Содержание к диссертации
Введение
1. Электрон-транспортная цепь
1.1 Окислительное фосфорилирование 8
1.2 Роль митохондрий и их структура 10
2. Структура NADH-CoQ-редуктазы
2.1 Место Комплекса І в дыхательной цепи, перенос электронов и протонов. 12
2.2 Состав и структура прокариотических и эукариотических дегидрогеназ 16
2.3 Характеристика FeS кластеров Комплекса I 24
2.4 Филогения Комплекса I 28
2.5 Биогенез Комплекса I 30
3. Каталитическая активность NADH — дегидрогеназы
3.1 Каталитические свойства NADH-CoQ-редуктазы, 32
3.2 Ингибиторы NADH-CoQ-редуктазы 40
3.3 Механизмы переноса электронов и протонов 43
3.4 Роль железо-серных кластеров и FMN в механизме катализа Комплекса I 46
4. Нарушения Комплекса I и связанные с ними болезни 47
4.1. Энцефаломиопатии 48
4.2. Заболевания, связанные с изменениями в митохондриальном геноме (генетические изменения) 49
4.3 Митохондрии и гипоксия 54
2 Материалы и методы
1. Выделение митохондрий из сердца быка .57
2. Получение митохондриальных частиц 58
3. Измерение ферментативной активности59
4. Фотохимические опыты,., 60
5. Флуориметрический анализ .62
6. Эксклюзионная хроматография 62
7. Полярография .62
8. Электрофоретические методы 63
9. Определение концентрации белков 63
3 Результаты и их обсуждение
1. Сравнительное изучение NADH-дегидрогеназной и NADH активности митохондрий. ...64
1.1. Окисление NADH в суспензии митохондрий 65
1.2. Действие ионного детергента на препараты митохондрий 72
1.3. Получение оптически прозрачных митохондриальных фракций 75
2. Роль флавина, убихинона и железо-серных кластеров в переносе
электронов на искусственные и природные акцепторы 80
2.1. Роль флавина в передаче электронов в Комплексе 1 81
2.1.1. Деструкция флавинов при облучении синим светом 81
2.1.2. Влияние деструкции флавина на скорость окисления NADH митохондриями 84
2.1.3. Динамика спонтанного изменения флавиновой флуоресценции митохондриальной суспензии 87
2.2. оль железо-серных кластеров в переносе электронов . 89
2.3. Лаг-период в митохондриальных редокс реакциях NADH-ДХФИФ .91
2.4. Роль коэнзима Q в шунтировании реакций окисления NADH в митохондриях 98
2.5. Влияние цитохрома с на NADH-оксидазную реакцию 99
4 Заключение 102
5 Выводы 106
6 Список литературы 107
- Роль митохондрий и их структура
- Состав и структура прокариотических и эукариотических дегидрогеназ
- Роль железо-серных кластеров и FMN в механизме катализа Комплекса I
- Заболевания, связанные с изменениями в митохондриальном геноме (генетические изменения)
Введение к работе
Актуальность темы НАДН:убихинон (НАДН:Ко(5) - оксидоредуктаза или НАДН-дегидрогеназа является ключевым ферментом электрон-транспортной цепи митохондрий. Общепринятое название: комплекс I. Фермент катализирует ротенон-чувствительное окисление НАДН и восстановление убихинона, а также сопряженный с синтезом АТФ перенос протонов через мембрану.
НАДН + Н*+ Q -+4Н-И <--> НАД* + QH2 + 4Н*,«
Фермент представляет собой сложный белковый комплекс из 46 различных субъединиц и содержит шесть железо-серных кластеров, нековалентно связанный флавинмононуклеотид (ФМН) и убихинон. В настоящее время на молекулярном уровне не известны ни точный путь электронов между НАДН и убихиноном, ни механизм переноса протонов.
При изучении свойств этого комплекса широко используются искусственные акцепторы электронов. При этом предполагается, что в передаче электронов с НАДН на искусственные акцепторы участвуют все редокс-компоненты комплекса І, в соответствии с их окислительно-восстановительным потенциалом: ФМН, железо-серные кластеры, убихинон. Однако разность редокс потенциалов есть необходимое, но не достаточное условие реализации указанного пути. Мы обратили внимание на тот факт, что скорость окисления НАДН искусственными акцепторами на порядок выше, чем окисление "НАДН с участием убихинона дыхательной цепи. Известно также, что для реконструкции НАДН:феррицианид- редуктазной активности достаточно трех субъединиц комплекса (51, 30 и 20 кДа). Поэтому возникает вопрос: все ли редокс центры (ФМН, железо-серные кластеры и убихинон) задействованы в случае окисления НАДН искусственными акцепторами?
Цель работы Основной целью настоящей работы являлось изучение механизмов переноса электрона с НАДН:убихинон-оксидоредуктазы на искусственные акцепторы: феррицианид, пара-нитротетразолиевый фиолетовый (п-НТФ), дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ), а также на природные акцепторы: убихинон и цитохром С. Задачи исследования
I. Разработать метод получения препаратов оптически прозрачных
нативных митохондриальных фракций для спектроскопических
исследований.
II. Изучить роль флавина, убихинона и железо-серных кластеров в
переносе электронов на искусственные и природные акцепторы.
Научная новизна Впервые к данному объекту был применен метод
фотообесцвечивания (photobleaching) и получены результаты,
позволяющие уточнить механизм переноса электрона от НАДН на
искусственные и природные акцепторы. Показано, что перенос электронов
на искусственные акцепторы является «шунтом» в дыхательной цепи. В
качестве природных участников таких реакций могут выступать коэнзим Q
и цитохром С, шунтирующие перенос электронов между первым и
четвертым пунктами дыхательной цепи. Методологической новизной
данной работы является разработка процедуры получения фракции малых
митохондриальных частиц, пригодных для дальнейших
спектроскопических исследований.
Практическая значимость работы Обычно при выделении комплекса I степень его нативности оценивается в первую очередь по НАДН: феррицианид-редуктазной активности. Однако высокая активность с искусственными акцепторами не может служить показателем нативности выделенного фермента, а является скорее показателем того, что имеется поврежденный фермент или фрагменты фермента. Предложенные в настоящей работе методы быстрого измерения каталитической активности
комплекса I могут быть адаптированы к условиям клинического применения для определения дефицитных состояний дыхательной цепи (как наследственных, так и приобретенных).
Апробация работы По результатам исследований опубликовано 8 работ, из них 4 статьи. Материалы диссертации были доложены: На IV Пущинской конференции молодых ученых, (1999), на международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), на школе-конференции молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на Всероссийском рабочем совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001), на V Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (2001), на семинарах в вагенингенском Университете (Голландия, 2001) и в Центре клеточной и молекулярной генетики Университета Лион I им. Клода Бернара (Виллербан, Франция, 2003).
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит^Зтаблиц и рисунков. Список цитированной литературы содержит J9S ссылок, из которых 2на русском, аі%на английском языке. Диссертация изложена на {{^страницах. Список сокращений: АТФ - аденозинтрифосфат; ДХФИФ - 2,6 -дихлорфенолиндофенол; НАДН - никотинамид динуклеотид восставновленный; п-НТФ - пара-нитротетразолиевый фиолетовый; Fe-S -железо-серные кластеры; ФМН - флавинмононуклеотид; Р - поляризация флуоресценции, Q. - убихинон, SDS - додецилсульфат натрия.
В работе использованы следующие реактивы: НАДН, НАДФН, НАД* и НАДФ+ ("Reanal"), ДТТ, ЭДТА, ЭГТА, SDS и трисоксиметиламинометан ("Meik"), ФМН, ротенон и антимицин A ("Serva"), спектрально чистый глицерин ("Kodak"), убихинон ("Sigma"), амитал, феррицианид, сукцинат калия, хлористый калий и фосфорнокислый калий (х.ч.), сахароза (о.с.ч.).
Митохондрии выделяли из сердца быка или печени крысы, основываясь на стандартном методе. Для измерения активности НАДН-дегидрогеназы суспензию митохондрий (0,1 - 0,25 мг белка / мл) вносили в гипотоническую среду инкубации (20 мМ Трис-фосфатный буфер, рН 7,5 -8,0), добавляли 150-200 мкМ НАДН и 50-150 мкМ акцептора. Указанные концентрации являлись насыщающими. Измерения производились в кварцевых 1-см кюветах по изменению оптической плотности НАДН при 340 нм, феррицианида при 410 нм, ДХФИФ при 600 нм, формазана п-НТФ при 550 нм, цитохрома С при 530 нм в специальном отсеке для мутных образцов спектрофотометра "Specord М-40" («Цейс»). Флуоресценцию измеряли на «Perkin-Elmer MPF44" и "SLM-4800" (США). Значения поляризации флуоресценции определяли на 530 нм (при возбуждении 450 нм), со щелями монохроматоров 10 нм. Потребление кислорода в суспензии митохондрий проводилось полярографическим методом с помощью кларковского электрода. Концентрацию белка определяли экспресс-методом [Векшин, 1988]. Для проведения фотохимических опытов кюветы помещались в термостатируемый при 14С металлический держатель с фронтальным окном и задним зеркалом. Освещение флавинов протомитохондрий (или в контроле - свободного флавина в воде) линией 436 нм ртутной лампы СВД-120А через светофильтр СЗС-8 и тепловой фильтр - раствор сернокислой меди - проводили в течение 1-60 минут, отбирая пробы по ходу облучения для последующих измерений.
Малые нативные митохондриальные частицы (0,2 мкм) получали следующим образом: 80 мкл суспензии митохондрий разбавляли в 2 мл гипотонического буфера (50 мМ Трис, рН 7,5), инкубировали 2-3 мин. и фильтровали через 0,2-мкм фильтр FP 030/3 Einmal-Filterhalter ("Schleicher & Schuell") или Millex-GV ("Millipore"). Затем фотометрировали белок при 280 нм, флуориметрировали флавин при 520 нм (возбуждение - 450 нм) и измеряли активность фильтрата.
Роль митохондрий и их структура
Митохондрии являются клеточными органеллами, выполняющими функцию синтеза АТР, то есть образования энергии для обеспечения практически всех функций организма. Наличие собственной ДНК и системы белкового синтеза, а также наличие двойной мембранной организации, делает гипотезу симбиотического происхождения митохондрий общепринятой (Fridovich., 1974).
В последнее время показано, что процессы транспорта ионов и поддержания ионного гомеостаза в клетке также являются одной из существенных функций митохондрий.
Митохондрии являются основными силовыми станциями живых тканей. Естественно, нарушения в митохондриях приводят к существенным сдвигам в процессах энергообразования и транспорта ионов, что проявляется в тяжелых заболеваниях. В патологический процесс при этом вовлекаются в основном нейромышечные системы, требующие для своей работы большое количество энергии.
Система окислительного фосфорилирования эукариот находится во внутренней мембране митохондрий, которая состоит из 70% белка и 30% липидов. Липиды в основном представлены фосфотидилхолином (-40%), фосфотидилэтаноламином ( 35%) и кардиолипином (-15%). В митохондриях сердца быка около 50% белков внутренней мембраны являются белками, участвующими в системе окислительного фосфорилирования. (Hatefi, 1985).
При изучении митохондриальной NADH-дегидрогеназы традиционно используются препараты митохондрий, субмитохондриальных частиц (СМЧ) и изолированный Комплекс I. Однако каждый из этих препаратов имеет свои границы применения. Нами был предложен экспресс-метод получения нативных малых митохондриальных частиц с помощью фильтрования суспензии через миллипоровые фильтры. Полученные таким способом митохондриальные частицы размером менее 0,2 мкм - протомитохондрии -имеют полную активную дыхательную цепь. В нашей лаборатории было показано (Шишмаков и др., 2004) сходство протомитохондрии и митохондрий по таким показателям как дыхание, активность дегидрогеназ, фосфорилирование ADP, состав белков, наличие ДНК, содержание цитохромов, NADH и флавинов.
Преимуществами спектральной работы с данной фракцией является то, что она оптически прозрачна, почти не рассеивает свет; при этом дыхательная цепь сохраняет свою нативную структуру. Не смотря на то, что в последнее десятилетие были опубликованы обзоры, аккумулирующие значительные успехи в исследованиях Комплекса I (Ohnishi, 1993; Brandt, 1998), новые исследования ставят, зачастую, больше вопросов, чем дают ответов. По этой причине необходим современный анализ новых данных по Комплексу I, важный как для исследователей в области фундаментальной науки, так и для врачей, работающих в клинической области.
Комплекс I является названием для NADH-убихинон оксидоредуктазы митохондриальной дыхательной цепи млекопитающих. В более широком смысле он используется как обобщающее название для семейства NADH-хинон оксидоредуктаз, которое включает ферменты бактерий и даже Na+-переносящие ферменты, обнаруженные в некоторых организмах. NADH дегидрогеназа или КАБН:КоС -оксидоредуктаза (Е.С. 1.6.99.3) - является ключевым ферментом дыхательной цепи митохондрий. Фермент катализирует ротенон-зависимое восстановление убихинона (или его аналогов), а также сопряженный с транспортом электронов направленный перенос протонов через мембрану.
В 1961 году Комплекс I был выделен первый раз из митохондрий сердца быка (Hatefi et ai, 1961). В течение последующих лет в этой области был достигнут значительный прогресс, и на сегодняшний день накоплен большой объем информации о структуре и механизмах взаимодействия комплексов окислительного фосфорилирования. В отличие от Комплекса I, знания о структурах и функциях других комплексов значительно расширились после получения их в кристалличесом виде. Рисунок 2 иллюстрирует имеющуюся в литературе информацию о структуре индивидуальных систем окислительного фосфорилирования. Единственным большим недостатком этой схемы является лишь схематическое изображение структуры Комплекса I, поскольку данные кристаллографических исследований по нему отсутствуют. Известно только, что Комплекс I имеет L-образную форму и содержит мембранный домен и периферическое плечо, выступающее в матрикс митохондрии (Hofhaus et al, 1991; Guenebaut et at, 1998; Grigorieff, 1998). Таким образом, в настоящий момент, мы можем представить себе его в качестве "большого L-образного черного ящика".
Несмотря на кажущееся отсутствие существенного прогресса в исследовании Комплекса I, интерес исследователей к этой теме не ослабевает. Трудность изучения Комплекса I может быть объяснена, во первых, сложностью его структуры. Если еще недавно считалось, что фермент млекопитающих состоит из 42 различных субъединиц (Skehel et ah, 1998), то в настоящий момент открыта уже 46-я субъединица (Carroll, 2002). Даже бактериальные комплексы, считающиеся простыми, состоят из 13 или 14 субъединиц (Yagi, 1993). Многие исследователи, включая работающих в областях далеких от биоэнергетики, понимают важность исследования Комплекса I. Число работ, связанных с Комплексом I неуклонно растет с каждым годом. Историю развития исследования Комплекса I можно разделить на несколько этапов; первый начался с сообщения о выделении Комплекса I (Hatefl et ah, 1961). Начало второго этапа ознаменовано доказательством протон-переносящей функции Комплекса I, что является одним из краеугольных камней биоэнергетики (Ragan, Racker, 1973). Это открытие подвигло многих ученых к изучению механизма функционирования первого пункта сопряжения. Для биоэнергетики в узком смысле слова основная нерешенная проблема применительно к Комплексу I - механизм электрохимического сопряжения. Принимая во внимание стехиометрию векторного переноса протонов (4Н+ на 2е) (Galkin et ah, 1999) следует считать, что Комплекс I либо содержит две классические Митчелловские петли редокс реакций, либо фермент работает как редокс-зависимый протонный насос; либо, наконец, реализуется смешанный механизм: насос и петля. До сих пор многочисленные схемы механизмов, предложенные различными группами, остаются только рабочими гипотезами (приложение 1) Многое должно проясниться после установления полной структуры комплекса с достаточно хорошим разрешением.
Третьей значительной вехой в изучении Комплекса I стало открытие в середине 80-х годов семи генов в mtDNA, кодирующих субъединицы Комплекса I (Chomyn et al, 1985). Вскоре после этого появилось первое сообщение о митохондриальных болезнях, связанных с дефектом в генах, кодирующих субъединицы Комплекса I (Wallace et ai, 1988). Таким образом, к концу 80-х годов было закончено выявление основных характеристик Комплекса I, который становится популярным объектом для широкого круга исследователей разных специальностей. Рост публикаций в начале 90-х годов определялся в основном исследованиями генетических заболеваний, связанных с Комплексом I, а затем - исследованиями апоптоза. В тоже время энзиматические исследования Комплекса I были менее интенсивны. Чтобы разобраться со свойствами L-образного «черного ящика», необходимы или новые подходы к его исследованию в нативных мембранах или корректные методы разборки его на более мелкие, доступные для исследователя, «кирпичики».
Состав и структура прокариотических и эукариотических дегидрогеназ
В сравнении с другими ферментативными системами дыхательной цепи, Комплекс I - самый сложный и наименее изученный компонент цепи. Для NADH-дегидрогеназы до сих пор не получено исчерпывающих рентгеноструктурных данных, не известны достоверно ни расстояния между редокс-центрами, ни последовательность переноса электрона, ни структура мест связывания субстрата и акцептора, ни расстояние от них до редокс-центров. Изучение подобных протон-транслоцирующих структур млекопитающих (Fearnley, Walker, 1992), грибов (Weiss, Friedrich, 1991) и прокариот (Yagi, 1993) показало исключительную сложность этого фермента.
Благодаря успешному применению молекулярно-биологических подходов и использованию масс-спектрометрии пептидов в настоящее время определены аминокислотные последовательности всех известных субъединиц Комплекса I митохондрий сердца быка и 28 субъединиц Комплекса 1 N. Crassa (Duarte et al, 1997; Dupuis et al, 1998; Ton et al, 1998; Yagi et al, 1998). Аминокислотная последовательность субъединиц бактериальных ферментов стала известной после расшифровки структур оперонов бактерий Paracoccus denitrificans, Е. coli, Thermus thermophilus и Rhodobacter capsulatus, кодирующих NDH-1 (Приложение 2). Для всех субъединиц Комплекса I сердца быка, кодируемых митохондриальным геномом, найдены гомологи у фермента из N. crassa, а также у всех бактериальных препаратов Комплекса 1 (Tuschen et al, 1990; Duarte et al, 1997; Yano, 1997; Yano et al, 1997, 1999; Dupuis et al, 1998; Ton et al, 1998; Yagi et al, 1998). Бактериальный Комплекс I обычно состоит из 14 различных субъединиц и работает как NADH-дегидрогеназа. Митохондриальный Комплекс I состоит, в дополнении к гомологам этих 14 субъединиц, по крайней мере, из 28 дополнительных субъединиц, которые сами непосредственно не участвуют в переносе электронов и протонов
Прокариотический и эукариотический комплексы различны по размеру, но в то же время, имеют одинаковую форму и одинаковое распределение простетических групп (Guenebaut et al, 1998). «Минимальный фермент» состоит из семи периферических субъединиц, формирующих сайты связывания, NADH, FMN и до девяти Fe-S кластеров и семи мембранных субъединиц (Friedrich et al, 1995). Функции последних полностью не ясны, за исключением одной, ответственной за связывание убихинона (Friedrich et al, 1990). Субъединицы образуют L-образную структуру. Периферическое плечо расположено перпендикулярно мембранному (Hofhaus et al, 1991). У прокариот Комплекс I представлен «минимальным ферментом», у эукариот необходимы дополнительные субъединицы (Walker, 1992). До сих пор недостаточно известно о функциях дополнительных субъединиц. Функциональные свойства известны только для некоторых. Так, 39/40-kDa субъединица связывает NADPH и эволюционно связана с семейством редуктаз/изомераз (Fearnley, Walker, 1992; Schulte et al, 1998). В состав эукариотического комплекса входит ацил-переносящая субъединица гомологичная прокариотическому ацил-переносящему белку с фосфопантотеновой группой (Runswick et al, 1991; Sackmann et al, 1991). Обе субъединицы участвуют в биогенезе Комплекса I эукариот (Yagi et ah, 1998).
Проблема белкового состава NADH-CoQ-редуктазы до сих пор не решена. Комплекс I может содержать до 45 полипептидов, общая масса комплекса оказывается порядка 900 кДа (Ragan, 1980; Ragan et al, 1982 a,b). Число субъединиц, составляющих эукариотический Комплекс I колеблется у разных авторов от 40 (Grigorieff, 1999) до 45 субъединиц (Buchnan, Walker, 1996), 7 из которых кодируется митохондриальной ДНК, а остальная, большая часть - ядерной ДНК (Walker, 1992). У Neurospora crassa - 35 субъединиц (Kotlyar et al,, 1998; Videira, 1998). Комплекс содержит, по разным данным, от 6 до 8 различных Fe-S кластеров и одну молекулу FMN, как простетические группы. Соотношение FMN:Fe:S 1:22-24:22-24. Содержание FMN в комплексе варьирует от 1.0 до 1.4 нмоль/мг белка. Содержание KoQ варьирует в зависимости от способа выделения комплекса. Состав и соотношение фосфолипидов аналогичен общему составу внутренней мембраны митохондрий (Hatefi, 1985).
При обсуждении вопроса о принадлежности того или иного полипептида такому гигантскому образованию как Комплекс I всегда возникает некоторая неопределенность. Очевидно, что на такой вопрос можно было бы ответить с помощью «простого» опыта: если удаление некоторой субъединицы или ее замена дефектной копией с помощью приемов молекулярной генетики приводит к потере какой-либо активности фермента, которая может затем быть восстановлена реконструкцией, такой результат однозначно свидетельствовал бы о том, что эта субъединица -компонент Комплекса I. К сожалению, для фермента млекопитающих таких данных ни для одной субъединицы не получено, а результаты молекулярно-генетических манипуляций с ферментами дрожжей и прокариот весьма фрагментарны и в большинстве случаев приводят к дефектам сборки фермента (Приложение 3).
По данным электронной микроскопии (Приложение 4) и эукариотические, и прокариотические комплексы состоят из двух частей -мембранной и периферической (Bockema et al, 1984; Walker et al, 1995; Rogan, 1985; Leonard et al, 1987; Hofhaus et al, 1991; Brandt, 1997; Guenebaut et al, 1997; Guenebaut et al, 1998; Degli Esposti, 1998; Videira, 1998; Grigorieff, 1999; Djafarzadeha et al, 2000; Bottcher et al, 2002).
Роль железо-серных кластеров и FMN в механизме катализа Комплекса I
Восстановительные потенциалы железосерных кластеров были приведены выше (см. таблицу 2). Потенциал FMN составляет -340 mV (Blankenhorn, 1976). Промежуточный восстановительный потенциал NADH (-150 mV) между NAD+ (-320 mV) и убихиноном (+60 mV) позволяют предположить, что один протон переносится через мембрану во время переноса электрона с NADH на N2, а второй протонный перенос связан с электронным переносом от N2 до убихинона. Восстановительный потенциал центров Nla (-370 mV) и N2 (-150 mV) составляет 60 mV/pH и позволяет предположить, что эти редокс центры могут играть роль в протонном переносе (Ingledew, Ohnishi, 1980). В экспериментах с N. crassa, в условиях, когда гриб обрабатывается с помощью хлорамфеникола, ингибируется белковый синтез митохондрий, и гриб продуцирует уменьшенную форму Комплекса I, лишенную мембран-связанных субъединиц. Эта малая форма катализирует перенос электронов с NADH на убихинон, но не содержит N2 кластер (Friedrich et aL, 1989). Предполагается, что N2 кластер участвует в магнитном взаимодействии с убисемихиноном в мембрансвязанном субкомплексе (Schultz, Chan, 2001). Но все же можно констатировать недостаточность знаний о роли конкретных Fe-S кластеров. Загадкой остается необходимость такого количества кластеров в Комплексе I. Исследования последних лет показали, что структурные и функциональные нарушения Комплекса I вызывают или, по крайней мере, играют важную роль в развитии многих заболеваний человека. Эти болезни включают болезнь Паркинсона, дистонии, болезнь Хантингтона, оптическую наследственную нейропатию Лебера и другие. Данные о таких болезнях обобщены в таблице 5. Дисфункция Комплекса I может приводить к: (1) нарушению способности дыхательной цепи окислять NADH до NAD; (2) нарушению способности Комплекса I осуществлять сопряженный перенос протона, и как результат - падение уровня синтеза АТР митохондриями; (3) продукции супероксид-радикалов.
Нарушения в работе комплекса приводят к серьезным сдвигам в процессах митохондриального энергообразования, что может вызвать такие заболевания как энцефаломиопатии (Schapira, 1998; Singer, 1987; Robinson et al, 1998; Wallace, 1999). Указанный ферментный комплекс и его отдельные субъединицы участвуют в развитии клеточного апоптоза (Скулачев, 1998). Также комплекс играет важную роль в NADH-индуцированном образовании супероксида (Krishnamoorthy et al. 1988, Melov et ah 1999a,b), в перекисном окислении липидов (Glinn et al, 1997) и транспорте ионов, что проявляется в тяжелых заболеваниях. Нарушения работы Комплекса I характерны для старения организма (Genova et al., 1997; Lenaz et ah, 1997). В патологический процесс при этом вовлекаются в основном нейромышечные системы, требующие для своей работы большое количество энергии. В последнее время знания об этих заболеваниях быстро прогрессируют. При митохондриальных патологиях возникают специфические клинические, гистологические и биохимические проявления. Часто можно наблюдать морфологические изменения в митохондриях мышц. Быстрое развитие данных о митохондриальных заболеваниях стало возможным благодаря современным методам исследования (гистохимическим, иммунохимическим, гибридизации in situ и др.). Теперь появилась возможность выделять митохондрии всего из 50 мг ткани для исследования их функции, очистки ферментов, белкового анализа с использованием антител. То есть, биологи имеют сейчас инструменты для выяснения молекулярных дефектов при этих заболеваниях. Все это необходимо для эффективной терапии. Энцефаломиопатии характеризуются четырьмя типами проявлений: морфологическими, клиническими, биохимическими и генетическими. Ниже остановимся подробнее на каждом из этих проявлений. Одних морфологических критериев не достаточно для того, чтобы поставить диагноз миопатии, тем более сказать какая форма миопатии у больного. Прежде всего потому, что подобные изменения могут наблюдаться у больных с различными биохимическими дефектами и кроме того, у одного и того же больного может наблюдаться различный характер изменений в митохондриях. В основном при этом отмечаются поражение мышечной и нервной системы, так как они требуют высокое энергообеспечение, что делает эти ткани уязвимыми к митохондриальной дисфункции. Почти все митохондриальные энцефалопатии имеют общие клинические симптомы. 1) В мышцах: офтальмоплегия (нарушение функции глазных мышц), невозможность переносить мышечные нагрузки, общая слабость, истощение. 2) В мозге: атаксия (расстройства координации), деградация ретиналя, глухота, умственная отсталость, слепота, спазмы в мышцах, припадки. 3) В сердце: сердечный блок, кардиомиопатическая гипертрофия. 4) В эндокринной системе: бесплодие, диабеты, гипопаратиреоз. Комбинации вышеперечисленных симптомов указывают на нарушения в митохондриях. К сожалению, нет специфических синдромов, так как различная клиническая картина может сопровождаться одними и теми же биохимическими дефектами и наоборот, одна и та же клиническая картина может быть результатом различных биохимических нарушений. Большинство из заболеваний, характеризующихся дефицитом Комплекса 1, связаны со снижением ферментативной активности белков, входящих в этот комплекс. Недостаточность Комплекса 1 может быть парциальной или мультисистемной и может быть связана как с уменьшением синтеза, так и с увеличением распада комплекса. При недостаточности данного комплекса происходит нарушение окисления NADH, что приводит к развитию лактат - ацидоза.
Заболевания, связанные с изменениями в митохондриальном геноме (генетические изменения)
Митохондриальные болезни интересно изучать с генетической точки зрения, так как некоторые из них наследуются по материнской линии, то есть не-менделевским способом. Хотя большинство митохондриальных белков кодируются в ядерной ДНК, жизненно важные белки кодируются в митохондриальной ДНК. Структура митохондриальной ДНК человека в настоящее время полностью расшифрована. Это кольцевая ДНК, состоящая из 2-х цепей - тяжелой, на которой кодируются в основном все белки и РНК, и легкая цепь. Она имеет свой, отличный от ядерной, генетический код с несколькими кодонами и не содержит некодирующие области - интроны. 13 белков кодируются этой ДНК (7 - Комплекса I, 1 - комплекса III, 3 -комплекса IV и 2-комплекса V). Кроме того, митохондриальная ДНК кодирует т-РНК необходимую для транскрибции. Скорость мутации митохондриальной ДНК в 5-10 раз выше, чем ядерной. Это свойство, а также тот факт, что ДНК плотно упакована (без интронов, свободных участков) приводит к появлению большого количества нежелательных мутаций, что приводит к большой вероятности развития заболеваний. Наблюдается несколько типов необычных характеристик.
Так как в формировании зиготы всех митохондрий участвует яйцеклетка, наследование митоховдриальных белков идет по материнской линии. Поэтому только мать передает митохондриальные заболевания, причем детям обоих полов. Вероятность заболевания детей при этом очень высокая и близка к 100%. Поэтому в большинстве случаев митохондриальной энцефалопатии и эпилепсии наблюдается передача заболевания по материнской линии (Carelli et at, 1997, 1999; Swerdlow et at, SjFeillet a/., 1999). В случае изменений в белках, кодируемых в ядре, болезнь может передаваться и по отцовской линии.
Знания о митохондриальных энцефаломиопатиях в настоящее время быстро расширяются. Клинические морфологические и биохимические обследования больных приводят к большему пониманию патофизиологии и рациональной классификации этих болезней. Это помогает лечить больных. Молекулярная биология позволяет ставить правильные диагнозы и выяснять реальные взаимоотношения между ядерной и митохондриальной ДНК при различных заболеваниях. Болезни, связанные с повреждениями Комплекса I, генетические или вызванные химическими агентами (отметим, что детергенты, буквально окружающие нас в виде многочисленных моющих средств - специфические и высокоэффективные ингибиторы Комплекса I), по-видимому, можно лечить, искусственно заменяя фермент (Taivassalo et ah, 1999). При ряде заболеваний, таких как атеросклероз, миокардит и другие наблюдаются разного рода изменения в снабжении органов кровью, что приводит зачастую к кислородному голоданию этих тканей или к гипоксии (Barja, Herrero, 1998). При этом происходят изменения в митохондриях. Показано накопление в митохондриях Н2О2 и снижение отношения восстановленного глютатиона к окисленному. Накопление перекиси приводит к увеличению переокисления липидов в мембранах митохондрий, что приводит к нестабильности мембран и, как следствие, к дисфункции митохондрий.
Один из механизмов повреждения мембраны при переокислении может быть появление неспецифической поры, что приводит к гибели митохондрий. Появление неспецифической поры может быть связано с резким увеличением концентрации кальция в митохондриях. До тех пор пока не был обнаружен специфический ингибитор кальций-индуцируемой поры, ей не придавали большого значения и считали, что это артефакт (и может наблюдаться лишь in vitro). В настоящее время уже найдены состояния, когда эта пора активируется in vivo. Обнаружено это было, например, на культуре гепатоцитов, подвергнутых окислительному стрессу. Таким образом, изучение биохимических и биофизических аспектов механизма функционирования Комплекса I необходимо не только для понимания фундаментальных проблем биоэнергетики эукариотической клетки, но и является основой для создания новых терапевтических подходов при лечении широкого спектра тяжелых заболеваний человека.
Похожие диссертации на Шунтирование переноса электронов с митохондриальной НАДН-дегидрогеназы на природные и искусственные акцепторы
