Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Биологически активные пептиды 10
1.2. Дельта-сон индуцирующий пептид 11
1.3 Инкапсулирование пептидов 17
1.4 Включение белков и пептидов в биосовместимые матрицы для тканевой инженерии 34
1.5 Сшивающие агенты в тканевой инженерии 49
1.6 ПАВ, стабилизирующие наноэмульсию, применяемую для капсулирования ДСИП 54
1.7 Заключение 55
2 Собственные исследования 57
2.1 Материалы 57
2.2 Методы исследований 58
3 Результаты исследований 69
3.1 Включение ДСИП в водную фазу обратной наноэмульсии 69
3.2 Иммобилизация ДСИП на полимерных подложках 83
3.3 Влияние ионной силы на динамику пространственной структуры ДСИП
4 Обсуждение полученных результатов 116
5 Выводы
6 Практическое использование полученных результатов 120
7 Рекомендации по использованию научных
Выводов 120
Список литературы
- Инкапсулирование пептидов
- Сшивающие агенты в тканевой инженерии
- Иммобилизация ДСИП на полимерных подложках
- Практическое использование полученных результатов
Инкапсулирование пептидов
Эндогенный ДСИП снижает содержание малонового диальдегида, увеличивая при этом содержание каталазы и супероксиддисмутазы в мозговых тканях, печени и плазме крови подопытных крыс и пиррулоплазмина в плазме крови, умеренно увеличивая при этом содержание мочевины и мочевой кислоты в тех же тканях [Бондаренко и др., 2011]. Данный пептид влияет на работу нейроиммунной системы [Yehuda and Carasso, 1988; Kruger and Karnovsy, 1995], терморегуляцию, ЛОКОМОЦИЮ, частоту сердечных сокращений и кровяное давление [Yeguda et al., 1980,1988], увеличивает активность моноаминоксадазы А и уровень серотонина в головном мозге [Khvatova et al., 1995; Ouichou et al., 1992], оказывает влияние на выход в кровь гормонов гипоталамуса и передней доли гипофиза [BjarteUetal.,1990].
Кроме того, ДСИП снижает интенсивность абстинентного синдрома у морфин-зависимых мышей [Dick et al., 1984; Scherschlicht et al., 1984], а также обладает антиметастатической активностью Цїрудченко и др., 1993]. Было показано, что иммунореактивный Met-энкефалин, вьщеляющийся из медуллярных синаптосом у грызунов, также стимулируется ДСИП в концентрации 10"10-10"9 М. Вместе с этим ДСИП стимулирует вход Са2+ в нервные окончания [Nakamura et al., 1991]. Выявлено также, что ДСИП стимулирует синтез белков и нуклеиновых кислот в нервных клетках, снижает активность рибонуклеотидредуктазы, что в свою очередь определяет пролиферативную активность клеток [Rikhireva et al., 2010; Schoenenberger, 1984; Бондаренко и др, 2011], влияет на экспрессию гена c-fos [Umrukhin et al., 2012].
Функциональные особенности ДСИП: белки-предшественники, рецепторы, взаимодействие с гемато-энцефалическим барьером, расщепление пептидазами.
Точный механизм взаимодействия ДСИП с клеткой неизвестен, однако выявлено, что он может переноситься через гематоэнцефалический барьер по механизму пассивного транспорта [Gray et al., 1994]. Вместе с этим в клетках эпителия микрососудов головного мозга найдены аминопептидаза и пептидилдипептидаза, расщепляющие ДСИП [Augustijns et al, 1995].
После предварительного ионофореза ДСИП отмечается меньшее число активированных глутаматом нейронов, что дает основания полагать, что ДСИП связывается с NMDA-рецепторами (Рисунок 2), т.к. связывание ДСИП с сайтом мембраны нейрона препятствует активации рецептора глутаматом. В работах Umryukhm et al. (2004, 2012) также высказывается предположение, что ДСИП взаимодействует с NMDA-рецептором по С-концевой аминокислоте Glu, которая может выполнять функции антиконвульсанта [Piotrovskii, 1992], либо возможно непрямое взаимодействие.
По данным Grigor ev et al. (2006), ДСИП взаимодействует с рецепторами GABA (Рисунок 3) нейронов гиппокампа и мозжечка, при этом пептид значительно и доз-зависимо усиливает ток в этих нейронах. Согласно работе Nakamura et al. (1991), ДСИП связывается с опиоидными рецепторами (Рисунок 4). Так, опиоидный антагонист налоксон ингибирует противоболевое действие ДСИП [Nakamura et al., 1986, 1988, Nakamura and Shiomi, 1990; Shiomi and Nakamura, 1990]. Кроме того, ДСИП снижает уровень стресс-индуцированной экспрессии гена c-fos в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса [Sudakov et al., 2001, Umnukhin, 2002], что увеличивает стресс-устойчивость крыс [Sudakov et al., 1991].
При исследовании взаимодействия ДСИП, меченного по Тгр 1-оксил-2,2,5,5-тетраметилмирролин-З-карбоновой кислотой, с мембранами эритроцитов были выявлены изменения в плазматической мембране, в частности в статусе ее липидных компонентов [Rikhireva et al., 1995].
Белок-предшественник ДСИП до сих пор не выявлен. Исследования показали, что в клетках передней доли гипофиза мыши образуются три предположительных белка-предшественника ДСИП (50-60 кДа), которые последовательно расщепляются до двух относящихся к ДСИП фрагментов промежуточных соединений массой 35-45 кДа и одной группы 9-16,5 кДа. В итоге следующего расщепления образуются фрагменты менее 3 кДа, содержащие Gly, но не включающие Ala и Arg [Bjartell et al, 1990]. В базах данных аминокислотных последовательностей белков и кодирующих их ДНК и РНК (про- и эукариот) обнаружены последовательности, отличающиеся от последовательности ДСИП, по крайней мере, на 1 аминокислоту. Анализ аминокислотных последовательностей эукариот выявил последовательность WKGGNASGE близкую по составу ДСИП в составе JmjC-домена в составе деметилазы гистонов, кодируемой геном JMJD1B. Данная последовательность кодирует KND пептид, который обладает схожими с ДСИП свойствами [Mikhaleva et al., 2011; Mikhaleva et al., 2013].
Диффузия через гематоэнцефалический барьер является условием нормального функционирования нервной системы. Плотные межклеточные контакты препятствуют прохождению через него гидрофильных веществ, однако низкомолекулярные липофильные соединения, такие как 02 и СОг, свободно проходят через него по градиенту концентрации. Более крупные молекулы (белки и аминокислоты) проходят через гематоэнцефалический барьер с помощью переносчиков [Ballabh et al., 2004].
Однозначного ответа на вопрос, проходит ли ДСИП через гематоэнцефалический барьер, до сих пор не существует. Согласно ряду работ, амфифильная молекула ДСИП частично проходит через гематоэнцефалический барьер так же, как и сквозь клеточные мембраны. Перенос происходит как диффузно, так и с помощью механизма, расположенного, предположительно, в дне 4-го желудочка [Graf et al. 1984, 1986; Schoenenberger 1984; Inoue, 1988; Yehuda et al. 1988; Gray et al. 1994; Polverini et al., 1998; Strekalova, 1998]. Согласно исследованиям Sudakov et al. (2004), при микроионофорезе ДСИП происходит активация некоторых отделов мозга, прежде всего, дорсального гиппокампа и переднего вентрального таламического ядра.
Сшивающие агенты в тканевой инженерии
В качестве дополнительных компонентов в состав водной фазы вводили ДЭАЭ-декстран либо модифицированный хитозан до конечной концентрации 2 мг/мл или альбумин (30 мг/мл) в виде водных растворов. При введении дигидрокверцетина (ДГК) в водную фазу эмульсии, к 1,5 мкл 2х раствора ДСИП и Pluronic F127 добавляли 1,5 мкл спиртового раствора ДГК (30 мг/мл).
Объем водной фазы, необходимый для получения устойчивой эмульсии, определяли эмпирически, путем добавления водной фазы к 100 мл органической фазы до получения прозрачной смеси.
Молекулярные характеристики образующихся обращенных мицелл были исследованы методом динамического светорассеяния на установке ALV-CGS-5022F (Германия). Перед измерением растворы анализируемых образцов были профильтрованы через мембранный фильтр 0,45 мкм. Анализировали зависимости гидродинамических радиусов мицелл от содержания воды в системе (молярное отношение воды и поверхностно-активного вещества).
Измерения проводили, используя фотонный корреляционный спектрометр, состоящий из Не - Ne лазера с длиной волны падающего излучения 632,8 нм, гониометра, 72-х канального коррелометра «ФотоКорр - М» и компьютера.
Измерения проводили в неполяризованном свете при угле рассеяния 90. Перед измерением растворы анализируемых образцов фильтровали через фильтры фирмы «Millipore» (0,45 мкм) непосредственно в измерительную кювету. Анализ автокорреляционной функции флуктуации интенсивности проводили методом кумулянтов и регуляризации. Значения среднего гидродинамического радиуса частиц вычисляли по уравнению Стокса -Эйнштейна Rh = kT/6D0, где h - вязкость растворителя, D0 - коэффициент диффузии рассеивающих частиц, к - постоянная Больцмана. Изучение стабильности ДСИП в составе наноэмульсии и кинетики выхода в микросреду Данный этап работы проводился в Лаборатории «Полимеры для биологии» и
Лаборатории химии пептидов, Группе аналитической химии белка, Лаборатории протеомики (ИБХ РАН, Москва). Аликвоты наноэмульсии по 103 мкл поместили в пробирки Eppendorf и инкубировали 2 мес. при комнатной температуре и 4С, 10-кратно разводили 70% водным раствором ацетонитрила и анализировали методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в градиенте ацетонитрила (0-60%).
Параллельно снимали масс спектр образцов, водных и солевых растворов ДСИП, спустя различное время хранения (1 - 60 сут.).
Для определения выхода пептида аликвоты образцов 103 мкл (100 мкл органической фазы + 3 мкл водной) наноэмульсии или 100 мкл раствора пептида в воде или PBS (контроль) помещали в пробирки Eppendorf, закрытые полупроницаемой мембраной Spectrapor (Spectrum Medical Industries, Inc., USA, поры 6000-8000 Да) и проводили диализ против 1 мл воды (в случае, когда водная фаза была вода) или PBS, рН 7,4 (когда водная фаза была PBS), в ряде экспериментов диализ против PBS проводился, даже если в качестве водной фазы использовали воду. Через 2, 9 и 24 ч отбирали 100 мкл диализата и добавляли 100 мкл свежей воды или PBS соответственно для сохранения объема диализата, либо полностью отбирали весь объем диализата и заменяли его свежим буфером или водой.
Для определения концентрации пептида в образцах диализата проводили ВЭЖХ в изократическом режиме (см. ниже).
Масс-спектрометрия проводилась в режимах MALDI и Электроспрей. Предварительно снимали хроматограммы растворов ДСИП (0,1 - 0,4 мг/мл). Иммобилизация ДСИП на полимерных носителях Полимерные гидрогели были приготовлены на базе Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева (2008-2010 гг.). В качестве неионогенных носителей были исследованы криогели модифицированного поливинилового спирта (ПВС) и ПВС, содержащий эпокси-группы (ПВС-ГМА), и изотропный гель ПВС.
Параметры пористости системы изучали посредством микрофотографирования. Микрофотографии носителей были получены методом сканирующей электронной силовой микроскопии (JSM U3 (Japan)) with accelerating voltage 15 kV and cathode-ray current 1 10"10 A and system WinEDS. Размер пор всех гелей составил 25-30 мкм и определялся условиями замораживания.
Криогели модифицированного ПВС Модификацию ПВС глицидиловым эфиром метакриловой кислоты с целью введения в состав полимера способных к сшивке по радикальному механизму двойных связей проводили в среде ДМФА. Навеску полимера растворяли в ДМФА при кипении. Затем раствор охлаждали до +120С, добавляли раствор ГМА в ДМФА и перемешивали при нагревании в атмосфере азота. По завершении процесса реакционную систему охлаждали. Полимер высаждали в ацетон. Выпавший полимер переосаждали из воды в ацетон. После чего дополнительно очищали диализом и сушили лиофильно. Степень замещения полимера определяли по отношению интегральных интенсивностей сигналов винильных (5,8 и 6,1 м.д.) протонов остатка ГМА и метиленовых протонов основной цепи ПВС (1,4 м.д.) в спектре -ЯМР (Varian VXR-300S). Для получения всех исследуемых гидрогелей использовался полимер (ПВС) со степенью замещения 3,5 моль%.
Макропористые полимерные гели готовили по следующему протоколу. Навеску модифицированного полимера ПВС (0,6 г) растворяли в 10 мл дистиллированной воды при 80С, после чего охлаждали до 5 С. Для удаления растворенного кислорода раствор вакуумировали и продували аргоном, после чего добавляли инициирующую систему (0,6 мл 2 %-го водного раствора ПСК и 0,06 мл ТМЕД). После добавления инициирующей системы реакционную систему заливали в стеклянные формы и помещали в криотермостат (Julabo F-32, США), где поддерживали температуру -15 ± 0,2С в течение 6 ч.
По завершении процесса реакционную систему быстро размораживали, образовавшиеся гидрогели промывали в кипящей воде до полного исчезновения в промывных водах непрореагировавших компонентов. Качество отмывки определяли, измеряя интенсивность поглощения в интервале длин волн 200-300 нм при помощи спектрофотометра (Beckman DU-65, ФРГ). Отмытые гидрогели замораживали и сушили лиофильно с помощью Alpha I-4LD (Martin Christ GmbH, Germany) [Artyukhov et al, 2010].
Макропористые гидрогели поливинилового спирта, содержащие эпоксидные группы (ПВС-ГМА)
Навеску модифицированного полимера ПВС (0,38 г) растворяли в 10 мл дистиллированной воды при 80С, после чего охлаждали, добавляли ГМА (2,2 г), после чего раствор охлаждали до температуры 5С. Для удаления растворенного кислорода раствор вакуумировали и продували аргоном, после чего добавляли инициирующую систему (0,6 мл 2 % водного раствора ПСК и 0,06 мл ТМЕД). Затем реакционную систему заливали в стеклянные формы и помещали в криотермостат (Julabo F-32, США) и инкубировали при -15 ± 0,2 С в течение 6 ч.
Иммобилизация ДСИП на полимерных подложках
Данные флавоноиды были взяты в качестве объектов сравнения на основании нижеследующего. 1. Кверцетин имеет схожую структуру с ДГК (см. Рисунок 24, Материалы и методы). 2. Байкалин содержит в своей структуре дополнительное кольцо, т.к. является глюкуронидом байкалеина (см. Рисунок 24).
Оба флавоноида были взяты в конечной концентрации 0,1 мг/мл. В этой концентрации оба флавоноида нерастворимы в воде, а байкалин в стоковой концентрации (10 х) 1 мг/мл - даже в спирте, поэтому его наносили на матрицу в виде взвеси. В процессе инкубации матриц в водно-спиртовом растворе байкалина и кверцетина произошло их окрашивание в желтый и оранжевый цвет соответственно, что также объясняется окислением полифенолов.
Во время инкубации матриц в водно-спиртовых растворах кверцетина и байкалина в среду вышло 30±3% пептида при использовании кверцетина, в то время как в присутствии байкалина выхода не наблюдалось. Это могло объясняться тем, что кверцетин является более сильной кислотой, существенно повышающей ионную силу раствора, чем дигидрокверцетин.
Расчет кинетики выхода ДСИП происходил с учетом потерь при обработке матрицы. При этом можно видеть, что выход ДСИП в присутствии кверцетина происходил в течение 9 ч в то время как в контроле он осуществлялся в течение 3 ч. Стартовая концетрация ДСИП в растворе (спустя 0,5 ч инкубации) составляла порядка 40%, в то время как в контроле она была порядка 65%, что в результате более плавного выхода ДСИП из матрицы, модифицированной кверцетином. В свою очередь байкалин существенно замедлял выход ДСИП (ок. 17±3% в течение 30 ч), при этом стартовая концентрация составляла ок. 8% (Рисунок 58).
После 8 ч инкубации выход ДСИП из матрицы, модифицированной байкалином, практически прекратился.
Смена среды инкубации на свежую и возрастание ионной силы раствора (замена 0,7% NaCl на PBS рН 7.4) не приводили к дополнительному выходу ДСИП через 24 ч из матрицы, модифицированной байкалином. Низкая растворимость байкалина и наличие дополнительного кольца в его структуру создали не только стерические, но и механические препятствия для выхода включенного в матрицу ДСИП.
ДГК обладает еще и таким преимуществом, как большая по сравнению с кверцетином и байкалином растворимость в водно-спиртовом растворе, что позволяет ему более равномерно распределиться по поверхности матрицы. Таким образом, ДГК был признан более эффективным модификатором матриц Со-ДМАЭМА-МБАА по сравнению с кверцетином и байкалином. Исследование цитотоксичности матриц Со-ДМАЭМА-МБАА, модифицированных ДГК. В связи с тем, что флавоноиды являются активными соединениями и ДМАЭМА проявляет токсичность и мутагенность [van Steenis et al, 2003; You, Auguste, 2009; Robbens et al., 2010; Yancheva et al, 2007], далее изучали цитотоксичность полученных матриц. Было показано, что немодифицированный Со-ДМАЭМА-МБАА токсичен для клеток линии К-562, что выражалось в гибели клеток культуры в течение 1 сут., в то время как модификация матриц 1 мг/мл ДГК (масса матрицы 10-20 мг) способствовала выживаемости клеток. Отмывка матриц в PBS от несвязавшегося окисленного ДСИП способствовала снижению токсичности матрицы (Рисунок 59). A С вD
Показали, что концентрация 0,1 мг/мл ДГК в качестве модифицирующего агента (в составе матрицы) не снижала скорость роста клеток по сравнению с контролем, в то время как 1 мг/мл начинает существенно замедлять скорость роста клеток на 3-4 сутки. Ни одна из использованных концентраций 0,1-10 мг/мл не вызывала гибели клеток.
На примере клеток Jac-І было показано, что концентрация ДГК 1 мг/мл тоже супрессирует рост клеток (Рисунок 61), что особенно заметно на 5-е сутки инкубирования. Более низкие концентрации незначильно отличаются от контроля.
Также было выявлено, что находящийся на поверхности несвязавшийся ДГК вызывал гибель клеток линий Jurkat, НУЛ293, К-562, НаСаТ, А431, в то время как отмывка PBS (рН 7,4) в течение 1 сут. приводила к устранению токсичности (Рисунок 59). В супернатанте при этом регистрировался окисленный ДГК. Цитофлуориметрический анализ показал, что процентное содержание мертвых клеток в образце, содержащем Со-ДМАЭМА-МБАА, модифицированный ДГК, не отличается от контроля.
В связи с тем, что отмывка матриц, модифицировинных ДГК с помощью PBS, приводит к вымыванию не только несвязавшегося с ними окисленного ДГК, но и части ДСИП, было предложено промывать матрицы этанолом (70%). Однако такая практика не дала ожидаемого результата и токсичность матриц не снижалась (Рисунок 59). Включение ДСИП в матрицы модифицированного ПВС на стадии их формирования С целью замедления скорости выхода ДСИП в раствор мы вводили пептид в матрицу модифицированного ПВС на стадии ее формирования. При этом около 70% ДСИП выходило из матрицы в 0,9% NaCl в течение 35 ч при условии, что матрицу не подвергали предварительному высушиванию (далее «Влажная линза»). Дальнейший выход ДСИП не наблюдался в связи с необратимым связыванием пептида с матрицей (Рисунок 62).
Так как длительное нахождение ДСИП во влажной среде с высокой ионной силой (например, при хранении матрицы) отрицательно влияет на его стабильность, было предложено высушивание матриц ПВС лиофильно для формирования пористых гелей и на воздухе для получения структур с меньшим соотношением поверхность/объем. При этом было выявлено, что длительное высушивание полимерной матрицы на воздухе (в течение 3 сут.) приводит к повреждению пептида, что выражается в появлении на хроматограмме дополнительного пика (Рисунок 62), высота которого возрастала с течением времени. Сам процесс высушивания происходил крайне медленно, т.к. данный гидрогель хорошо удерживает воду, и даже попытки обезвоживания с помощью 97% этилового спирта не дали значимого результата.
Практическое использование полученных результатов
Дельта-сон индуцирующий пептид является перспективной составляющей лекарственных препаратов, направленных на восстановление функций центральной нервной системы, однако его низкий уровень устойчивости к действию пептидаз крови препятствует его широкому применению и не позволяет снижать стоимость курса лечения. Вместе с этим включение ДСИП в биосовместимые, одобренные медицинской практикой носители, позволяет минимизировать эти проблемы. Так, применение в качестве носителей w/o наноэмульсий, основанных на эвкалиптовом масле и воде, позволяет существенно (до 10 раз) снизить время полужизни однократно введенной дозы пептида по сравнению с водным раствором; позволяет вводить его интраназально, устраняя необходимость инъекционного введения и прямого контакта с пептидазами крови. Наблюдается также существенная разница в скорости выхода ДСИП при использовании эвкалиптового масла и лимонена. Так, эвкалиптовое масло в 6 раз по сравнению с лимоненом замедляло выход ДСИП.
Увеличение ионной силы водной фазы наноэмульсий на основе эвкалиптового масла в случае замены воды раствором PBS или включения мукоадгезивных компонентов (хитозан, ДЭАЭ-декстран) способствовало ускорению выхода ДСИП (8х при PBS vs. вода), однако включение антиоксидантного полифенола дигидрокверцетина, наоборот, замедляло выход ДСИП в 2 раза как из наноэмульсий, так и из водного раствора.
Наноэмульсия на основе эвкалиптового масла стабилизирует ДСИП, поскольку даже при наличии в водной фазе солей около 80% молекул ДСИП сохраняют при хранении при +4С свою структуру в течение 2 месяцев, в то время как в фосфатном буфере ДСИП полностью разрушается в течение нескольких дней. Таким образом, включение ДСИП в наноэмульсию способствует не только пролонгированию выхода однократно введенной дозы ДСИП, но и его сохранности.
В рамках исследования механизма стабильности ДСИП было проведено математическое моделирование поведения молекулы ДСИП при различной ионной силе раствора. Было показано, что увеличение ионной силы способствовало ускорению подвижности (вращения) молекулы пептида и возрастанию суммарного периода неупорядоченной конформации; картина водородных связей приобретает случайный характер, что может являться причиной того, что ДСИП не только теряет стабильность, но и образует менее устойчивые связи с компонентами наноэмульсии.
Другим способом применения является возможность включения ДСИП в полимерные матрицы для тканевой инженерии, т.к. иннервация имплантатов является существенной проблемой. Включение ДСИП, наряду с рядом нейротрофинов, позволит способствовать иннервации прорастающей в имплантат ткани организма.
В результате проведенной работы в качестве исследуемых материалов были выбраны модифицированный ПВС и Со-ДМАЭМА, применяемые в медицине, в том числе в стоматологии. Макропористые гидрогели ПВС способствовали выходу ДСИП в течение 3 ч, однако если ДСИП включали в данный гель на стадии его формирования и не подвергали лиофлизации (т.е. использовали влажный гель), то время выхода пептида доходило до 2 сут. При лиофильном высушивании данной конструкции кинетика выхода ДСИП не отличалась от кинетики при введении его в заранее приготовленный макропористый гидрогель ПВС, что говрит об очевидном влиянии соотношения объем/поверхность. Высушивание полученного геля на воздухе способствовало изменению структуры ДСИП, что являлось следствием нахождения ДСИП в среде с высокой ионной силой. Наличие в гидрогеле ПВС эпокси-групп способствовало ковалентному связыванию ДСИП с подложкой.
ДСИП, включенный в положительно заряженные гели Со-ДМАЕМА-МБАА, выходил в раствор в течение 1-3 ч (несколько медленнее при сниженном рН), что недостаточно для формирования нейропротекторного действия в имплантате. С целью замедления выхода ДСИП поверхность полимерной матрицы была обработана применяемыми в медицине натуральными полифенольными соединениями дигидрокверценином, кверцетином и байкалиномс целью создания дополнительных стерических затруднений для выхода ДСИП.
В предварительных экспериментах с положительно заряженными белком коллагеном или синтетическим полимером полиэтиленимином было показано, что полифенолы, например, дигидрокверцетин, способны образовывать поперечные сшивки, в частности, по аминогруппам. В результате использование матрицы Со-ДМАЕМА-МБАА, модифицированной дигидрокверцетином, позволяет продлить выход ДСИП в течение 1 сут. (70%), в то время как из немодифицированной матрицы ДСИП выходил в течение 1 ч. Применение байкалина способствовало выходу только 10% ДСИП после суток инкубации, дальнейших выход ДСИП прекращался, что дало основание отказаться от его применения. При использовании кверцетина 90% ДСИП выделялось в раствор в течение 10 ч, однако на стадии инкубации ДСИП-содержащей матрицы с данным соединением, потеря пептида составила 30% (vs. 15% с дигидрокверцетином), что также способствовало отказу от кверцетина. К тому же кверцетин обладал значительной токсичностью, что было показано в экспериментах.
При сравнении с другими исследуемыми полифенолами (кверцетин и байкалин), дигидрокверцетин показал низкий уровень токсичности, позволил добиться сравнительно низких потерь ДСИП в процессе модифицирования матрицы, способствовал более плавной кинетике выхода ДСИП.
