синапсов при LTP и обучении происходит через «расщепление» шипиков и образование разветвленных шипиков, из которых затем образуются шипики, контактирующие с тем же самым аксоном (Toni et al., 2001). Можно было бы предположить, что мультисинаптические шипики, обнаруженные нами, образуются сходным образом. Однако, в нашем случае шипики контактируют с разными аксонами и это свидетельствует о других механизмах формирования мультисинаптических дендритных шипиков. Функциональное значение таких мультисинаптических шипиков не ясно. Трудно представить, для чего нужны такие сложные структуры и как они работают в мозге in vivo. Вполне вероятно, что такие шипики участвуют в обработке информации уже на уровне самого шипика, а не дендрита. 4. Организация митохондрий в дендритах и аксонах. Вопрос о наличии в дендритах нервных клеток одной или нескольких митохондрий всё еще актуален (Collins et al., 2002). Предполагается возможность существования гигантской митохондрии, внутренняя мембрана которой могла бы служить "электрическим кабелем", обеспечивающим перераспределение энергии между разными частями клетки (Sk.ula.chev, 2001). Известно, что в пресинаптических бутонах аксонов содержатся небольшие по размерам, отдельные митохондрии. В некоторых бутонах они даже могут отсутствовать (Shepherd and Harris, 1998). В то же время организация митохондрий в дендритах изучена недостаточно хорошо. Ранее было показано, что как нейроны, так и другие тины клеток содержат гетерогенные популяции многочисленных митохондрий, максимальная длина которых не превышает 5 мкм (Collins et al., 2002). В наших исследованиях при помощи трехмерных реконструкций сегментов дендритов в поле СА1 гиипокампа сусликов и крыс с использованием серийных ультратонких срезов (более 100 срезов на серию) были обнаружены гигантские разветвленные митохондрии длиной не менее 10-15 мкм. На рис. 8 в разделе о ретракции шипиков были показаны сегменты дендритов сусликов с реконструированными гигантскими митохондриями.
