Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 .Классификация рецепторов ГАМК 9
1.1.1. ГАМКА-рецепторы 9
Структурная организация 9
Функциональные свойства 12
1.1.2. ГАМКв-рецепторы 14
1.1.3. ГАМКс-рецепторы ..15
1.1.4. «Нетипичные» ГАМК рецепторы 16
1.2. Субъединичная композиция ГАМКергических рецепторов в различных нейронах гиппокампа 18
1.3.Организация синаптических связей гиппокампа 21
1 АТормозные постсинаптические токи и потенциалы 24
1.4.1 .Механизм генерации и функциональные свойства ионотропных ТПСТ 24
1.4.2.Особенности ГАМК ТПСТ гишгокампальных нейронов 27
1.4.3 .Влияние различных модуляторов на ТПСТ 29
1.4.4.Действие ионов различных металлов 31
1.4.5.Влияние глии 32
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1 .Приготовление срезов 34
2.2.Конструкция инкубационной камеры 38
2.3.Конструкция регистрационной камеры 39
2.4.Изготовление микроэлектродов 39
2.5.Идентификация клеток 41
2.6. Рабочая установка для регистрации токов от переживающих срезов мозга 43
2.7.Порядок проведения опытов 45
2.8.Система быстрой аппликации растворов 46
2.9.Система раздражения 48
2.10. Приготовление растворов веществ 49
2.11.Вычленение ГАМКА ТПСТ 50
2.12.Анализ вызванных ГАМК ТПСТ в режиме фиксации потенциала 51
2.13 .Анализ спонтанных ГАМКд ТПСТ 53
2.14,Стастический анализ 55
Глава 3. Результаты 56
3.1.Модуляция вызванных ТПСТ различными фармакологическими веществами: лантан, диазепам, золпидем 56
3.1.1. Влияние ионов трехвалентного лантана на ТПСП 56
3.1.2. Влияние диазепама и золпидема на ТПСТ 65
3.1.2.1 .Влияние диазепама и золпидема на ТПСТ, вызванные раздельной стимуляцией str.radiatum или str.oriens 65
3.1.2.2.Влияние диазепама и золпидема на ТПСТ, вызванные поочередной ритмической стимуляцией str.radiatum и str.oriens 68
3.2, Миниатюрные токи и их модуляция . 74
3.2.1 .Природа миниатюрных токов пирамид С А1 74
3.2.2. Модуляция ГАМК сТПСТ в нейронах СА1 76
Глава 4. Обсуждение и выводы 84
4.1 .Методические особенности исследования 84
4.1.1.Выбор объектов и методов исследования 84
4.1.2.Селективные модуляторы 85
4.1.3.Природа ГАМКА активируемого тока 86
4.2.Модулирующее действие хлорида лантана, зольпидема и диазепама на ГАМК ТПСТ 87
4.2.1. .Общая характеристика 87
4.2.2.Модулирующее действие лантана 88
4.2.2.1.Лантан потенциирует ГАМК ТПСТ в нейронах СА1, и по-разному влияет на ТПСТ, вызванные стимуляцией str.radiatum и str.oriens 88
4.2.2.2. Действие лантана, зависит от возраста животного 90
4.2.3.Модулирующее действие диазепама и зольпидема на токи, вызываемые ГАМК 94
Выводы 98
Список литературы 99
- Субъединичная композиция ГАМКергических рецепторов в различных нейронах гиппокампа
- Рабочая установка для регистрации токов от переживающих срезов мозга
- Влияние ионов трехвалентного лантана на ТПСП
- Действие лантана, зависит от возраста животного
Субъединичная композиция ГАМКергических рецепторов в различных нейронах гиппокампа
На сегодняшний день известно, что ГАМКд рецепторы пирамид области СА1 гиппокампа содержат различные субъединицы, включающие al, a2, «4, a5, р2, рЗ, у2 и 5 [G.Sperk et al 1997,1998]. В свете исследований экспрессии разных субъединиц [Barnard 1998; Brown et al 2002; Demuro et al 2000;. Fisher, Macdonald 1997;. Hajos et al 2000;. Im et al 1992; Makela et al 1999;. Nurse,. Lacaille 1997] известно, что они могут образовывать рецепторы как чувствительные так и нечувствительные к различным модуляторам ГАМКергической синаптической передачи. Сочетания субъединиц наиболее характерные для некоторых типов нейронов гиппокампа (по данным [Barnard et al 1998, Saxena 1997]) приведены в таблице 1.1
Также известно, что субъениничный состав совокупности ГАМКА рецепторов нейронов СА1 с возрастом претерпевает существенные изменения. Из данных авторов [Ramos 2004, Garrett 1990] следует, что содержание а5 субъединицы (присутствие которой обуславливает уменьшение ГАМК ТПСТ при помощи хлорида лантана), в соме пирамид СА1 на протяжении 25 суток непрерывно снижается. Похожее возрастное соотношение показано и для аЗ. Существуют доказательства, что содержание ct2 самое высокое в более молодой ткани (показано на нейронах различных структур мозга, в том числе и на гиппокампе [Davis et al.2000,Cheng et al.2001]. Показано, что группы субъединиц объединяющие а5-субъединицы с а1 с возрастом становятся более редкими, поскольку содержание собственно а5-субъединицы зависит от возраста обратно пропорционально. Эти данные были продемонстрированы для нейронов СА1 [Hutcheon 2004]. В целом, авторы этих исследований указывают, что композиционное регулирование ГАМКА рецептора является как синаптическим, так и экстрасинаптическим, отражая сложные клеточные механизмы взаимосвязи.
Помимо качественного состава субъединиц, ГАМКд рецепторы нейронов СА1 претерпевают с возрастом дифференциацию в зависимости от локализации в пределах одного нейрона. Например, показано, что а.5 субъединица, присутствие которой связывают с особой чувтвительностью ГАМКд рецепторов к хлориду трехвалентного лантана, в пирамидах СА1 в возрасте Р0-Р10 локализована в основном в телах и только с увеличением возраста (Р10-Р25) начинает появляться в дендритах [Ramos 2004, Garrett 1990]. Похожее возрастное соотношение показано и для аЗ. Существуют доказательства, что содержание ос2 самое высокое в более молодой ткани (показано на нейронах различных структур мозга, в том числе и на гиппокампе [Davis et al.2000,Cheng et al.2001].
Данные о наличии различных сочетаний субъединиц в ГАМКд рецепторах и, как следствие дифференциации их функциональных свойств, непрерывно пополняются. Описаны также нетипичные фармакологические свойства ГАМКсргических рецепторов в гиппокампальных интерпейронах, объясняемые специфическим составом их субьединиц При этом отмечается схожесть свойств ГАМКА и ГАМКС рецепторов. [Семьянов 2000,2003] Эти данные указывают на теоретическую возможность определенных отклонений ГАМКергических токов в гиппокампе от фармакологического профиля токов, опосредованных классическими ГАМКА рецепторами. Иммуноцитохимические исследования также показали, что плотность у; субъединиц намного выше в интернейронах поля СА1, чем в пирамидных клетках [Sperk et al. 1997]. Современные работы [Семьянов 2002,2003] указывают на наличие в гиппокампальных интернейронах ГАМКергических рецепторов с новым фармакологическим профилем, которые обладают сниженной чувствительностью к пикротоксину, нечувствительны к золпидему и активируются ГАМК, САСА и изогувазином. В них наблюдается сходная чувствительность к бикукуллину и пентобарбиталу, как в ГАМКд рецепторах. При этом они, хотя и частично, чувствительны к ТРМРА, как ГАМКс рецепторы. В целом, ионотропные ГАМКергические рецепторы в интернейронах не гомогенны. В отсутствие пикротоксина они менее чувствительны к ТРМРА и, наоборот, более чувствительны к золпидему. Очевидным из объяснений данному феномену является наличие в интернейронах как нетипичных ионотропных ГАМК рецепторов, так и класических ГАМКД рецепторов.
Данные о том, что средняя проводимость одиночного канала ГАМКергических рецепторов в интернейронах ниже, чем в пирамидных клетках (-22 пС и -33 пС), указывают на наличие различий в аминокислотной последовательности в домене М2, формирующем канал. Хотя размер поры канала ГАМКд и ГАМКс рецепторов считается одинаковым, проводимость одиночного канала ГАМКС рецепторов значительно ниже (—1-5 пС и -30 пС) [Feigenspan and Bormann 1994; Wotring et al. 1999; Zhang et al. 2001].
Поскольку в нашей работе исследуются синаптические токи в нейронах гиппокампа. мы остановимся на основных чертах строения этой структуры, ее клеточным составом и функциональными свойствами отдельных нейронов.
Гиппокампова формация состоит из двух отделов, собственно гиппокампа и зубчатой фасции. Гиппокамп представляет собой корковую структуру, характеризующуюся хорошо выраженными слоями, образованными плотно упакованными клетками и их отростками, имеющими упорядоченную организацию. Авторы [Lorente de No 1934] предложили деление гиппокампа на несколько цитоархитектонических полей: СА1 - СА4 (Рис. 1.6 ).
Рабочая установка для регистрации токов от переживающих срезов мозга
Для визуального контроля за ходом экспериментов использовали неинвертированный микроскоп (2). Столик микроскопа служил подставкой для регистрационной камеры. Сигнал, отводимый от клетки, преобразовывался во входном каскаде усилителя (4). представляющего собой I-V преобразователь. Входной каскад усилителя был заключен в корпусе измерительной головки прибора (4). На корпусе головки был также размещен держатель для электродов. В работе использовался усилитель(5) БРС-7 фирмы НЕКА (Германия). В усилителе, в данной работе, использовался один выход и один вход. С выхода сигнал, прошедший фильтр низких частот ( ЗкГц, 3-х полюсный фильтр Бесселя), поступал на вход АЦП (6), где он оцифровывался при частоте 500 Гц. и преобразовывался программой регистрации во внутренний формат данных и сохранялся на жестком диске для последующего анализа. На вход усилителя ( V-командное ) подавался сигнал, задающий фиксированный потенциал. Внешний вид всей установки представлен на Рис.2.10.
В работе была использована 12-битная плата АЦП/ЦАП L-153 (АО L-card. г. Москва), которая была вставлена в ISA-разъем на материнской плате PC с процессором Intel 486 (7). Выходы ЦАП (6). использовали для подачи командных сигналов на вход усилителя. Для исследования кинетических характеристик ответов, записи, полученные в ходе регистрации, сначала экспортировали в виде текстовых файлов ASCCI. Обработку результатов проводили с использованием стандартных пакетов программ, таких как Excel (Microsoft Corporation) и Prizm (\3 GraphPad Software. San Diego. CA), вводя данные с клавиатуры либо, импортируя их из текстовых файлов. Аппроксимацию данных различными кривыми, статистическую обработку данных и их графическое представление осуществляли с помощью программы Prizm.
Перед началом экспериментов запускалась программа, с помощью которой велось управление подаваемыми на усилитель сигналами и, по команде экспериментатора, велась запись электрической активности клетки.
Все операции по регистрации тока и потенциалов проводились не раньше чем через ЗОмин после помещения среза в регистрационной камеру. Заполненный внутриклеточным раствором электрод, при поданном на него небольшом позитивном давлении (0,1-0,2атм), вводился в поле зрения микроскопа над заранее выбранной клеткой в срезе. Усилитель в это время находился в режиме фиксации потенциала, удерживаемое значение потенциала составляло 0 мВ. На этом этапе компенсировали контактную разность потенциалов с тем, чтобы ток через электрод был равен нулю. При этом с платы АЦП/ЦАП на усилитель периодически подавалась гиперполяризующая ступенька напряжения (-5 мВ длительностью 10 мс), что позволяло оценить сопротивление электрода. Программой оценивалось это значение и выдавалось в виде звукового сигнала определенной высоты тона через стандартный динамик PC.
Электрод подводили к выбранной клетке, слегка продавливая ее, сбрасывали положительное давление и прикладывали небольшое отрицательное. Затем электрод отводился немного назад (для того, чтобы, возможно прилипшее в месте касания, ядро клетки не имело возможности закрыть собой будущее отверстие в мембране), и ждали установления высокоомного контакта (не менее 900мОм). Этот этап продолжался 1-10 с. После образования гигаомного контакта отрицательное давление сбрасывали, а удерживаемую разность потенциалов устанавливали равной -70 мВ. Для разрушения клеточной мембраны под электродом, прикладывали короткие по продолжительности импульсы разряжения. Разрушение мембраны было заметно по характерному изменению формы отклика системы в ответ на гиперполяризующую ступеньку напряжения, генерируемую программой.
О жизнеспособности клеток судили по их способности генерировать потенциал действия в ответ на деполяризующую ступеньку напряжения (амплитудой 30 мВ и продолжительностью 20 мс).
Использованная в данной работе система аппликации была разработана мной в нашей лаборатории совместно со многими сотрудниками (Рис.2.11). При конструировании этой системы было желание реализовать три основных принципа: 1 - как можно более быстрая смена раствора в рабочей камере (30 сек); 2 как можно наименьший объем раствора, необходимого для аппликации (10 мл); 3 - обеспечить одинаковое насыщение апплицируемого и основного растворов в течение эксперимента. Центральной частью системы являются два стеклянных цилиндра (А и Б) объемом 10мл каждый, в которых происходит насыщение растворов газовой смесью. Растворы непрерывно циркулируют по системе трубок при помощи перистальтического насоса (1). Заполнение цилиндров производилось шприцем емкостью 10мл через незамкнутые верхние части, также туда же поступал и рециркулируемый раствор (трубки 9.10,11). В нижней части каждого из цилиндров находятся три отверстия: первое - для подачи газовой смеси (2). второе - для оперативного удаления раствора (3), третье - выход для подачи раствора из цилиндра в рабочую камеру или приемную лунку холостой прокачки. На рисунке 2.12. показано, что в цилиндрах А и Б. при любом положении аппликационной системы, находится один и тот же тип раствора: в цилиндре А - основной раствор; в цилиндре Б - апплицируемый (т.е. основной раствор плюс апплицируемые на срез вещества). При нахождении аппликационной системы в позиции I. нормальный раствор (цилиндр А) протекает по трубке (9), а в позиции II протекает по трубке (11). вхолостую, и, минуя срез, по трубке (9) возвращается в цилиндр А. Апплицируемый раствор (цилиндр Б) в позиции I протекает вхолостую через трубку (10), а в позиции II - через срез по трубке (9) возвращается в цилиндр Б. Таким образом обеспечивается несмешивание двух растворов. Позиционирование системы аппликации производилось вручную.
Влияние ионов трехвалентного лантана на ТПСП
Паши эксперименты показали, что Л. потенцирует амплитуду ГАМК ТПСТ, в нейронах поля СА1 гиппокампа. В начальных экспериментах, проводимых без блокады НМДА рецепторов, действие Л. также проявлялось в потснциации ТПСТ, хотя и в меньшей степени, чем при блокаде рецепторов, обуславливающих вход в клетку катионов (рис.3.2,). Эти данные, полученные нами на срезах, соответствуют результатам исследований, проводимых в нашей лаборатории на изолированных нейронах ряда областей мозга, в том числе и гиппокампа с прямой аппликацией вещества к поверхности нейрона [Колбаев.2002; Скрсбицкий 2003; Чечулина 2005]
Дальнейшие исследования показали, что потенциация вызванных ГАМК ТПСТ имеет входоспецифичность. В тех случаях, когда ТПСТ вызывались стимуляцией s.o., аппликация Л., как правило, увеличивала амплитуду ответа на 30-70% (в среднем 150±18% от контроля, р 0.05, п=14). Стимуляция s.r., наоборот, при аппликации Л. не вызывала существенных изменений (96±12% от контроля, р 0.05, п= 21). Однако эти данные были получены в экспериментах, где для одного нейрона стимулировалась только одна группа дендритов. В каждой отдельной регистрации ТПСТ имелись различные пороги насыщения, несколько разное расположение стимулирующих электродов, различный возраст животного и т.п. Поэтому, сравнению подлежали только относительные величины параметров ТПСТ.
Для того, чтобы провести сравнение стимуляции разных входов более аккуратно была проведена серия экспериментов с поочередной стимуляцией этих входов к одной клетке (п=5). Результаты экспериментов полностью подтвердили первоначальные данные о различном действии Л. в пределах одного нейрона: Л. вызывал увеличение амплитуды ответов на раздражение s.o. (150% от контроля) и практически оставлял без изменения ответы на s.r. (96%). Полученные данные для Л. при раздельной стимуляции s.r. и s.o. на одной клетке могут свидетельствовать о правильности предположения о различных свойствах ГАМКд рецепторов в различных дендритах одного нейрона.
Несмотря на относительно хорошую изученность морфологии пирамид СА1, основная трудность состоит, в том, что мы можем лишь с относительной вероятностью говорить о том, волокна каких интернейронов стимулируем. И все же можно высказать некоторые предположения: в s.r. стимулируются коллатерали Шафера, волокна «двухслойных» клеток ( bistratified cells ), волокна корзинчатых клеток и звездчатых клеток лакунозно-молекулярного слоя, в то время как в s.o-волокна мультиполярных нейронов, аксо- аксонные нейроны [Buhl et al 1994] и собственные аксоны пирамид СА1. Есть данные иммуноцитохимии, что синапсы, образуемые аксо- аксонными клетками, волокна которых проходят в со. и заканчиваются на аксонном холмике, содержат «2-субъединицу. Возможно, что она определяет обнаруженные различия входов. Однако для подтверждения данного предположения нужны дальнейшие морфо- физиологические эксперименты. Имеются данные о том, что тормозные входы к пирамидам СА1 имеет послойно-специфическую организацию [J.L. Fisher, R.L. Macdonald 1997, R. Makela et al 1999, G. Sperk et al 1997]. Кроме того показано, что кинетика ТПСТ зависит от ламинарной позиции стимулирующего входа [S.Nurse, J.C.Lacaille 1997] Далее, экспрессия подтипов постсинаптических ГАМК-А рецепторов различна для различных тормозных входов. Это показано как в физиологических [М. Banks 1998, G.Sperk et al 1997], так и в иммуногистохимических исследованиях [T.F.Freund, G.Buzsaki 1996, J. Kardos 1999]. Наконец, функциональная организация тормозных синапсов в отношении захвата медиатора имеет также входоспецифичность [D. Engeletal 1998].
На сегодняшний день известно, что пирамиды СА1 экспрессируют различные субъединицы ГАМКд рецептора, включающие al, a2, a4, a5, p2, рЗ, y2 и 5 [G.Sperk et al 1997,1998]. В свете исследований экспрессии разных субъединиц [Е.А. Barnard 1998; N. Brown et al 2002; A. Demuro et al 2000; J.L. Fisher, R.L. Macdonald 1997; N. Hajos et al 2000; M.S. Im et al 1992; Makela et al 1999; S. Nurse, J.C. Lacaille 1997], известно, что они могут образовывать рецепторы как чувств и тельные, так и нечувствительные к Л., что может служить объяснением обнаруженного нами различия в его действии на разные синаптические входы.
Другим объяснением может являться различная насыщенность постсинаптических рецепторов разных входов. Дело в том, что эффекты Л. конкурентны, т.е. они исчезают при высокой концентрации ГАМК [N. Saxena et al 1997]. Так что при высокой «занятости» постсинаптических рецепторов модулирующее действие Л. может отсутствовать вне зависимости от субъединичной комбинации рецепторов. Действительно, некоторые исследователи [R Ilajos et al 2000] продемонстрировали разную «занятость» постсинаптических ГАМКА рецепторов в разных типах клеток, определяющую различия в свойствах этих рецепторов. Однако, наши данные о действии зольпидема [Е.А. Barnard et al 1998] указывают на то, что синапсы в s.r. далеки от насыщения. Следует учесть и еще одно обстоятельство: все приведенные выше соображения касались постсинаптического действия Л., однако, нельзя исключить, что в его действии присутствует и пресинаптический компонент. Действительно, известно, что Л. блокирует Са2+ каналы [Gregory et al., 2001; Kukkonen et al., 2001; Bootman et al., 2002] в пресинаптической мембране. Наши данные о том, что Л. усиливает спайк-зависимые миниатюрные ТПСП (сТПСП) и не увеличивает амплитуду спайк-независимых {в присутствии ТТХ) мТПСТ также говорит в пользу присутствия пресинаптического компонента в его действии, Об этом же свидетельствуют наши данные о том, что Л. не вызывает достоверных изменений времени нарастания и спада ТПСТ, независимо от области стимуляции.
Анализ влияния Л. на спонтанные ТПСТ(с ТПСТ), проведенный в представляемой работе, показал, что на различных стадиях постнатального развития животного действие Л. проявляется по-разному. Результаты наших экспериментов говорят о том, что существенную часть в общую картину регистрации миниатюрных токов вносят пресинаптические спайки и спайк-зависимое выделение медиатора, а также указывают на то, что Л., наряду с постсинаптическим действием, влияет на выделение медиатора, зависящее от прихода спонтанных спайков ктерминалям пресинаптических волокон.
Разделяя механизм действия Л. на пресинаптический и постсинаптический, наши результаты могут иметь различную интерпретацию.
Мы показали, что ГАМК сТПСТ во всех случаях, когда возраст животного был 14-17 сутки (Р14-17), было зарегистрировано увеличение амплитуды ГАМК сТПСТ(спайк зависимых ТПСТ) лантаном (на 10%, р 0.05, п=12), в то же время , если возраст животного составлял Р18-21, аппликация Л. напротив приводила к уменьшению амплитуд ( на 14%, р 0.05, п=7). Вклад в описанный эффект могут вносить как пресинаптические, так и постсинаптические составляющие.
К тому же известно, что эффект потенциации ГАМК ТПСТ при помощи Л. проявляется лишь для al-содержащих рецепторов [Fisher et al. 1997b; Neelands et al. 1999b; Saxena et al. 1997], в то время как показано [Lopezellez JF 2004; Okada et al 2000], что содержание al в пирамидах гиппокампа относительно низко при рождении и увеличивается прогрессивно до взрослой жизни. На Рис.4.1. показано когда происходит переключение между превалирующими концентрациями ctl/a2 субъединиц в ГАМКд рецепторах нейронов ядер таламуса [Okada et al 2000].
Действие лантана, зависит от возраста животного
Также известно, что а5 субъединица, присутствие которой обуславливает уменьшение ГАМК ТПСТ при помощи Л., в пирамидах СА1 в возрасте Р0-Р10 локализована в основном в телах и только с увеличением возраста (Р10-Р25) начинает появляется в дендритах [Ramos 2004, Garrett 1990]. Похожее возрастное соотношение показано и для аЗ. Существуют доказательства, что содержание а2 самое высокое в более молодой ткани (показано на нейронах различных структур мозга, в том числе и на гиппокампе [Davis et al.2000,Cheng et al.2001 ].
Напротив, группы объединяющие а5-субъединицы с аі по мере взросления становятся более редкими, поскольку содержание а5-субъединицы зависит от возраста. Эти данные были продемонстрированы именно для нейронов СА1 [Hutcheon 2004]. В целом, авторы этих исследований указывают, что композиционное регулирование ГАМКА рецептора является как синаптическим, так и экстрасинаптическим, отражая сложные клеточные механизмы взаимосвязи. Однако объяснения действия Л., исходя из многообразия только а субъединиц, было бы далеко неполным. Например, некоторыми авторами [Zhu et al. 1998] была выдвинута гипотеза о влиянии р субъединиц ГАМКА рецепторов на модулирующее действие La +. Действительно, исследования, проведенные на модифицированных (мутантных) нейронах мозга крысы [Bailey 2002] показывают, что содержание (Ї1 субъединицы в ГАМКд рецепторе самое высокое при рождении, быстро уменьшается, и достигает минимума взрослых уровней от 10 до 17 суток. По мнению некоторых авторов [Cheng et al. 2001], именно наличие субъединиц Р(1-2) в ГАМК рецепторе обеспечивает меньшую пиковую амплитуду и более быстрый спад по сравнению с контролем для токов, вызванных аппликацией веществ, обладающих способностью увеличивать ответ на ГАМК. В то же время исследования выделенных нейронов гиппокампа и клеток в культурах клеток [Scotti 2001, 2002, Hutcheon В 2004] показали, что удельный вес групп рецептора, которые содержали р2/3 субъединицы, был постоянен для Р10-20, при этом наличие комплекса, содержащего у2 субъединицу, колебалось и достигало максимума в 20-й день (данные получены на культурах гиппокампальных клеток).
Таким образом, по данным современной литературы, у животных Р14-17 в ГАМКд рецепторах преобладает наличие комплекс ctl(2),pl, напротив в возрасте PI7-25, зарегистрировано преимущественное присутствие композиции аЗ(5), Р2-3, у. Именно зависимое от возраста преимущественное содержание подобных комплексов отражено в работе [Brooks-Kayal 1998]
Дополнительным свидетельством того, что Л. оказывает выраженное постсинаптическое влияние, зависимое от возраста, могут служить изменения в кинетике сТПСТ, зарегистрированные в наших экспериментах. Мы зарегистрировали более значительное увеличение х (время спада) сТПСТ при аппликации Л. (42%) для Р14-17 по сравнению с возрастной группой Р18-2 І (18%). Эти данные говорят прежде всего о том, что в группе Р14-17 Л. вызывает увеличение продолжительности открытого состояния ГАМК рецепторов.
Помимо постсинаптического влияния Л. оказывает значительное пресинаптическос воздействие на ГАМК ТПСТ. Паши эксперименты с исключением миниатюрных ТПСТ при помощи ТТХ показали, что эффект Л., проявляющийся в увеличении амплитуд миниатюрных токов связан с ТПСТ, вызываемыми приходом с пай ков в пресинаптические терминали. Это может означать, что активность пресинаптических нейронов(являющихся по-видимому тормозными интернейронами) также может модулироваться Л. В связи с этим предположением особый интерес представляют исследования частот сТПСТ. Наш анализ модуляции частоты сТПСТ с помощью Л. показал, что увеличение их частоты в возрасте Р18-21 (на 40%) значительно превосходит увеличение частоты в группе Р14-17, при этом следует отметить, что для двух исследуемых возрастных групп частоты сТПСТ в контроле значительно отличались(Р14-17 - 1.53±0.15гц; Р18-21 - 3.54±0.29гц ).По данным литературы в молодом возрасте (до 20 суток) эффективность ГАМКергической синаптической передачи прежде всего ограничена медленными кинетическими процессами и насыщенностью постсинаптических ГАМКд рецепторов [Juttner et al. 2001], что в значительной степени подтверждается нашими результатами.
Поскольку все наши исследования проводились на срезах, нельзя исключить и влияния глии, которое с возрастом оказывает большее влияние на синаптическую передачу. Некоторые исследователи показали, что для гиппокампа пик содержания транспортеров GAD65 и СА067(содержащихся в больших количествах в астроцитах) приходится на 17-20 день [Ramos В 2004]. Вместе с тем, на культурах гиппокампа показано, что именно астроциты потенциируют ГАМКА -зависимые токи в пирамидальных нейронах [Liu Q.Y. 1996].
