Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Стресс как фактор ускоренного старения 8
1.2. Современные стратегии фармакологической профилактики и коррекции возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме 23
1.3. Дельта-сон индуцирующий пептид и его аналоги: структура, свойства и биологические эффекты 30
1.4. Пирацетам - психофармакологические свойства и механизмы проявления антистрессорной активности ... 37
ГЛАВА 2. Постановка эксперимента и методы исследования
2.1. Постановка эксперимента 49
2.2. Физиологические методы исследования 51
2.3. Биохимические методы 52
2.4. Биофизические методы исследования 55
2.5. Гистологические методы 56
2.6. Цитогенетические методы 56
2.7. Статистическая обработка результатов 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Влияние ДСИГТ, его аналогов и пирацетама на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака 58
3.2. Лейкоцитарная формула крыс разного возраста при введении пептидов и пирацетама в норме и при гипокинезии 61
3.3. Исследование антимутагенной активности ДСИП, его аналогов и пирацетама в норме и при стрессе... 72
3.4. Биохимические показатели мозга и крови крыс разного возраста при введении пептидов и пирацетама в нормальных физиологических условиях и при гипокинезии 76
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 105
Выводы 128
Список литературы 130
- Современные стратегии фармакологической профилактики и коррекции возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме
- Пирацетам - психофармакологические свойства и механизмы проявления антистрессорной активности
- Влияние ДСИГТ, его аналогов и пирацетама на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака
- Биохимические показатели мозга и крови крыс разного возраста при введении пептидов и пирацетама в нормальных физиологических условиях и при гипокинезии
Введение к работе
Управление эффективностью адаптационных реакций па различных этапах индивидуального развития является одной из актуальных проблем современной биологии и медицины. Ускоренное старение, характерное для современной человеческой популяции, обусловлено функциональными сдвигами в ЦНС, возникающими при истощении адаптационных резервов организма в онтогенезе, протекающем в неблагоприятных природных условиях при несбалансированном питании [Хавинсон и соавт,, 2003]. Многие нарушения в процессе старения сходны с наблюдаемыми при стрессе [Коркушко, Хавинсон, 2002]. К таким сходствам наряду с изменением поведения и приспособительных возможностей относят сдвиги интенсивности свободнорадикйльных процессов [Фролькис, 1991; Наппап , 1992].
Интенсификации свободнорадикального окисления принадлежит ведущая роль в развитии патологических состояний, связанных с возрастной инволюцией жизненно важных органов в нервной, эндокринной и иммунной системах [Arking, 1998]. Многие нейродегенеративные процессы связаны со стресс-индуцированными изменениями и/или со старением организма и сопровождаются тотальным снижением синтеза и секреции регуляторных пептидов, а также ослаблением чувствительности к ним клеток-мишеней [Erlwanger, etal., 1999],
Пептидные биорегуляторы выполняют не только сигнальную роль, но и принимают участие в регуляции физиологических процессов; начиная с отдельных функций специализированных клеток и заканчивая сложными поведенческими актами [Ашмарин, 1999]. Показано, что линейный эндогенный нонапептид дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП) и ряд его ст~.у:їі/р #л'х синтетических аналогов обладают ярко выраженным стресс-протекторным и адаптогенным действием [Prudchenko, et al., 1993; Хватова и соавт., 2003], Установлена определенная зависимость биологической
5
* активности от структуры у ДСИЛ и его искусственных аналогов [Прудченко
и соавт,, 2003]. Однако возрастные аспекты механизмов действия ДСИЛ и его аналогов на молекулярном и клеточном уровнях остаются
малоизученными.
Целью работы явилось изучение механизмов стресс-протекторного действия у крыс разного возраста ДСИЛ, его структурных аналогов Ш-1, ID-3, ID-8 и их сравнение с традиционно применяемым в неврологии пирацетамом.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
1. Сравнить влияние ДСИП, его аналогов и пирацетама на интенсивность свободи орадикального окисления и активность ферментов антиоксидантной защиты в различных органах и тканях организма;
2.Сравнить тип адаптационной реакции под воздействием гипокинезии на фоне введения ДСИГТ, ID-1, ID-3, ID-8 и пирацетама и без них по анализу формулы белой крови.
3, Сравнить действие ДСИП, его аналогов и пирацетама на уровень
хромосомных аберраций в роговице глаза и костном мозге крыс.
4. В опытах in vitro исследовать влияние ДСИП, ID-1, ID-3, Ш-8 и
пирацетама на продолжительность жизни изолированных нейронов речного
рака.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что изученные пептиды обладают антиоксидантным действием при введении интактным и помещенным в условия гипокинезии молодым и старым животным с высоким уровнем тревожности. В норме и при 24-часовой гипокинезии введение ДСИП, ID-1, Ю-3 и пирацетама оказывало стабилизирующее действие на мембраны эритроцитов, но эффект ID-3 был более выраженным. В услг2"*«х 24-часовой гипокинезии все препараты проявили антимутагенный эффект, но у ID-3 он был максимальным по сравнению с другими исследованными веществами, а наибольшая антимутагенная
активность пептидов была зафиксирована у молодых животных. В опытах in vitro (модель аксотомии) ДСИП, ID-1 и ID-3 достоверно увеличивали, а пирацетам уменьшал продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака. При этом иейропротекторный эффект ДСИП и 10-3 был наиболее сильным, a 1D-8 не оказал достоверного влияния. Основные положения, выносимые па защиту:
Введение ДСИП, его аналогов и пирацетама повышает резистентность организма, способствуя развитию состояния «преадаптации» у интактных крыс разного возраста путем формирования различных стадий тренировки и активации. В условиях гипокинезии введение препаратов препятствовало развитию стресс-реакции за счет замены ее на более эффективные и экономичные варианты резистентной или толерантной (в случае введения ДСИП молодым крысам перед началом 24-часового ограничения подвижности) стратегии адаптации,
Общим молекулярным механизмом проявления антимутагенных и нейропротекторных эффектов, а также повышения резистентности организма при развитии адаптационных реакций на фоне введения ДСИП и его аналогов явилось изменение интенсивности про- и антиоксидантных реакций и поддержание оптимального для данного возраста их соотношения.
Равноценное повышение резистентности организма при использовании пирацетама в интактных условиях и при стрессорном воздействии достигалось при более значительных сдвигах метаболизма, степень которых граничила с изменениями, наблюдаемыми при стрессе.
Теоретическое и практическое значение. Полученные данные позволяют теоретически обосновать роль ДСИП и его аналогов в механизмах выбора адаптационной стратегии организмами разного возраста и обосновать
7 возможность повышения эффективности адаптивного ответа при
переключении с помощью пептидов с одного типа адаптационной реакции на другой. Результаты являются вкладом в медицину и биологию экстремальных состояний, физиологию и биохимию адаптационных процессов, физиологию и биохимию регуляторных пептидов.
Результаты исследования влияния ДСИП и его аналогов на формирование адаптационных реакций животных разного возраста могут использоваться в неврологии, иммунологии и других отраслях клинической медицины б одних случаях в качестве адалтоіенов, в других — как геропротекторных веществ. ДСИП, ID-1 и ID-8 являются типичными адаптогенами и обладают стресс-лимитирующими свойствами, наиболее эффективно снижая негативное влияние гипокинезии у молодых крыс. ID-3 и пирацетам преимущественно обладают геропротекторными свойствами, о чем свидетельствуют наиболее выраженные антистрессорные эффекты данных препаратов у старых крыс и их максимальная способность (по сравнению с другими исследованными веществами) замедлять скорость образования МДА, который является предшественником шиффовых оснований (входящих в состав липофусцина) и оказывает непосредственное влияние на геном клетки (в частности на количество хромосомных аберраций).
Современные стратегии фармакологической профилактики и коррекции возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме
Под коррекцией понимают мероприятия, обеспечивающие оптимизацию функционального состояния организма, повышение, сохранение и восстановление работоспособности [Новиков и соавт,, 1998], Целью коррекции экстремальных состояний по мнению авторов является упреждение их развития, ослабление и купирование возникших проявлений дезадаптации, восстановление неблагоприятных изменений функций после действия чрезвычайных эколого-профессиональных факторов, поэтому коррекция экстремальных состояний может быть упреждающей, текущей и восстановительной. Многочисленные современные средства и способы коррекции экстремальных состояний авторы разделили на четыре группы: 1) Организационные - имеют важное значение в недопущении развития экстремальных (тем более критических) состояний, поскольку в большинстве случаев действие чрезвычайных факторов является прогнозируемым. Одной из важнейших мер организационного характера является оценка и прогнозирование индивидуальной устойчивости человека к действию конкретного неблагоприятного фактора, отбор лиц с высоким уровнем резистентности и определение лиц со сниженной устойчивостью, нуждающихся в мероприятиях коррекции, в том числе за счет максимального снижения дозы экстремального воздействия или объема выполняемой при этом работы. 2) Физиологические способы коррекции экстремальных состояний объединяются таким общим признаком, как непосредственное физическое воздействие на сенсорные системы, ткани и органы. 3) Психологические и психофизиологические методики предусматривают воздействие на сферу психических процессов и состояний с использованием рационального убеждения» внушения в состоянии бодрствования и гипноза, различных способов саморегуляции, 4) Фармакологическая коррекция предполагает одноразовое или курсовое применение различных препаратов или их комбинаций. В настоящее время она является преобладающей в связи с относительной дешевизной, простотой применения и достаточной эффективностью, поэтому мы использовали ее в наших исследованиях. Среди перечисленных средств широко используются фармакологические методы профилактики и коррекции стресс-индуцированных состояний. Наиболее перспективными в этом плане фармакологическими средствами являются вещества, обозначаемые терминами геропротекторы (дословно означает «защищающие от старения») и стресспротекторы [Никитин, 1991; Коркушко и соавт., 2002]. Кроме того, выделяют вещества, оптимизирующие физическую и умственную работоспособность [Бобков, Виноградов, 1982]. Между указанными группами нет четких границ в использовании: многие антистрессорные препараты применяются как геропротекторы и стимуляторы работоспособности и наоборот. О геропротекторных свойствах препарата по мнению академика Никитина В.Н. (1991) и профессора Анисимова В.Н. (2000) можно говорить в тех случаях, когда под его влиянием происходит уменьшение биологического или функционального возраста, повышается физическая и умственная работоспособность, нормализуются параметры метаболизма, активируется работа антиоксидантной системы, снижается интенсивность образования свободных радикалов и мутабильность хромосом в клетках, повышаются адаптационные возможности организма и иммунитет. К основным группам антистрессорных и геропротекторныых веществ относят следующие: L Антиоксиданты. Витамин Е, мелатонин и некоторые синтетические антиоксиданти увеличивают продолжительность жизни лабораторных животных, а добавление в пищу альфа-токоферола на 50% увеличивает выживаемость самцов крыс в условиях экстремальных воздействий [Ames et aL, 1993]. При болезни Паркинсона происходит достоверное увеличение содержания малонового диальдегида (МДА), который наряду с ионами Fe2+ и перекисью водорода может включаться в реакцию агрегации окисленного белка и апоптическую гибель клеток при болезни Паркинсона [White et aL, 1999; Phinncy ct aL, 1999]. Патологическую агрегацию окисленных белковых молекул при стрессе и старении можно уменьшить антиоксидантными агентами, например, Т -ацетил-Ь-цистеином [Yatin et aL, 1У9У]. Янтарная кислота также обладает антиоксидантными и стресспротскторными свойствами, увеличивает продолжительность жизни и противоопухолевый иммунитет [Кудряшова, 1997]. 2. Кальциевые хелаторы защищают нейроны in vitro в модели клеточной гибели, индуцированной глутаматом, и в гипоксических моделях у крыс in vivo. У стареющих животных происходят изменения Са +-зависимых процессов, таких как высвобождение нейротрансмиттеров, синалтическая пластичность и протеазная активность. Предполагают, что в процессе старения нарушается буферное действие пресинаптического внутриклеточного кальция. Причем, снижение концентрации цитозольных протеинов, соединенных с кальцием и выполняющих буферное действие, происходит в гиппокампе, а не коре мозга и не в мозжечке [Ouanounou et al.s 1999]. В нейронах стареющего мозга изменяется регуляция свободного внутриклеточного кальция, возможно, благодаря редукции активности переносчиков кальция. Са -АТРазы плазматической мембраны играют особую роль в гомеостазе кальция, его кинетические свойства меняются в стареющем мозге [Zaidi et al., 1999]. 3. Гормоны, Существуют данные об увеличении продолжительности жизни при применении тиреоидных, половых гормонов и кортикостероидов [Ooka, Shinkai, 1986], о влиянии гормональных препаратов на поведение и адаптационные возможности организма [Меерсон, 1989] 4. Нейротропные средства. Их применение в качестве геропротекторов обусловлено тем, что с возрастом снижается содержание и обмен катехоламинов в мозге, прежде всего в гипоталамусе [Коркушко, Хавинсон, 2002]. Предшественник катехоламинов ДОФА и противосудорожный препарат дифенин (повышающий уровень дофамина в ЦНС) увеличивали продолжительность жизни и снижали частоту развития опухолей у экспериментальных животных, а ингибиторы моноаминоксидазы увеличивают продолжительность жизни у больных болезнью Паркинсона [Birkmayer et aL, 1985]. 5. Адаптогени, Длительное введение экстрактов элеутерококка и женьшеня, семян лимонника корней заманихи, левзей сафлоровидной и аралии маньчжурской благодаря антистрессорному эффекту создавало в организме состояние неспецифической сопротивляемости к неблагоприятным факторам внешней среды, замедляло появление некоторых признаков старения у людей и увеличивало продолжительность жизни животных в эксперименте [Ванюшин, Бердышев, 1977; Гаркави и соавт., 1991]. 6. Имеются данные об увеличивающем продолжительность жизни эффекте препаратов, содержащих комплекс витаминов, микроэлементов и аминокислот [Западнюк, 1977; Коркушко и соавт., 2002]. Применение витаминов в качестве средств предупреждения преждевременного старения обусловлено не только их важной физиологической ролью в организме (витамины являются кофакторами многих ферментов), но и тем, что в пожилом возрасте развивается поливитаминная недостаточность в результате возрастного ухудшения всасывания витаминов в желудочно-кишечном тракте. Кроме традиционных поливитаминных комплексов (Декамевит, Ундевит, Центрум, Витрум и др) хорошо зарекомендовал себя препарат апилак (представляет собой продукт выделения глоточных и частично верхних челюстных желез рабочих пчел, содержащий белки, аминокислоты, липоиды, витамины, микроэлементы и др вещества). Апилак и аналогичные ему препараты (витаапинол и др) благотворно действуют на общее состояние людей (особенно пожилых и старых), их самочувствие, работоспособность, нормализуют обмен веществ.
Пирацетам - психофармакологические свойства и механизмы проявления антистрессорной активности
В условиях экстремальных воздействий на организм перспективным оказалось применение психотропных веществ, объединённых под общим названием - ноотропы [Gouliaev and Senning, 1994; Giurgea, 1972], которые наряду с активацией высшей интегративной деятельности увеличивают устойчивость мозга к повреждающим воздействиям [Воронина, 1989]. Пирацетам (ноотропил)- первый препарат этой группы был открыт Giurgea и Scondia (фирма UCB, Бельгия) при изучении гипноседативной активности циклических производных ГАМК. Однако, при метаболизме пирацетама не происходит разрыва пирролидонового кольца и превращения в линейную ГАМК, если не изменяется рН среды в кислую сторону.
Ноотропы образуют ряд соединений от гидрофильного пирацетама до вьгеоколипофильньгх соединений типа анирацетама и проходят гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) с определенной степенью легкости. Способность гидрофильного пирацетама легко проходить через ГЭБ предполагает наличие в мембране специфических переносчиков и/или проникновение с белковым переносчиком, существующим в крови. Поэтому определение белково-связанной фракции пирацетама важно для назначения максимально эффективной дозы. Высокая гидрофильность приводит к медленному прохождению пирацетама через ГЭБ - пик его содержания в ликворе (10 цг/мл, соответствующее общей концентрации 70 цМ) наблюдается через 3 часа после внутривенного введения 1г [Петков, 1989]. Для ноотропных препаратов, как и для регуляторных пептидов, характерна колоколообразная зависимость поведенческих эффектов от дозы: малые и высокие дозы неактивны, хотя в последнее время показана активность пирацетама в концентрациях на порядок ниже используемых в клинике, а смертельным является введение более 8г /кг внутривенно и более 10 г/кг per.os, (для крыс, собак, мышей). В ЦНС человека период полужизни пирацетама (7.7часов) больше, чем в плазме (5 часов), что указывает на некоторую аккумуляцию в мозге со временем. Аккумуляция пирацетама нервной тканью подтверждается тем, что существенные изменения в микроцир-куляторном русле наблюдаются только на 3-й день после ежедневного введения. В отличие от ГАМК пирацетам полностью выводится из организма не мстаболизнруясь (через 30 часов после однократного введения). Ноотропы отличаются от других групп психотропных препаратов направленностью фармакологических эффектов, среди которых наряду с низкой токсичностью и отсутствием побочных явлений основными являются следующие: 1. Активация интегративной деятельности, улучшение процессов обучения и памяти интактных животных [Воронина, 1991] и коррекция нарушений обучения и памяти (в т.ч. отмена амнезии), вызванных различными воздействиями: электрошок, гипоксия, ишемия, введение химических веществ (скополамин), депривация сна и др [Giurgea, 1982; Маркина и соавт., 1986]. При "сбое" реакции избегания пирацетам (300 мг/кг) положительно влиял на прочность сформированного в предварительном обучении памятного следа и на усвоение нового местоположения отверстия и рычага в челночной камере [Иноземцев и соавт., 1989; Прагина и соавт.? 1990]. 2.Повышение устойчивости мозга к вредным воздействиям (гипоксия, барбитуратовая интоксикация; острая или хроническая алкоголизация, гипо-или гипертермия, травмы мозга и т.д.) проявляется во влиянии на скорость адаптации организма и в усилении компенсаторных механизмов, в частности при нарушении мозговой гемодинамики [Акопян и соавт., 1991] при нарушениях когнитивных и мыслительных функций- Причем, функцио 39 пальная зависимость (коэффициент корреляции 0,29) между антигипоксиче-скими и ноотропньгми свойствами пирацетама отсутствует [Воронина, 1989]. 3. Коррекция нарушений функций ЦНС и неврологических дефицитов при старении, сенильной деменции, болезни Альцгеймера, хореи Гентингтона [Pierlovisi-Lavaivre et al., 1991] и у молодых животных, родившихся от подвергнутых воздействию алкоголизации, интоксикации или гипоксии самок [Козяри соавт,, 1994] 4. Антидепрессивное действие и характерный для антидепрессантов апксиолитический эффект, подтверждаемый усилением вклада сегментов с а-подобной активностью в динамическую структуру ЭЭГ [Каркищенко, 1993]. 5. Повышение порога возбудимости экспериментального нистагма послужило основанием для применения пирацетама как средства, уменьшающего головокружение, 6. Працетам усиливает антиконвульсивное действие антиэпилептиков и эффективен при паркинсонизме и в психотических состояниях шизофрении [Paulus et. ah, 1991]. 7Лсрсстройка спектров мощности ЭЭГ интактных животных в состоянии бодрствования свидетельствует об оптимизации соотношения процессов возбуждения и торможения в нервной системе и о возрастании периода бодрствования животных и человека [Sannita et aL, 1983]. Велика роль ГАМК-ергической тормозной системы в ослаблении пирацетамом (9 г t.v.) чрезмерной реакции возбуждения у пациентов после слабой стимуляции щелчком [Schenk, 1979], когда наблюдалась тотальная десинхронизация ЭЭГ паттернов во всех задних областях головы (десинхронизацию связывают с повышением возбудимости и лабильности мозга в результате усиления процессов активации коры). 8. Способность облегчать транскаллозальный вызванный потенциал мозга некоторых видов животных [Giurgea, Moyersoons, 1972; Kirsch, Schmidt, 1985] свидетельствует об облегчении ноотропами передачи между полушариями через мозолистое тело, как между поверхностными, так и глубокими слоями коры, Пирацетам (9т однократно) сглаживает межполушар-нуго ассимметрию; если правосторонняя ЭЭГ человека проявляет слабый нестабильный спектр по сравнению с левой стороной, пирацетам улучшает правосторонний паттерн задней области.
Влияние ДСИГТ, его аналогов и пирацетама на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака
В последние годы усиливается внимание к проблеме лечения нейродегенеративных заболеваний, связанных со старением (болезни Алыдгеймера, Паркинсона и др.) или стресс-индудированных [Хавинсон и соавт., 2003]. Показано, что патогенез рассеянного склероза и перечисленных заболеваний связан с уменьшением числа нейронов в разных отделах мозга и их гибелью путем апоптоза [Abbaracchio Et al., 1999]. Ряд новых лекарственных средств, предложенных для лечения нейродегенеративных заболеваний (ноотропы пирролидонового ряда, производные аминоакридина, ингибиторы моноаминоксидазы) могут замедлять деградацию нейронов, повышая их резистентность к патогенным факторам при сснильных поражениях мозга [Salo, Tatton, 1992], однако средств, кардинально улучшающих состояние больных при данных патологиях, пока не найдено. При изучении и отборе лекарственных средств необходимы адекватные модели для детального исследования гибели нервных клеток. Существует несколько подходов: 1. морфологическая оценка числа нейронов в разных отделах мозга экспериментальных животных или умерших людей при сенильных поражениях и приеме соответствующих лекарств [Rinne et al., 1991]; 2. использование веществ, моделирующих течение нейродегенеративных заболеваний, например, нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,5,6-тетрагидропиридина (МФТП) в модели болезни Паркинсона с дегенерацией нейронов черной субстанции [Langstrom et al., 1984] 3. изучение гибели аксотомированных мотонейронов после отделения от мышечной мишени - одна из новых и простых моделей [Salo, Tatton, 1992], Механорецепторный нейрон рака, способный длительно генерировать потенциалы действия с заданной частотой, является адекватным объектом для такого исследования. По тонкой структуре, электрофизиологическим и биохимическим свойствам он весьма сходен с центральными нейронами [Буравков и соавт., 1996]. Полученные результаты влияния пептидов и пирацетама на продолжительность жизни изолированных нейронов Astacus leptodactilus представлены в таблице 1. Спонтанное прекращение импульсации изолированного нейрона происходило обычно так: после 8-10 часов сравнительно стабильной работы с заданной частотой появлялись сначала небольшие флуктуации частоты длительностью несколько секунд, потом появлялись более медленные ритмы с периодом в несколько минут. Средняя частота ПД снижалась, затем начиналось выпадение отдельных импульсов, импульсация приобретала хаотический характер и быстро затухала. Нами показано, что ДСИП и ID-3 наиболее значительно удлиняли продолжительность жизни изолированных нейронов. Добавление ДСИП в инкубационную среду увеличивало продолжительность жизни изолированных нейронов на 37% (р 0,05) в среднем с 11,9 до 16,3 часов, а добавление Ш-З на 35% в среднем с 8,6 до 11,6 часов. Эффект ID-1 был менее значительным, так как время гибели нейронов задерживалось на 16% (0,05 р 0,1), a ID-8 не оказал достоверного влияния. Пирацстам, напротив, на 17% (р 0,05) ускорял гибель изолированных нейронов в модели апоптоза. Таким образом полученные результаты позволяют говорить о выгодном отличии пептидных препаратов от пирацетама и предположить, что замедление гибели нейронов ДСИП и его некоторыми аналогами может лежать в основе их нейропротекторного эффекта. Возможно, причина увеличения времени жизни нейронов при действии ДСИП и его аналогов связана не столько с их действием на электрофизиологические мембранные процессы, сколько с влиянием на внутриклеточный метаболизм. Такое предположение связано с появившимися в литературе сообщениями о том, что изменение времени жизни изолированных нейронов при действии на них различных веществ связано с внутриклеточными структурно-химическими перестройками, например, изменение липидного состава синаптосомальных мембран и их текучести [Буров и соавт., 1992]. Возможно также, что при длительной работе изолированного нейрона, генерирующего сотни тысяч потенциалов действия, истощаются энергетические ресурсы, и клетка не справляется с поддержанием трансмембранных потенциалов. Кроме того, при нарушении функциональной активности митохондрий из них высвобождаются ионы кальция, что приводит к изменению возбудимости и импульсной активности нейрона, а в итоге к невозможности генерации ПД [Nicholls, 1994]. При дальнейшем росте концентрации ионов Са2_ь в клетке они запускают цепь реакций, обуславливающих ее гибель [Berkelaar et al., 1994]. Возможно, ДСИП и его аналоги действуют на звенья процесса клеточной гибели, связанные с концентрацией кальция. Учитывая, что к важнейшим цитотоксическим факторам регуляции продолжительности жизни нейронов относятся перекиспые соединения, в следующих разделах работы мы исследовали влияние пептидов и пирацетама на уровень аберраций хромосом, интенсивность свободпорадикального окисления и тип адаптационной реакции у крыс разного возраста в норме и при стрессе.
Биохимические показатели мозга и крови крыс разного возраста при введении пептидов и пирацетама в нормальных физиологических условиях и при гипокинезии
Увеличение мутабильности хромосом в условиях экстремальных воздействий на организм было показано при повышенном давлении кислорода и гипоксии [Бреиь, Гуськов, 2000; Фатеева, 2002]. Причиной такого увеличения многие авторы называют изменение уровня ряда гормонов после стресса [Лебедева, Скорова, 1985] и активацию лизосомальных ферментов, в то время как стабилизация лизосомальных мембран снижает интенсивность мутационного процесса [Гуськов, 1985; Панин, Маянская, 1987].
При помещении молодых крыс в условия 24-часовой гипокинезии наибольший антимутагенный эффект зарегистрирован при введении ID-3, менее выраженный - у ДСИП и пирацетама и наименьший - у ID-1, ID-8 (для двух исследованных тканей практически в равной степени). У 16-месячных крыс в условиях 24-часовой гипокинезии наиболее эффективно препятствовал росту числа хромосомных аберраций ID-3, тогда как эффект остальных препаратов был менее выражен.
Важнейшую роль в ДНК-поврежданшдих и мутагенных эффектах стресса отводят продуктам свободнорадикального окисления. Доказана мутагенность алканов и алкенов, гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот [Серединин, Дурнев, 1992].
В связи с этим для выяснения механизмов стресспротекторного и антимутагенного эффекта изучаемых препаратов в следующем разделе работы исследовали их влияние на интенсивность свободнорадикальных процессов в условиях стрессорного воздействия.
Свободнорадикальные процессы сопровождают не только физиологическое и ускоренное старение, но и любой патологический процесс, включая такие ассоциированные с возрастом заболевания как рак, дисфункции головного мозга, сердечно-сосудистой системы и других органов [Harman, 1992; Ojami et al., 1999; Хавинсон, Морозов, 2001]. С другой стороны активные формы кислорода (АФК) являются нормальными продуктами метаболизма и образуются в клетках живых организмов при фермеитативпых и неферментативных реакциях окисления. Например, образование АФК или активированных кислородных метаболитов происходит при обмене веществ в норме и при экстремальных воздействиях, во время клеточной гибели путем некроза и апоптоза, в процессе мутагенеза, кластогснеза и старения [Степаничев и соавт, 2000; Коркушко и соавт., 2002].
К активным в биологическом смысле формам кислорода относят перекись водорода Н202! гидроксильный радикал ОН , супероксидный анион-радикал 02 и некоторые другие [Владимиров, 1991]. Эти формы вступают в реакции с фосфолипидами биомембраи, вызывая их перекисное окисление (ПОЛ). В нормальных условиях эти реакции необходимы для адаптации живых организмов к меняющимся условиям среды, для поддержания структуры и функции биомембран, синтеза простагландинов, простациклинов и лейкотриенов, нормального протекания процессов фаго- и пиноцитоза [Новиков, 1996], При стрессорных воздействиях на организм интенсивность взаимосдействия активных форм кислорода с мембранами клеток возрастает, что приводит сначала к образованию пор, проницаемых для ионов кальция, а затем к разрушению мембран, повреждению генетического аппарата и/или гибели клеток [Нилова, Полежаева, 1992; Дурнев, Серединин, 1998].
Установлено, что в контрольной группе старых крыс в коре головного мозга высота быстрой вспышки ХЛ? активность СОД и каталазы на 15%, 38% и 28% ниже (р 0,05) соответствующих показателей в контрольной группе молодых животных (Таблицы 11, 18, 21), Наши данные соответствуют мнению других авторов о том, что при «физиологическом» старении снижается интенсивность окислительно-восстановительных реакций, уменьшается уровень максимального потребления кислорода и происходит падение интенсивности ПОЛ [Коркушко и соавт., 2002].
В повышение резистентности организма после введения ДСИП интактным молодым крысам внесло существенный вклад снижение интенсивности свободиорадикального окисления и усиление активности антиоксидантних систем. Снижение светосуммы и высоты быстрой вспышки ХЛ в плазме крови и коре головного мозга в течение первых суток после введения ДСИП на 20% - 27% (р 0,05) указывает на уменьшение интенсивности свободнораликальных реакций в исследуемых субстратах (Таблицы 10 11). Начиная с 3-го часа и до окончания 1-х суток после введения ДСИП, отмечалось снижение уровня мапонового диальдегида (Таблица 12) в коре головного мозга на 39% и 50% (р 0,05), что по данным литературы коррелирует с низким уровнем потребления кислорода и слабой выработкой супсроксид-анион-радикала [Аврова, 1999].
Судя по снижению содержания в плазме крови внеэритроцитарного гемоглобина через 3 часа и отсутствию достоверных изменений во все оставшиеся сроки, инъекция ДСИП не приводит к нарушениям структуры и проницаемости биомембран (Таблица 15). Такой мембраностабилизирующий эффект возможен благодаря увеличению концентрации церулоплазмина через 7 и 24 часа после введения ДСИП (Таблица 12), одного из важнейших антиоксидантов, обладающего супероксиддисмутазной активностью [Бондаренко и соавт., 1985]. Церулоплазмин окисляет Fe2_L и взаимодействует с предшественником супероксид-анион-радикала (гидратированным электроном), что приводит к росту антиокислительной активности крови. Действительно, в гемолизате эритроцитов обнаружено повышение активности супероксиддисмутазы через 3 и 24 часа и каталазы на 1-е сутки действия пептида (Таблицы 18, 21).
