Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1.1. Причины возникновения судорожных расстройств в разных возрастных группах 10
1.2. Раскачивающая модель эпвлептогенеза (киндлинг) .17
1.2.1. In vivo киндлинг 19
1.2.2, In vitro киндлинг 20
1.3. Общие принципы морфо-функциональной организации полей гиппокампа 22
1.4. Возможные механизмы развития эпилептиформной активности в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа, индуцируемой кратковременными эпизодами гипоксии 28
1.4.1. Потенциал-управляемые ионные каналы 29
1.4.2. Глутаматергическая синаптическая передача 33
1.4.3. ГАМКергическая синаптическая передача 36
1.5. Роль долговременной потенциации глутаматергической шнаптической передачи (ДПСП) в раскачивающей модели эпилептогенеза 42
Материалы и методы 45
2.1 Методика переживающих срезов гиппокампа крыс 45
2.1.1. Приготовление и поддержание жизнедеятельности срезов гиппокампа .45
2.1.2. Регистрация популяционных ответов в поле СА1 срезов гиппокампа крыс 46
2.1.3. Оценка эффективности глутаматергической передачи в САЗ-СА1 синапсах , 48
2.1.4. Оценка эффективности опосредованных ГАМК тормозных процессов в полеСАІ 50
2.2. Раскачивающая (киндлинг) in vitro модель эпилептогенеза 51
2.3. Фармакологический анализ роли АМРА и NMDA глутаматных рецепторов и L-типа потенциал-зависимых Са каналов в механизмах гипервозбудимости пирамидных нейронов поля СА1, индуцируемой эпизодами гипоксии 53
2.4. Фармакологический анализ роли ГАМКд и ГАМКБ рецепторов в механизмах гипервозбудимости пирамидных нейронов поля СА1, индуцируемой эпизодами гипоксии 55
Результаты исследований и их обсуждение 56
3.1. In vitro киндлинг - подобное состояние, индуцируемое эпизодами гипоксии 56
3.1.1. Срезы гиппокампа 13-14 дневных крыс 57
3.1.2. Срезы гиппокампа 60-70 дневных крыс 57
3.1.3. Срезы гиппокампа 600-650 дневных крыс ...60
3.1.4. Развитие ЭФА в срезах гиппокампа крыс разного возраста без гипоксических эпизодов 62
3.2. Изменения в эффективности глутаматергической синаптической передачи после 3-х эпизодов гипоксии , 64
3.2.1. Срезы гиппокампа 13-14 дневных крыс 65
3.2.2. Срезы гиппокампа 60-70 дневных крыс 66
3.2.3. Срезы гиппокампа 600-650 дневных крыс 66
3.3. Изменения в эффективности ГАМКергической передачи после 3-х эпизодов гипоксии 69
3.3.1. Срезы гиппокампа 13-14 дневных крыс 70
3.3.2. Срезы гиппокампа 60-70 дневных крыс 71
3.3.3. Срезы гиппокампа 600-650 дневных крыс 73
3.3.4. Эффективность торможения в опытах с парной стимуляцией в норме (без гипоксическкх эпизодов) , 75
3.4. Роль АМРА и NMDA рецепторов глутамата в ЭФА, индуцируемой эпизодами гипоксии 76
3.4.1. Эффект селективного антагониста NMDA рецепторов глутамата APV на ЭФА, индуцируемую тремя эпизодами гипоксии 76
3.4.2. Эффект антагониста АМРА / каинатных рецепторов глутамата CNQX на ЭФА, индуцируемую тремя эпизодами гипоксии 76
3.5 Роль L-типа потенциал-зависимых Са2+ каналов в ЭФА, индуцируемой эпизодами гипоксии 78
3.6. Роль ГАМКА И ГАМКБ рецепторов в ЭФА, индуцируемой эпизодами гипоксии 78
Заключение 82
Выводы 87
Список цитируемой литературы 88
- Причины возникновения судорожных расстройств в разных возрастных группах
- Роль долговременной потенциации глутаматергической шнаптической передачи (ДПСП) в раскачивающей модели эпилептогенеза
- Оценка эффективности глутаматергической передачи в САЗ-СА1 синапсах
- Развитие ЭФА в срезах гиппокампа крыс разного возраста без гипоксических эпизодов
Введение к работе
Изучение клеточных механизмов, лежащих в основе судорожных расстройств, в том числе и эпилепсии, является актуальным, так как число больных эпилепсией колеблется в разных исследованиях от 3 до 5 на 1000 населения и варьирует в зависимости от возраста: около 2% детей до 2 лет и около 5% восьмилетних уже имеют, а анамнезе, по крайней мере, один эпилептический припадок (Гусев, Бурд 1994). Второй пик возникновения припадков приходится на юношеский возраст. Риск возникновения (впервые в жизни) эпилептических припадков в зрелом возрасте снижается. В пожилом и старческом возрасте число больных, страдающих эпилептическими припадками, вновь увеличивается (Болдырев 1976; Гусев, Бурд 1994). Одной из главных причин возникновения судорожных расстройств у человека (особенно в детском возрасте) является гипоксия или ишемия мозга (Hauser, Rutland 1975).
Многочисленными работами исследователей этих заболеваний установлено, что в основе развития судорожных расстройств лежит возникновение синхронного пароксизмального деполяризационного сдвига мембраны в определенной популяции нейронов головного мозга, сопровождающегося развитием вызванных и спонтанных этшлептиформных пачечных разрядов (Jefferys, 1990; McCormick and Contreras 2001). Механизмы, связанные с трансформацией нормального паттерна активности нейронов определенных областей мозга в эпилептиформный, исследуют как на уровне одиночных нейронов (включая нарушения в функционировании мембранных каналов на поверхности клеточных мембран), так и на уровне нейронных сетей (включая синаптические взаимодействия (Погодаев 1986; Бейн 1997).
Несмотря на долгую историю изучения судорожных расстройств, их механизмы остаются во многом непонятными до сих пор. Одной из ключевых проблем, касающихся этих механизмов, является вопрос о том, могут ли факторы окружающей среды (такие как
7 стресе, аноксия, гипоксия, ишемия и т. д.) снижать порог развития судорожной активности в нейронах мозга и, если да, то как их эиилептогенные эффекты зависят от возраста животного или человека.
Гипервозбудимость нейронов определенных областей мозга является одним из главных показателей возникновения судорожной активности. Причем причины, приводящие к возникновению такой гипервозбудимости в нейрональных сетях и, как следствие этого, к возникновению судорожной активности мозга зависят от стадии онтогенетического развития организма.
Гипервозбуднмость нейронов в нервной системе определяется, прежде всего, дисбалансом между основной возбуждающей (глутаматергической) и основной тормозной (ГАМКергической) синаптическими передачами. Известно, что гипоксия или ишемия головного мозга в определенный период онтогенетического развития животных и человека способны провоцировать устойчивые эиилептогенные эффекты (Applegate and Lombroso 1996; Chiba 1985; Jensen, Stevens 1998). Однако соотносительная роль глутамат-и ГАМК-ергических еннаптических передач в эпилептогенных эффектах гипоксии или ишемии остается не ясной (Obrenovitch and Zikha 1996). Возможно, что в эпилептогенных эффектах гипоксии / ишемии могут принимать участие и другие механизмы,, в частности потенциал-регулируемые мембранные каналы.
Как уже отмечалось выше, наиболее характерной чертой паттерна электрических разрядов нейронов в эпилептогевном фокусе являются пачки потенциалов действия, генерируемые во время пароксизмального деполяризационного сдвига мембранного потенциала. Это указывает на то, что механизм развития синхронизированной пачечной активности в популяции нейронов может быть ключевым фактором в возникновении эпилеггтогенного фокуса. Способность нейрона генерировать пачечные эпилептиформные разряды может определяться либо мощным возбуждающим синаптлческим входом (т.е. лиганд-управляемьгми Na+ или Са2+ каналами постсинаптическоЙ мембраны) или
8 снижением тормозных влияний, либо гипервозбудимостью внесинаптической мембраны, зависящей прежде всего от потенциал-зависимых Na+, Са2+ и К+ каналов. Ясно, что исследование роли различных ионных каналов, а также синаптических процессов в генезе эпилептиформных разрядов, по всей вероятности, имеет ключевое значение для объяснения клеточных механизмов эпилептогенеза.
За последние годы разработан целый ряд экспериментальных моделей эпилептогенеза in vivo и in vitro, селекционированы животные, генетически предрасположенные к судорожной активности (Taylor 1988; Веретенников 1996). Однако до настоящего времени остается неясным вопрос о тех синаптических и внесинаптических компонентах нейронов мозга, которые определяют патологические перестройки нейрональной активности в ответ на эпилептогенные воздействия в процессе онтогенетического развития организма (Jefferys 1990; Bernard 1996).
Целью данной работы являлось исследования механизмов постгипоксической гипервозбудимости нейронов поля СА1 в срезах гиппокампа крыс трех возрастных групп: 13-14- (молодых), 60-70- (взрослых) и 600-650 (старых) дневных.
Задачи исследования заключались в следующем:
1. Сравнить способность нейрональной сети поля СА1 индуцировать эпилептиформные разряды популяционных спайков в норме и после периодических кратковременных эпизодов гипоксии у животных разных возрастных групп.
Выявить роль долговременной потенциации глутаматергической синаптической передачи в механизмах развития эпилептиформных разрядов.
Выяснить роль возвратного торможения в опытах с парной стимуляцией в механизмах развития эпилептиформных разрядов.
4. Исследовать сравнительную роль АМРА/каинатных и NMDA рецепторов глутамата в механизмах постгипоксической гиггервозбудимости.
5. Исследовать участие L-типа потенциал-зависемых кальциевых каналов в механизмах постгипоксической гипервозбудимости.
6. Исследовать сравнительную роль ГАМКА и ГАМКБ рецепторов в механизмах постгипоксической гипервозбудимости.
Поиск ответов на эти вопросы может пролить свет на механизмы, лежащие в основе перестройки нормального паттерна активности нейронов в эпилептиформный.
Причины возникновения судорожных расстройств в разных возрастных группах
К судорожным расстройствам, в том числе и эпилепсиям, могут приводить некоторые ненаследуемые аномалии, которые связаны с дефектами определенных тканей и органов организма. Одной из таких аномалий является доброкачественная опухоль из кровеносных сосудов, называемая ангиомой (Хопкинс, Эплтон 1998). Причиной судорожных расстройств, более распространенных, чем вызванных ангиомами, могут быть нарушения миграции нервных клеток в период внутриутробного развития, приводящие к тому, что некоторые клетки оказываются не в том слое коры головного мозга или же между ними устанавливаются патологические синаптические соединения:. Подобные пороки развития головного мозга могут вызывать припадки в первые несколько недель или месяцев жизни, включая младенческие судороги (синдром Уэста).
Одной из ведущих причин судорожных расстройств для всех возрастных групп являются травмы головного мозга. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно количество черепно-мозговых травм (ЧМТ) в мире увеличивается минимум на 2%, составляя 35-40% в структуре травматических повреждений. Одним из наиболее частых проявлений травматической болезни головного мозга является посттравматическая эпилепсия, развивающаяся у 11-20% больных (Лихтерман, Потапов и др. 1996; Лихтерман и др. 1998). Критическим временем для формирования посттравматической эпилепсии, по данным Л.Б. Лихтермана и соавт. (Лихтерман и др. 1998), являются первые 18 месяцев после такой травмы. Но частота посттравматической эпилепсии у взрослых зависит от тяжести ЧМТ. После тяжелой ЧМТ посттравматическая эпилепсия развивается в 20-50% случаев (Одинак, Дыскин 1997) уже в течение первого года. Еще чаще она возникает после тяжелой ЧМТ, сопровождающейся сдавлением мозга, когда первичное поражение представлено грубыми очаговыми дефектами. После ЧМТ средней тяжести посттравматическая эпилепсия возникает реже (11-25%), причем дебют обычно приходится на более поздние сроки. Одним из морфологических субстратов формирования эпилептического очага после тяжелой и средне-тяжелой ЧМТ считают формирование "мозгового рубца" (Лихтерман, Потапов и др. 1996; Cherchenko 1997). Данные о частоте постгравматической эпилепсии после легкой ЧМТ довольно противоречивы - от 2 до 15% (Авакян и др. 2003). Опухоли головного мозга также во многих случаях способны приводить к развитию судорожной активности. Данная причина возникновения судорожных расстройств гораздо чаще встречается у взрослых людей, чем у детей. Опухоли головного мозга являются либо первичными, либо вторичными (Хошшнс, Эпигон 1998). Вторичные опухоли переносятся в мозг кровью из другой части организма. Наиболее распространенными из них считаются рак легких и молочной железы. Судорожные расстройства, вызванные инфекционными заболеваниями (например, повреждением головного мозга в результате бактериального менингита) может произойти в любом возрасте — от периода новорожденности до старости (Петрухин 2000). Благодаря интенсивному раннему лечению почти всегда удается предотвратить повреждение коры головного мозга. Однако, если лечение проводится с запозданием, либо, если организм устойчив к применяемым антибиотикам, поврежденные клетки коры мозга могут в последующие годы служить источником припадков. Особенно часто к поздней эпилепсии приводит менингит, обусловленный туберкулезом. Вирусный менингит представляет собой самокупирующееся заболевание, не приводящее к эпилепсии. Однако иногда вирусы присутствуют внутри вещества головного мозга, а не остаются на поверхности. При этом возникает энцефалит, который может вызвать припадки. Наиболее распространенными вирусами,, вызывающими припадки подобным образом, являются вирусы герпеса и цитомегаловирус (Петрухин 2000). Второй обычно поражает головной мозг плода, а первый детей младшего и раннего возраста, а также взрослых. ВИЧ также может стать причиной припадков - либо сам по себе, либо в результате подавления иммунной системы.
К судорожным расстройствам могут приводить и приобретенные нарушения обмена веществ, особенно в организме новорожденных. Так, при достаточно низкой концентрации глюкозы в крови у новорожденных, особенно родившихся раньше срока или у младенцев, матери которых страдают диабетом, наблюдаются судорожные припадки (Хопкинс, Зшгтон 1998). У новорожденных также довольно часто возникают припадки из-за низкого содержания кальция в крови.
В более старшем возрасте припадки могут вызываться и другими приобретенными метаболическими расстройствами. Одной из наиболее распространенных причин припадков в этом возрасте является хроническая почечная недостаточность.
Алкоголь также способствует появлению припадков у лиц, уже имевших их в прошлом (Петрухин 2000). Существует связь между хроническим алкоголизмом и возникновением припадков даже в трезвом состоянии. Во многих случаях припадки возникают во время "похмелья", когда содержание алкоголя в крови падает или находится почти на нулевом уровне. Вполне вероятно, что определенную роль в возникновении припадков играют и изменения в объеме внеклеточного пространства, связанные с распределением воды внутри и вне клеток (ДвирскиЙ 2001). Чрезмерная гидратация у экспериментальных животных с эпилепсией может ускорять появление припадков, поэтому есть некоторые основания считать, что потребление больших пордай пива, содержащего как алкоголь, так и значительное количество воды, может с большей вероятностью способствовать развитию приступа, чем умеренное употребление вина или крепких напитков.
У пожилых людей одной из основных причин судорожных расстройств являются инсульты головного мозга, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями. В месте повреждения артериального сосуда нервные клетки либо погибают в результате ишемии, либо повреждаются таким образом, что может образоваться фокус, в котором впоследствии произойдет судорожный разряд (Гусев, Скворцова 2001). Большинство инсультов наблюдается в позднем возрастном периоде жизни, поэтому на долю сердечнососудистых заболеваний приходится значительное число случаев появления эпилепсии у пожилых.
Одной из ведущих причин, приводящей к возникновению судорожных расстройств главным образом в неонатальный период развития, является гипоксия или ишемия головного мозга. Церебральные нервные клетки принадлежат к числу самых крупных потребителей кислорода в организме. Об этом свидетельствует тот факт, что четвертая часть всей артериальной крови поступает в головной мозг. Если снабжение мозга кислородом прекращается, повреждение нервных клеток наступает через несколько минут. Некоторые люди умирают, у остальных подобные повреждения приводят к тому, что в последующей жизни у них могут возникнуть судорожные разряды.
Роль долговременной потенциации глутаматергической шнаптической передачи (ДПСП) в раскачивающей модели эпилептогенеза
Метаботропные ГАМКБ рецепторы представляют собой гетеродимеры (МоЫег and Fritschy 1999), состоящие из двух субъединиц: GBRj и GBRa (Jones et al. 1998). Эти две субъединицы возникают благодаря альтернативному сплайсингу (Kuner et al. 1999). Определено, что ГАМКБ рецепторы локализуются как пре-, так и постсинаптически (Couve et al. 2000; Mott and Lewis 1994). Тем не менее, достаточно мало известно об их субклеточном распространении (Fritschy et al. 1999). Другими словами, не вполне понятно, группируются ли, например, постсинаптические ГАМКБ рецепторы в синаптической щели напротив места выброса ГАМК или расположены на удалении от синапса. Постсинаптическим эффектом активации данных рецепторов является длительная гиперполяризация, следующая за быстрым ионотропным компонентом ГАМКергической передачи. В своем недавнем исследовании Scanziani (Scanziani 2000) приводит аргументы в пользу того, что ГАМКБ рецепторы расположены далеко от места выброса медиатора и активируются ГАМК, покидающей синаптическую щель (сдияловер ГАМК). При этом он считает, что для достижения достаточной для активацнц данных рецепторов внеклеточной концентрации ГАМК необходима одновременная активация нескольких ГАМКергических синапсов.
Не до конца понятно субклеточное распределение и пресинаптический ГАМКБ рецепторов. Не ясно расположены ли эти рецепторы в перисинаптической области или они вне активной зоны. Пресинаптический эффект ГАМКБ рецепторов заключается в том, что они снижают как высвобождение ГАМК в тормозных синапсах, так и высвобождение глутамата в возбуждающих (Mott and Lewis 1994).
ГАМКБ рецепторы связаны с гримерным G-белком (Hill et al. 1984). Одним из эффектов их активации является ингибирование аденилатциклазы (Nishikawa et al. 1997). Кроме того, данные рецепторы прямо связаны через G-белок с N и P/Q типами потенциал зависимых кальциевых каналов, которые участвуют в синаптическом высвобождении нейропередатчиков (Anwyl 1991; Mintz and Bean 1993). Таким образом, пресинаптические ГАМКе рецепторы снижают высвобождение нейропередатчиков, уменьшая пресинаптический вход кальция. Наконец, на постсинаптическом участке ГАМКБ рецепторы запускают каскад реакций, который ведет к открыванию G-белок - связанных К+ каналов (GIRK - G protein-gated inward rectifying К+ channels) (Andrade et al. 1986; Misgeld et al. 1995). Благодаря активации этих каналов и возникает медленный ТПСП, длящийся сотни миллисекунд (Scanziani 2000). По этой причине его легко отличить от ТПСП, опосредованного ГАМКд рецепторами. Медленный ТПСП, опосредованный ГАМКБ рецепторами, будет характеризоваться длительной кинетикой и потенциалом реверсии отличным от Eci".
Для исследования молекулярных изменений в ГАМКергической синаптической передаче при гигаюкампальном киндлинге методом in situ гибридизации измеряли экспрессию 13 различных субьединиц ГАМКд рецептора в пирамидных и гранулярных нейронах гиппокампальной формации (Kamphuis, De Rijk, et al. 1995). На стадиях развития киндлинга до генерализованных судорог во всех областях гйгшокампа наблюдалась повышенная экспрессия мРНК для а\, а2, а4, 01, (32, (33, Y2 И y2L субъединиц. Через 28 дней после последней судороги уровень экспрессии мРНК длинноцешчечной y2L субъединиды был снижен относительно контрольных значений, что может указывать на участие механизма экспрессии этой субьединицы в поддержании киндлинга. В относительно недавней работе с использованием двух линий крыс, отличающихся по чувствительности к развитию киндлинга, были также получены доказательства, что различия в этой чувствительности могут быть связаны с отличиями в ГАМКергической функции, опосредованными особенностями в экспрессии субъединиц ГАМКА рецептора (Mclntyre, Poulter, et зі. 2002). Имеющиеся экспериментальные данные говорят скорее против участия ГАМКБ рецепторов в механизмах поддержания киндлинга (Francis, Jung, et al. 2001).
Роль долговременной потенциации глутаматергической синаптической (ДПСП) передачи в раскачивающей модели эпилептогенеза Киндлинг представляет собой не только модель эпилептогенеза, но и зависимую от активности форму нейропластичности, которая ответственна за развитие клеточно-молекулярных и сетевых событий, приводящих к возникновению судорожной активности в нейрональных популяциях (Baudry 1986; Cain 1989; McEachern and Shaw 1996). Развитие судорожной активности в фокусе раскачивающей стимуляции зависит от предшествующей активности нейронов. Таким же свойством обладает и ДПСП -феномен, который, как полагают, лежит в основе обучения и памяти (Bennett 2000; Kandel 2001).
Киндлинг и ДПСП - это разные феномены. Если ДПСП является локальным синаптическим событием, представляющим собой процесс повышения эффективности передачи в отдельном синапсе, то киндлинг - это многоликий каскад событий, связанный с начальным усилением в экспрессии электрографических послеразрядов в локальной популяции нейронов, последующей экспрессией фокальной судорожной активности и, в конечном итоге, генерацией полных генерализованных судорог. Поскольку ДПСП в основном выявляется в глутаматных синапсах - основных возбуждающих синапсах мозга, - то возникает вопрос об участии ДПСП в киндлинговом эггялелтогенезе. Действительно, некоторые экспериментальные данные указывают, что ДПСП в глутаматных синапсах возникает при раскачивающей стимуляции (Adamec, Young 2000; Racine, Milgram 1995). Анализ этих данных указывает, что роль ДПСП в развитии киндлинга зависит как от раскачиваемой области мозга, так и типа ДПСП. Например, предварительная индукция ДПСП в синапсах между нейронами энторинальной коры и гранулярными клетками зубчатой фасции недостаточна для развития киндлинга (Sutula, Steward 1987). Последующие экспериментальные данные показали, что ДПСП и киндлинг вызывают разные изменения в мембранных токах гранулярных клеток в ответ на стимуляцию перфорирующего пути (Hirose, Okada, et al. 2000). ДПСП в синапсах, образованных комиссуральными волокнами с дендритами пирамидных клеток поля СА1 гиппокампа, также не является решающим фактором в возникновении спонтанных интериктальных спайков в гиппокампе, индуцируемых высокочастотной электрической стимуляцией (Leung 1994). Непрерывное приложение к срезам гиппокампа крысы раствора с высокой концентрацией К+ приводило к возникновению двух типов ДПСП в поле СА1, сопровождающихся спонтанными эпилептиформными разрядами (Morgan, Teyler 2001). Эти ДПСП зависели от L типа- и NMDA-зависимьгх кальциевых каналов и, по мнению авторов данной работы, L-тип кальциевых каналов ответственен за образование фокусов судорожной активности в гиппокампе. В экспериментах in vivo, развитие электрического киндлинга миндалины сопровождалось ДПСП, свойство которой отличались от свойств обычной NMDA- зависимой ДПСП (Adamec, Young 2000). По мнению авторов этой работы обнаруженная ДПСП играет важную роль в механизмах распространения судорожной актиьдасти при киндлинге. Похожие данные были получены и другими исследователями. Так, раскачивающая стимуляция приводила к долговременному (сохраняющемуся в течение нескольких недель после последней судороги) увеличению амплитуды полевых ответов в неокортексе у свободно подвижных крыс (Racine, Chapman, et al. 1995). Все эти данные указывают на то, что вызванная киндлннгом ДПСП может лежать в основе распространения судорожной активности при киндлинговом эпилептогенезе. Однако роль ДПСП в механизмах гипервозбудимости нейронов мозга, вызванной эпизодами гипоксии, а также онтогенетический аспект ее участил в развитии судорожной активности до настоящего времени остаются неясными.
Оценка эффективности глутаматергической передачи в САЗ-СА1 синапсах
В наших предварительных экспериментах был проведен анализ зависимости развития эгшлептиформной активности (ЭФА) в нейронах поля СА1 срезов гиппокампа от числа (1-го, 3-х и 6-ти) гипоксических эпизодов. Однократный гипоксический эпизод приводил к относительно слабой индукции вызванных одиночным электрическим стимулом эпилептиформных пачек ПС в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа. Использование 3-х эпизодов гипоксии приводило к более выраженному снижению порога генерации ЭФА, чем после 1 эпизода. Однако увеличение числа гипоксических эпизодов до 6-ти не приводило к дальнейшей интенсификации эпилептогенных эффектов.
Три эпизода гипоксии приводили к "полностью раскачанному" состоянию нейрональной сети поля СА1 гиппокампа. Развитие такой пост-гапоксической эпилептиформной активности по некоторым своим характеристикам напоминало развитие киндлинга (раскачки) in vivo: (1) периодический паттерн стимуляции, необходимый для ее индукции, (2) прогрессирующее снижение в зависимости от числа эпизодов (по крайней мере до 3 эпизодов) порога развития ЭФА и (3) устойчивый характер снижения этого порога после отмены эпилептогенного стимула. Это состояние было названо in vitro киндлинг-подобным состоянием.
В последующей работе использовались три кратковременных эпизода гипоксии, так как по сравнению с одним и шестью, они вызывали более выраженное снижение ПГДС и увеличение ЧПС. Первым этапом нашей работы было исследование способности трех эпизодов гипоксии индуцировать развитие ЭФА в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа у крыс разного возраста.
Из рисунка 3.1.А. видно, что кратковременные эпизоды гипоксии не Приводят к развитию разрядов ПС в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа 13-14 дневных крыс.
На рисунке 3.1.Б. показана динамика развития ПГДС в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа 13-14 дневных крыс после предъявления эпизодов гипоксии. Как видно из графика, динамика изменения ПГДС не отличается от контрольных значений.
Анализ динамики изменения ЧПС после эпизодов гипоксии (Рис. 3.1.В) показал, что кратковременная гипоксия приводит к снижению значений параметра ЧПС в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа. Однако через 120 минут после воздействия значения ЧПС возвращались к контрольным значениям.
Причиной отличия полученных нами результатов от литературных данных о повышенной склонности гиппокампа у 10-14-дневных крыс к эпилептогенным эффектам гипоксии (Jensen, Wang 1996; Jensen and Stevens 1998) может быть использованная модель эпилептогенеза: раскачивающая модель эпилептогенеза в опытах in vitro в наших экспериментах, где использовались кратковременные 3-х минутные эпизоды гипоксии, и непрерывная в течение 20 минут однократная гипоксия в опытах Jensen et al. в условиях in vivo.
Таким образом, полученные результаты позволили показать, что кратковременные периодические эпизоды гипоксии не приводят к развитию ЭФА в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа у молодых (13-14 дневных) животных.
Из рисунка 3.2А видно, что эпизоды гипоксии приводят к развитию вызванных одиночным электрическим стимулом эпилептиформных разрядов ПС в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа 60-70 дневных животных.
Развитие ЭФА в срезах гиппокампа крыс разного возраста без гипоксических эпизодов
Как отмечалось в литературном обзоре, гипоксия мозга может оказывать отставленные эпилептогенные эффекты, клеточные механизмы которых неясны. Представленная диссертационная работа была посвящена исследованию клеточных механизмов трансформации нормального паттерна активности пирамидных нейронов поля СА1 срезов гиппокампа крыс разного возраста в эшшептиформный, возникающий в ответ на периодические кратковременные эпизоды гипоксии. Данная работа была простимулирована, в частности, тем, что до настоящего времени не был в достаточной степени изучен онтогенетический аспект сравнительной роли глутаматных и ГАМК рецепторов, синаптической потенциации и различных путей поступления Са2+ в клетку, в механизмах постгипоксической гипервозбудимости нейронов мозга.
Использование срезов гиппокампа для такого рода исследований позволило изучать события, наблюдаемые при формировании эпилептогенного фокуса в конкретных нейрональных сетях и осуществлять селективную оценку клеточных механизмов этого процесса. Проведение исследования в поле СА1 этой структуры было особенно интересно по ряду причин. Во-первых, в ответ на увеличение внеклеточной концентрации К (что является одним из главных следствий гипоксии) в пирамидных нейронах этого поля воспроизводится паттерн судорожной активности, характерный для фокальной эпилепсии (Traynelis and Dingledme 1988). Во-вторых, морфологическая организация пирамидных нейронов доля СА1 гиппокампа позволяет оцепить сравнительную роль изменений в эффективностях глутаматергической и ГАМКергической синаптических передач, а также эффективность передачи сигнала в звене ВПСП-спайк в механизмах развития ЭФА. И, в-третьих, плазматическая мембрана пирамидных нейронов этого поля содержит зависимые от NMDA-рецепторов Са2+ каналы, АМРА/каинатные рецепторы глутамата, ГАМКд и ГАМКв рецепторы и различные типы потенциал-зависимых Са2+ каналов, что также позволяет оценить их сравнительную роль в клеточных механизмах эпилептогенеза.
Основным недостатком большинства применяемых в настоящее время моделей эпилептогенеза in vitro является то, что ЭФА в них генерируется только на фоне действия эпилептогена и быстро исчезает при его отмывке (Goddard, Melntyre and Leech 1969; Taylor 1988; Веретенников и др. 1996), то есть не позволяет исследовать следовые эпилептогенные эффекты. Для того, чтобы обойти эти трудности в нашей лаборатории была разработана раскачивающая модель эпилептогенеза in vitro (на срезах гиппокампа), в которой устойчивая ЭФА сохранялась в течение длительного времени после окончания эпилептогенной стимуляции (сравнимого с временем переживания среза). В качестве эпилептогенного воздействия были использованы периодические кратковременные (3-х минутные) эпизоды гипоксии (3 эпизода с интервалом 10 минут). Как оказалось, такой протокол воздействия способен приводить к долговременному следовому (т.е. сохраняющемуся после отмены эпилептогенного стимула) снижению порога генерации ЭФА в поле СА1 срезов гиппокампа крыс 60-70 дневного (взрослые) и 600-650 дневного (старые) возрастов, в отличие от молодых животных (13-14 дневные). Отсутствие развития постгипоксической ЭФА у 13-14 дневных животных может быть связано с тем, что у них низкий уровень функционально-активных постсиаптических АМРА рецепторов, которые, как показали наши эксперименты, играют ключевое значение в проэпияептогеннъгх эффектах гипоксии в поле СА1 срезов гиппокампа взрослых крыс.
Помимо индукции ЭФА, эпизоды гипоксии приводили также к развитию долговременной потенциации глутаматергической передачи (ДПГП) в поле СА1 срезов гиппокампа молодых и взрослых, но не старых, крыс. Отсутствие ДПГП и относительно кратковременная постгштоксическая ЭФА у 600-650 дневных животных могут быть связаны со сниженной потенцией мозга старых животных к зависимой от предшествующей активности способности к пластическим перестройкам нейрональной активности. Потенциация глутаматергической передачи коррелировала с постгипоксической
ЭФА только в поле СА1 срезов гиппокампа взрослых крыс, что указывает на то, что она не является необходимым фактором для механизмов развития ЭФА.
С другой стороны, эпизоды гипоксии приводили также к усилению эффективности возвратного торможения в опытах, с парной стимуляцией в поле СА1 срезов гиппокампа у взрослых и старых, но не молодых, животных. Однако этого усиление в эффективности возвратного торможения недостаточно для того, чтобы предотвратить или подавить развитие ЭФА в пирамидных нейронах поля СА1. Постгшгоксическая депрессия торможения в опытах с парной стимуляцией у молодых (13-14 дневных) животных возможно связана с деполяризующими эффектами ГАМК, которые отличаются от гиперполяршующих ответов на ГАМК, наблюдаемых в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа у взрослых крыс.
Исходно (без предъявления эпизодов гипоксии) 13-14 дневные и 600-650 дневные животные более предрасположены к развитию ЭФА, так как имеют более сниженный порог ее генеза и менее эффективный тормозный процесс по сравнению с 60-70 дневными животными.
Исходя из полученных нами экспериментальных данных, на рисунке 3.18. показана гипотетическая схема участия синаптических NMDA-зависимых Са2+ каналов, L-типа потенциал-зависимых кальциевых каналов, АМРА/каинатных рецепторов глутамата, а также роль ГАМКд И ГАМКЕ рецепторов в механизмах индукции постгипоксической гипервозбудимости. Ключевым моментом этой схемы является то, что кратковременные эпизоды гипоксии индуцируют длительные следовые изменения в свойствах L-типа потенциал-зависимых кальциевых каналов и АМРА/каинатных рецепторов глутамата, расположенных на соматической мембране и проксимальных участках дендритов пирамидных нейронов поля CA1 гиппокампа.
