Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Структура, физико-химические и функциональные свойства гемоглобина 19
1.1. Структура молекулы гемоглобина 19
1.2. Спектральные характеристики гемоглобина 28
1.3. Связыванием перенос л игаидов гемоглобином 33
1.4. Структур но-функциональные особенности некоторых лигандных форм гемоглобина 42
1.4.1. Структурные особенности и некоторые физико-химические свойства метгемоглобина 42
1.4.2. Особенности структуры и физико-химических свойств карбоксигемоглобина 45
1.5. Функциональные свойства молекул гемоглобина с различным субъединичиым составом 47
1.6. Структурная организация эритроцитарной мембраны ..53
1.7. Цнтозольная и мембраносвязанная формы внутриэритроцнтариого гемоглобина 57
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 61
2.1. Объекты исследования 61
2.2. Получение суспензии отмытых эритроцитов 61
2.3. Получение теней эритроцитов 61
2.4. Получение растворов оксигемоглобииа 62
2.5. Получение растворов метгемоглобина 63
2.6. Получение растворов карбоксигемоглобина 64
2.7. Получение димеров гемоглобина различного состава 64
2.8. Формирование гибридов валентности 64
2.9. Образование молекул полигемоглобина 65
2.10. Образование поперечных сшивок между молекулами полигемоглобина, супероксиддисмутазы и каталазы 65
2.11. Регистрация спектров поглощения в УФ- и видимой областях 65
2.12. Регистрация спектров пропускания в ИК-области 66
2.13. Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина 66
2.14. Определение величины константы Хилла 69
2.15. Определение процентного содержания лигадных форм гемоглобина в растворе 70
2.16. Хроматографическое фракционирование на КМ-целлюлозе 70
2.17. Регистрация спектров фотофлуоресценции 71
2.18. Определение каталазной активности растворов гемоглобина 74
2.19. Определение пероксидазной активности растворов гемоглобина 75
2.20. Определение супероксиддисмутаз но и активности 76
2.21. Неэнзиматическое определение содержания фосфатов 77
2.22. Регистрация кривых термоденатурационного плавления гемоглобина в его растворах 80
2.23. Проведение сеансов АУФОК-терапии 82
2.24. УФ-облучение растворов гемоглобина и суспензии эритроцитов 82
2.25. Определение количества ионогенных групп в белковой макромолекуле методом кислотно-основного титрования 84
2.26. Вычисление спектра буферной емкости белка. 87
2.27. Статистическая обработка результатов экспериментов 88
ГЛАВА 3. Изучение кислородсвязывлющих свойств различных структурных форм гемоглобина 89
3.1. Изучение кислородсвязывагощих свойств растворов гемоглобина человека 89
3.2. Изучение кислородсвязывающих свойств гемоглобина в составе эритроцитарных клеток 89
3.3. Исследование кислородсвязывающих свойств мембраносвязанного гемоглобина 92
3.4. Исследование кислородсвязывающих свойств гибридов валентности гемоглобина 93
3.5. Исследование кислородсвязывающих свойств образцов гемоглобина, содержащих димеры различного состава 101
3.6. Исследование кислородсвязывающих свойств образцов полигемоглобина 104
3.7. Исследование кислородсвязывающей способности молекул полигемоглобина содержащих метгемоглобин 107
3.8. Исследование кислородсвязывающей способности молекул полигемоглобина, содержащих карбокси гемоглобин 109
ГЛАВА 4. Изучение влияния уф-излучения (240—390 нм) на кислородсвязывающие свойства различных структурных форм гемоглобина 111
4.1. Влияние УФ-излучения на кислородсвязывающую способность растворов гемоглобина человека 111
4.2. Влияние УФ-света на кислородсвязывающие свойства внутриэритроцитарного гемоглобина 118
4.3. Изучение функциональных свойств фотомодифицированного мембраносвязанного гемоглобина 125
4.4. Изучение УФ-чувствительности тотальных димеров гемоглобина 127
4.5. Исследование УФ-чувствительности частично диссоциированных образцов гемоглобина 128
4.6. Изучение УФ-чувствительности гибридов валентности гемоглобина 129
4.7. Изучение УФ-чувствительности молекул полигемоглобина 132
ГЛАВА 5. Изучение кислородсвязывающих свойств гемоглобина, модифицированного интегральным уф-излучением и серотонином 135
5.1. Влияние серотонина на кислородтранспортные свойства растворов гемоглобина 135
5.2. Кислородсвязывающие свойства гемоглобина, подвергнутого сочетанному воздействию УФ-излучения и серотонина 143
5.3. Изучение кислородсвязывающих свойств тотальных димеров гемоглобина, УФ-облученных в присутствии серотонина 151
5.4. Изучение кислородсвязывающих свойств частично диссоциированных молекул гемоглобина, УФ-облученных в присутствии серотонина 152
5.5. Исследование УФ-чувствительности модифицированных серотонином гибридных молекул гемоглобина 156
5.6. Исследование кислородсвязывающих свойств полигемоглобина, УФ-облученного в присутствии серотонина 160
ГЛАВА 6. Влияние длинноволнового уф-излучения (300-400 нм) на структурно-функциональные свойства гемоглобина 163
6.1. Влияние ДУФ-света на спектральные свойства гемоглобина 163
6.2. Влияние ДУФ-света на кислородевязывающую функцию тетрамеров гемоглобина 167
6.3. Влияние ДУФ-света на кислородсвязывающие свойства гемоглобина с измененной структурой субъединичных контактов 170
6.4. Влияние ДУФ-света на спектральные свойства гемоглобина человека в присутствии серотонина 174
6.5. Кислородсвязывающие свойства гемоглобина, подвергнутого воздействию ДУФ-света в присутствии серотонина 175
6.6. Исследование термодинамических параметров молекул гемоглобина, ДУФ-облученных в свободном состоянии и в присутствии серотонина 177
ГЛАВА 7. Изучение динамики основных лигандных форм гемоглобина в растворе и в составе эритроцитарной клетки после воздействия уф-излучения 180
7.1. Влияние интегрального потока УФ-света на содержание основных лигандныхформ гемоглобина в растворе 180
7.2. Влияние длинноволнового УФ-света на содержание основных лигандныхформ гемоглобина в растворе 188
7.3. Исследование фоторезистентности эритроцитов , 191
7.4. Исследование процентного содержания лигандных форм гемоглобина, полученных из супернатанта УФ-облученных эритроцитов 193
7.5. Исследование процентного содержания лигандных форм гемоглобина, полученных из гематокрита УФ-облученных эритроцитов .198
ГЛАВА 8. Исследование сочетанного влияния карнозина и уф-излучения на структурно функциональные свойства гемоглобина 204
8.1. Кислород связывающие свойства растворов гемоглобина в присутствии карнозина 204
6.1. Кислородсвязывающие свойства растворов гемоглобина, УФ-облученного в присутствии карнозина 210
8.1. Изучение функциональных свойств внутриэритроцитарного гемоглобина, модифицированного карнозином 213
8.2. Кислородсвязывающие свойства внутриэритроцитарного гемоглобина, подвергнутого воздействию УФ-света в присутствии карнозина 213
8.3. Влияние карнозина на содержание лигандных форм гемоглобина в растворе 218
8.4. Исследование сочетанного влияния интегрального потока УФ-излучения и карнозина на содержание лигандных форм гемоглобина в растворе 220
8.5. Исследование сочетанного влияния ДУФ-излучения и карнозина на содержание лигандных форм гемоглобина в растворе 229
8.6. Исследование физико-химического состояния комплекса гемоглобин-карнозин методом сканирующей микрокалориметрии 234
ГЛАВА 9. Исследование структурных перестроек в молекулах гемоглобина при формировании комплекса с серотонином 237
9.1. Исследование флуоресцентных свойств растворов серотонина 237
9.2. Изучение флуоресцентных свойств комплекса гемоглобин-серотоиин 239
9.3. Исследование ИК-спектров образцов гемоглобин-серотонин 243
9.4. Влияние серотонина на содержание лигандных форм гемоглобина в растворе 246
9.5. Определение типов химических реакций между гемоглобином и серотонином 247
9.6. Зависимость механизма формирования комплекса гемоглобин-серотонин от концентрации и структурного состояния биогенного амина 251
9.7. Изучение сочетанного влияния интегрального потока УФ-излучения (240—400 нм) и серотонина на содержание лигандных форм гемоглобина в растворе 257
9.8. Изучение сочетаніїого влияния ДУФ-излучения (300—400 нм) и серотонина на содержание лигандных форм гемоглобина в растворе 260
ГЛАВА 10. Изучение роли сульфгидрильных групп в фотомодификации функциональных свойств гемоглобина 268
10.1.Влияние иодацетамида на кислородтранспортную функцию гемоглобина 268
10.2.Изучсние фоточувствителыюсти гемоглобина в присутствии иодацетамида , 273
10.3. Кислородтранспортные свойства гемоглобина крови больных бронхиальной астмой до и после применения АУФОК-терапии 278
10.4. Исследование содержания 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах крови доноров и больных бронхиальной астмой после АУФОК-терапии 283
ГЛАВА 11. Структурно-функциональные свойства уф-облученных полифункциональных ассоциатов гемоглобина 287
11.1. Исследование каталазной активности различных 287
11.2. Изучение псроксидазной активности различных структурных форм гемоглобина 289
11.3. УФ-чувствитсльность молекул полигемоглобина, связанных поперечными сшивками с молекулами супероксиддисмутазы 291
11.4. УФ-чувствителыюсть молекул полигемоглобина, связанных поперечными сшивками с молекулами каталазы 300
Заключение 305
Выводы 318
Список литературы 321
- Спектральные характеристики гемоглобина
- Получение растворов карбоксигемоглобина
- Изучение кислородсвязывающих свойств гемоглобина в составе эритроцитарных клеток
- Исследование кислородсвязывающих свойств образцов полигемоглобина
Введение к работе
Актуальность проблемы, Исследование закономерностей и механизмов функционирования биосистем различных уровней организации является, несомненно, главной задачей для всех дисциплин биологического профиля. Решение ее позволит целенаправленно влиять на протекание биохимических и физиологических процессов, усиливая благоприятные и нивелируя нежелательные из них.
Ключевая роль в функционировании организмов отводится биополимерам в силу разнообразия функций, выполняемых ими, и на уровне которых реализуется любое воздействие на организм или на его отдельные системы. По существующим в настоящее время представлениям (Ч. Кантор, П. Шим-мел, 1985), белки являются тактическим материалом, реализующим стратегические возможности, заложенные в нуклеиновых кислотах. Следовательно, для объяснения тех макроэффектов, которые мы непосредственно наблюдаем при действии различных факторов среды на организм, необходимо рассматривать их влияние на молекулярный уровень организации живой материи, и, прежде всего, на белковые структуры. Особую важность при этом имеют белки крови, т.к. именно они выступают в роли агентов, ответственных за объединение различных органов и систем организма.
Наибольший удельный вес всех белковых компонентов крови, как плазменных, так и эритроцитарных, составляют белки, осуществляющие транспорт различных низкомолекулярных лигандов. Жизненные функции человека и животных, направленные на поддержание гомеостаза, являются, в конечном итоге, транспортными функциями.
Среди транспортных белков более всего изучен гемоглобин, выполняющий в организме человека и животных функцию обратимого связывания кислорода и переноса его к местам потребления.
Гемоглобин как объект исследования имеет целый ряд преимуществ. К настоящему времени для него полностью идентифицированы первичная
структура и взаимное расположение атомов в молекуле. Специфические особенности структурной организации этого гембелка для различных видов животных позволяют проанализировать зависимость его функциональных свойств от последовательности расположения аминокислотных остатков в макромолекуле. На примере гемоглобина можно проследить роль отдельных компонентов (белкового и неорганического) в ходе ответной реакции на воздействие физико-химических факторов и их взаимовлияние друг на друга. Одновременно данный белок является удобной моделью для изучения влияния различных агентов на ферменты, поскольку его простетическую группу — гем — можно рассматривать как аналог активного центра. Приведенные факты в совокупности с легкостью получения предопределили неослабевающий интерес исследователей к гемоглобину как объекту исследований. Поэтому не случайно опубликовано большое количество работ, посвященных анализу структурно-функциональных свойств этого гембелка в условиях различного микроокружения (Л.А. Блюменфельд, 1957; П. А. Коржуев, 1964; Л.И. Иржак, 1975; M.F, Pemtz, 1976; В.Г. Артюхов, 1995).
Вместе с тем до настоящего времени наименее разработанными остаются вопросы функционирования белков, обладающих четвертичной структурой. Олигомерная организация молекулы гемоглобина дает возможность оценивать роль субъединичных контактов в проявлении функциональной активности макромолекулы в целом, в ответной реакции макромолекулы на воздействие внешних факторов. Несомненно, такого рода исследования важны сточки зрения теоретической биофизики.
С целью развития представлений по указанной проблеме нами были проведены комплексные исследования по изучению влияния УФ-света широкого спектрального состава и некоторых природных антиоксидантов на кон-формационный статус и функциональные свойства различных структурных форм гемоглобина.
Важность изучения воздействия использованного физического агента на белковые системы обусловлена рядом причин. В силу того, что УФ-излу-
чение является естественным экологическим фактором, организмы находятся под его постоянным влиянием. Это, вероятно, сыграло определяющую роль и в самом появлении, и в эволюционном развитии живых существ (А.И. Опарин, 1957; М.В. Волькенштейн, 1965; Р. Уэйн, 1991), Необходимость адаптации к нему проявляется и в условиях непосредственной жизнедеятельности индивидуальных организмов, что стало особенно актуально в связи с проблемами разрушения озонового слоя Земли — естественного защитного экрана от проникновения коротко— и средневолнового УФ-света, развитием современных технологических процессов, активным освоением космического пространства. Поэтому неудивительно, что влияние указанного агента на структуру белков достаточно полно изучено (В.Г. Артюхов, 1995). Накопленный экспериментальный материал и идентификация хромофоров, поглощающих энергию излучения, создают предпосылки для соотнесения проявляемых функциональных свойств с вполне определенными конформа-ционными перестройками биомакромолекул.
Наиболее важным среди экологических факторов является длинноволновое УФ-излучение (ДУФ) с Я=300—400 нм. Однако исследования в данной области не получили широкого развития и известны лишь единичные работы, посвященные анализу структурно-функциональных свойств биологических систем после его воздействия. Так, до настоящего времени остается неясным вопрос о природе хромофоров гемоглобина, ответственных за поглощение света в названном диапазоне длин волн, а также о роли их модификации в проявлении гембелком своей функциональной активности. Исходя из вышеизложенного, значительная часть наших исследований была направлена на изучение структурно-функциональных свойств гемоглобина человека, подвергнутого воздействию длинноволнового УФ-света (300—400 нм) в условиях различного микроокружения.
В связи с тем, что в ряде случаев возникает необходимость защиты организмов от действия УФ-излучения, особую актуальность приобретают вопросы разработки ее теоретических и практических основ, а также поиск
эффективных химических соединений, выступающих в роли протекторов. Этой тематике посвящен также ряд разделов настоящей диссертационной работы.
Решение указанных проблем имеет и важное практическое значение, прежде всего для медицины. В частности, в последние годы широкое развитие в клинической практике получил метод аутогемотрансфузии УФ-облу-ченной крови (АУФОК). Несмотря на положительный эффект, который дает указанный метод при лечении и профилактике целого ряда заболеваний (абсцессы, бронхиальная астма, воспалительные процессы, облитерирующие заболевания конечностей и др.), до настоящего времени мало исследованным остается вопрос о механизмах, лежащих в основе его благоприятного действия на организм. Важной на сегодняшний день является и разработка эффективных кровезаменителей на основе химически модифицированного гемоглобина (Н.П. Кузнецова и соавт., 1996; S. Hiromi et al., 1996), что обусловлено ограниченными сроками хранения и недостаточными объемами донорской крови. Однако внедрение таких соединений невозможно без активного исследования их структурно-функциональных свойств в условиях различного м икр о окружения.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение роли субъединичных контактов в проявлении структурно-функциональных свойств гемоглобина в условиях различного микроокружения.
Задачи работы предусматривали:
Оценку уровня кислородсвязывающей активности различных структурных форм гемоглобина, различающихся по степени взаимодействия между субъединицами.
Изучение влияния интегрального и длинноволнового УФ-излучения на структурно-функциональные свойства различных образцов гемоглобина.
Исследование влияния природных антиоксидантов — серотонина и карнозина — на уровень проявления функциональных свойств различных структурных форм гемоглобина.
Исследование сочетанного действия УФ-света различного спектрального состава и названных антиоксидантоп на уровень функциональной активности, проявляемой различными структурными формами гемоглобина.
Изучение эффективности и молекулярных механизмов антиоксидантного действия серотонина и карнозина при фотомодифнкации белковых систем.
Выявление корелляционной взаимосвязи между структурными изменениями, индуцированными воздействием УФ-квантов, и проявлением модифицированным белком функциональных свойств.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу вопросов взаимосвязи между структурным состоянием и функциональной активностью молекул гемоглобина. Впервые изучено влияние УФ-света на положение кривых диссоциации различных структурных форм оксигемоглобина и степень гем-гемового взаимодействия субъединиц, отражением которых являются величина константы Хилла и значение давления полу насыщения молекулы гемоглобина кислородом. Доказано, что одним из основных механизмов ответной реакции тетрамерных молекул гемоглобина на воздействие интегрального потока УФ-излучения является накопление димерных форм. Получены доказательства, подтверждающие локализацию хромофоров, ответственных за поглощение энергии ДУФ-све-та с ^тах~ 342 им. На основании анализа кислородсвязывающих и спектральных свойств растворов гемоглобина, облученных длинноволновым ультрафиолетовым излучением, показана возможность миграции «волны кон-формационных изменений» с хромофора на апобелок. Установлены молекулярные механизмы фотопротекторного действия серотонина и карнозина по отношению к гембелку. Выявлены участки глобина, ответственные за комплексообразование с указанными антиоксидантами. Оценены антиок-сидантные свойства различных структурных форм гембелка, в том числе и его полифункциональных ассоциатов с каталазой и супероксиддисмутазой. Продемонстрирована важная роль олигомерной организации макромолеку-
лы в уровне проявления собственных каталазной и пероксидазной активностей гембелка.
Практическая значимості.. Полученные результаты вскрывают первичные механизмы ответной реакции белковых систем на воздействие УФ-све-та, расширяют представление о молекулярных процессах, лежащих в основе лечебного эффекта метода АУФОК. Эксперименты с использованием эффективных природных фото протекторов (серотонин, карнозин) позволяют разработать практические основы избирательной фотозащиты отдельных компонентов системы крови. Результаты, полученные с использованием химически модифицированного гемоглобина (полигемоглобина), следует учитывать при разработке искусственных кровезаменителей.
Экспериментальные данные могут быть полезны при обсуждении вопросов молекулярной и экологической биофизики, прогнозирования поведения белковых систем в условиях экологической нагрузки, в частности, при повышенном уровне УФ-радиации.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных конференциях и симпозиумах: «International organic substances solvent extraction conference» (Voronezh, 1992), «Транспорт кислорода и антиоксидантные системы» (Гродно, 1993), «Эндогенные интоксикации» (Санкт-Петербург, 1994), «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1995, 1998), «Антенно-фидерные устройства. Системы и средства радиосвязи» (Воронеж, 1995, 1997), «Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах» (Москва—Суздаль, 1995), «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды» (Томск, 1995), «Urban ecology» (Rostov-on-Don, 1995), «Molecular order and mobility in polymer systems» (Saint-Petersburg, 1996), «Mathematical models of non-linear excitation, transport, dynamics, control in condenced systems and other mediums» (Tver, 1996), «Кислород и свободные радикалы» (Гродно, 1996), «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 1997), «Биооксидант» (Москва, 1998); на Всесоюзных и Всероссийских конферен-
циях: «Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии» (Воронеж, 1991), «Кислотно-основной и температурный гомеостаз» (Сыктывкар, 1994; 1997), «Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов» (Воронеж, 1996), «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 1996); на I и II Съездах украинского биофизического общества (Киев, 1994; Харьков, 1998), на XII и XIII Международных конгрессах по фотобиологии (Vienna, 1996; Saint-Francisco, 2000), на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1996), на Международном экологическом конгрессе (Voronezh, 1996), на II и III Всероссийских съездах фотобиологов (Пущино, 1998; Воронеж, 2001), на съездах Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова (Ростов-на-Дону, 1998; Казань, 2002), на Международной школе «Проблемы теоретической биофизики» (Москва, 1998), на II съезде биофизиков России (Москва, 1999), на II Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2000), на VII Международной конференции по химии и физико-химии олигомеров (Пермь, 2000), на 3-й региональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Воронеж, 1995), на научно-практической конференция «Актуальные вопросы скорой медицинской помощи — реальность и перспективы» (Воронеж, 1996), на совещании-семинаре заведующих кафедрами биофизики и преподавателей, читающих курс «Биофизика» (Воронеж, 1996), на региональной конференции «Реализация региональных научно-технических программ Центрально-Черноземного региона» (Воронеж, 1996), на X межреспубликанской научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» (Краснодар, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 1 коллективная монография, 35 статей, 39 тезисов.
Па защиту выносятся следующие положения:
-УФ-излучение (240—400 им) индуцирует модификацию областей кон-
тактов димеров типа аР\
Структура хромофора гемоглобина, ответственного за поглощение ДУФ-излучения сХтах=342 нм, представляет собой, по-видимому, комплекс «имидазол дистального гистиднна - кислород - центральный атом железа гема»;
Серотонин оказывает фотопротекторное действие по отношению к кислородтранспортной способности структурных форм гемоглобина, имеющих тетрамерную организацию;
Молекулярные механизмы комплексообразования ссротонина и кар-нозина с гемоглобином, а также схемы возможных при этом химических реакций, осуществляющихся в области контактов димеров типа а{3\
Механизм антиоксидантного действия серотонина и карнозина по отношению к кислороде вяз ываю щей способности гемоглобина, обусловленный конкурентным акцептированием свобод но рад и кал ьных продуктов за счет реакций имидазолыюй и аминной групп;
Выдвинутая и схематически представленная концепция о роли контактов димеров типа а/Зп регулировании функциональной активности гемоглобина в условиях различного микроокружения.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 347 страниц машинописного текста, 8 таблиц, 118 рисунков. Состоит из введения, 11 глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 284 работы, из них 146 отечественных и 138 зарубежных.
Спектральные характеристики гемоглобина
Несмотря на развитие новых современных физических методик и их применение в биофизике и биохимии, оптическая спектрофотометрия остается одним из самых эффективных методов изучения растворов гемопротеидов. Наиболее существенные результаты по исследованию электронной структу ры гембелков получены с использованием именно этого метода (Ю.С. Ма-нойлов, 1977), так как он является основным при изучении различного рода превращений биополимеров и позволяет исследовать способность молекул поглощать и трансформировать энергию света, лежащую в основе многих, прежде всего фотобиологических, процессов.
Особенно полезным при анализе как структурных, так и функциональных свойств макромолекул оказалось использование методов, в основе которых лежит регистрация их электронных спектров поглощения, с помощью которых можно проследить изменения, происходящие в молекуле или ее составных частях при действии различных физико-химических факторов. Как белок гемоглобин в УФ-области спектра имеет две полосы поглощения с максимумами при 220 и 275 нм, обусловленные наличием его составе остатков ароматических аминокислот (триптофан, тирозин, фенилала-нин). Коротковолновая полоса поглощения белка обладает высокой интенсивностью. Полоса поглощения с Хтах=275 нм обусловлена поглощением энергии квантов -электронами ароматических аминокислот белковой части молекулы гемоглобина. В зависимости от источника получения гем-белка и от конформационного состояния глобина положение и интенсивность указанных полос поглощения могут в значительной степени изменяться (М. Вейсблут, 1969; В.Г. Артюхов и др., 1980). За поглощение света в видимой области спектра ответственна порфирино-вая часть макромолекулы, однако, в настоящее время вопрос об отнесении отдельных полос поглощения не решен окончательно (J .В. Wittenberg et al., 1970), поскольку на них сильное влияние оказывают спиновое состояние системы и наличие лигандов с различным лигандным полем (табл. 3).
Все порфиринсодер-жащие соединения имеют систему сопряженных двойных связей, играющую роль хромофора и обусловливающую интенсивные полосы поглощения в видимой и близкой ультрафиолетовой областях спектра. я-Электроны двойных связей включены в общую сопряженную систему порфиринового кольца. В нее не входят двойные связи двух пиррольных колец, которые называются «полуизолированными». Волновые функции тс-электронов последних только перекрываются волновыми функциями я-электронов кольца (В.Г. Артгохов и др., 1994). пе симметрии D4h (Л. А. Блюменфельд, 1957), для которой в соответствии с правилом отбора разрешены переходы в возбужденные состояния ец, расщепленные на два уровня: b2u и b3u. В этом случае полосы в видимой части спектра принадлежат замкнутой оболочке порфирина (G. Goutermann, 1961). Характерными для оксигенированной формы гемоглобина полосами поглощения в видимой области спектра являются полосы с тах при 412 (полоса Соре), 542 (Р-полоса) и 576 нм (а-полоса). Интенсивность двух последних полос значительно меньше интенсивности полосы Соре. Молярный коэффициент экстинкции (s) для а-полосы равен (15-15,5)х103 лхмоль"]хсм-1, для В-полосы 8=(14,2-15,2)х103 лхмоль 1хсм , а для полосы Соре е=(125-130)х103 лхмоль_1хсм-1 (Л.А. Блюменфельд, 1957). Между а- и В-полосами находится минимум при 560 нм. В-Полоса более широкая, чем а-полоса (П.А. Коржуев, 1964). Полоса Соре отражает пе Здесь и далее — значения коэффициентов поглощения и расчитанные концентрации приведены в пересчете на одну субъединицу реходы типа 7Г-7Г порфиринового кольца и частично типа переноса заряда. Низкоспиновые полосы 542 и 576 нм иногда относят к синглет-трип-летным переходам. Кроме того, в спектре поглощения оксигемоглобина присутствует полоса с тах=342 нм, обусловленная особенностями желе-зопорфирина (В.П Артюхов и др., 1980). Простетическая группа и соединенные с ней группы глобина представляют собой структуру с симметрией типа октаэдра (СЕ. Манойлов, 1968; Д.М. Рифкинд, 1978). Валентные d-орбитали металла, находящегося в молекуле в октаэдрическом окружении, расщепляются на два подуровня. Подуровень, более высокий по энергии, обозначается как е и включает две d-орбитали (dx2_y2 и dz2), которые играют ведущую роль во взаимодействии с атомами по а-типу. Три d-орбитали в подуровне Ь (dxy, d , d ) из-за их пространственной ориентации могут принимать участие только в я-взаимо-действии и вследствие этого имеют более низкую энергию, чем е -орбитали. Расщепление на уровни е и „ называется расщеплением в октаэдрическом поле окружающих атомов и обозначается 10D или Аокт.
Если 10D относительно мало, то шесть валентных d-электронов распространяются на подуровни U ие с образованием максимальной спино-вой мультиплетности в соответствии с правилом Гунда (высокоспиновый комплекс). Если 10D больше, чем энергия спаривания электронов на t2g-орбиталях, то все шесть электронов будут оставаться на подуровне и (низ-коспиновый комплекс). На каждой из вырожденных разрыхляющих орбиталей кислорода имеется по одному не спарен ному электрону. Оксигепирование гемоглобина дает диамагнитный низкоспиновый комплекс, в котором все d-электроны железа расположены на t -орбиталях. Дезоксигемоглобин с четырьмя неспаренными электронами находится в высокоспиновом парамагнитном состоянии. Пя-тикоординационный дезоксигемоглобин не имеет октаэдрической конфигурации.
Получение растворов карбоксигемоглобина
Метгемоглобин в экспериментах получали в результате окисления исходного раствора оксигемоглобина 2 %-ным раствором феррицианида калия (К3 [Fe(CN)6j) (В.Г. Артюхов, 1995). Избыток реагента удаляли методом гель-хроматографии на сефадексе G-25. Образование метформы гемоглобина контролировали по известному для нее спектру поглощения в видимой области спектра, который характеризуется коротковолновым сдвигом полосы Соре в область 405-407 нм, атакже максимумами поглощения при 500 и 630 нм. Концентрацию метгемоглобина определяли спектрофотометрически (Б.Ф. Сухомлинов и др., 1988):4є где [MtHb] — концентрация метгемоглобина, моль/л; 500—оптическая плотность исследуемого образца при длине волны излучения 500 нм; є—милли-молярный коэффициент экстинкции, равный 8,87x10"2 лхмоль-1хсм ; 4 — коэффициент пересчета от одного гема на тетрамер Карбоксигемоглобин получали барбатацией через раствор оксиформы гембелка моноксида углерода, выделяющегося в ходе реакции взаимодействия муравьиной кислоты с концентрированной серной кислотой. Степень взаимоперехода лигандных форм гембелка контролировали спектрофотомет-рически на основании регистрации электронных спектров поглощения образцов в видимом диапазоне длин волн.
В концентрированных солевых растворах с большой ионной силой и при большом разбавлении гемоглобин может диссоциировать на димеры. Образование димеров окси- и метгемоглобина вызывали раствором NaCl концентрацией 2 моль/л. Из-за наличия восьми солевых связей в молекуле дезоксигемоглобина ее диссоциации на димеры добиться сложнее. Для создания условий, в которых гемоглобин находился бы в виде димера как в лигандированпой, так и в нелигандированной форме использовался раствор KI концентрацией 2 моль/л (Д.М Рифкинд, 1978).Димерные фракции очищали методом гель-хроматографии на сефадек-се G-75 («Pharmacia», Швеция) на колонке размером 30x2,5 см с использованием в качестве элюирующего раствора 0,1 моль/л Na-фосфатного буфера (рН 7,4). Для определения величины кажущейся молекулярной массы гемоглобина пользовались формулой (Г. Детерман, 1970):где М — молекулярная масса (Да), Ve — объем выхода белка (мл), VQ — свободный объем (мл).
Растворы димерных молекул окси- и метформ гемоглобина смешивали в соотношении компонентов 2:3. С целью образования тетрамеров концент рацию образца увеличивали диализом против двадцатикратного объема 2 моль/л раствора хлорида натрия, приготовленного на основе 0,1 моль/л Na-фосфатного буфера с рН 7,4. Диализ проводился в течение 1 ч.К раствору оксигемоглобина добавляли глутаровый альдегид в соотношении компонентов 1:16, Образцы инкубировали 3,5 часа при 4 С (F. D Agnillo, T.M.S. Chang, 1998). Молекулы полигемоглобина очищали методом гель-хроматографии на колонке размером 30x2,5 см, упакованной сефа-дексом G-200 («Pharmacia», Швеция). В качестве элюирующего раствора использовали 0,1 моль/л Na-фосфатный буфер (рН 7,4). Величину кажущейся молекулярной Nfaccbi определяли с помощью формулы (Г. Детерман, 1970):где М — молекулярная масса (Да), Ve — объем выхода белка (мл), VQ — свободный объем (мл).
К раствору гемоглобина добавляли глутаровый альдегид (соотношение молекул 1:16) и растворы ферментов (соотношение 5 молекул PolyHb : 1 молекула фермента). Образцы инкубировали в течение 3,5 ч при 4 С (F. D Agnillo, T.M.S. Chang, 1998).Спектры поглощения исследуемых образцов регистрировали на спектрофотометрах СФ-26 и СФ—46 в диапазоне длин волн 230—360 и 360— 680 нм через 5 нм, а в области максимумов поглощения инкремент уменьшали до I нм.
Анализируемые образцы высушивали в термостате при 36 С в течение 18 ч. Для анализа использовали таблетки, приготовленные методом прессования с избытком КВг, предварительно просушенным при 150 С в течение 24 ч. Масса наполнителя для навески составляла 18 мг, исследуемого образца— 0,5 мг. Смесь КВг и изучаемого препарата подвергали измельчению на вибраторе фон Ардена в течение 4 мин. Полученную порошкообразную смесь массой 2 мг использовали для приготовления таблетки. Далее осуществляли вакуумирование пресс-формы до давления 133 Па в течение 2 мин и производили 5-минутное прессование ручным прессом с усилием 600 МПа. Полученные таблетки хранили на открытом воздухе не более 15 мин. Во время приготовления таблеток и регистрации ИК-спектров относительная влажность воздуха в лаборатории не превышала 75 %.
Регистрацию ИК-спектров пропускания осуществляли на спектрофотометре «Specord М-80» в диапазонах 4000-400 см-1 и 1600-1300 см-1. Интервал между точками измерения составлял 4 см"1, время интегрирования измерения каждой точки— 1 иЗ с соответственно. Определение соотношения максимумов поглощения проводили в полосе амид I на частотах 1685, 1656, 1650, 1630 см-1, в полосе амид И — на 1550, 1535, 1516 см 1. Время измерения значений оптической плотности на вышеуказанных частотах соответствовало 60 с.Для работы нами использовался спектрофотометрический метод регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина, описанный О.Б. Столяр и соавт. (О.Б. Столяр и соавт., 1979) и основанный на различиях в спектрах поглощения дезокси- и оксиформ гемоглобина в видимом диапазоне длин волн (см. разд. 1.2).Регистрация КДО осуществлялась на установке, изготовленной на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета (рис. 10),
Изучение кислородсвязывающих свойств гемоглобина в составе эритроцитарных клеток
Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина (КДО) является методом, позволяющим получить ценную информацию о структурно-функциональном состоянии гембелка. Поэтому данный метод нашел широкое применение в различных областях биологии и медицины. Важнейшими макровеличинами, которыми чаще всего характеризуют процесс обратимого связывания гемоглобином кислорода, являются значения Р50, т.е. парциальное давление кислорода, при котором белок насыщен лигандом на 50 %, и константа Хилла (а), отражающая степень гем-гемово-го взаимодействия субъединиц в олигомере. С целью установления кислородсвязывающих свойств растворов гемоглобина мы зарегистрировали их кривые диссоциации в Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Как следует из данных, представленных на рис. 15, кислородсвя-зывающая способность гемоглобина в растворе характеризуется величиной Р50, равной 17,6 ± 0,7 мм.рт.ст.. При этом константа Хилла составляет 2,46 ± 0,09. Следовательно, зарегистрированные нами КДО соответствуют описанным в литературе (П.А. Коржуев, 1964; Г.А. Рябов, 1988). Приводимые в литературе результаты исследований по изучению структурно-функциональных свойств гемоглобина были получены, в основном, с применением его растворов (модельных систем). Это позволило получить важную информацию о взаимосвязи конформационных изменений молекул гембелка и проявления ими своей функциональной активности.
Однако в крови млекопитающих гемоглобин локализован в эритроци-тарных клетках. Известно, что в этих условиях белок существует в двух функционально различимых формах: мембраносвязанной и цитозольной (см. раздел 1.7). Во многом уровень проявления функциональной активности гем-белка определяется специфическими внутриклеточными условиями микроокружения его молекул. Следовательно, кислородтранспортные свойства крови определяются состоянием эритроцита как целостной системы. Регистрация КДО в составе клеток имеет как большое теоретическое, так и практическое значение, поскольку позволяет определять вклад каждого из белковых компонентов, эритроцитарной мембраны, а также процессов, участвующих в изменении конформационного статуса молекул гемоглобина в механизм воздействия различных факторов на систему транспорта кислорода в организме. Кроме того, значительный интерес представляет выявление кислородсвязы-вающих свойств каждой из форм внутриклеточного гемоглобина. Исходя из вышеизложенного, следующей задачей нашей работы явилось изучение интегральной кислородсвязывающей активности гемоглобина в составе эритроцитов.
Для этого в экспериментах использовали суспензии эритроцитов в Na-фосфатном буфере, содержащем 0,15 моль/л NaCl. Анализ данных, представленных на рис. 15, показывает, что гемоглобин в составе эритроцитарной клетки обладает пониженным сродством к кислороду по сравнению с растворами гембелка, на что указывает сдвиг КДО вправо, в область больших значений парциального давления кислорода. Значение Р50 при этом составляет 25,7 ± 0,9 мм рт.ст., однако, величина константы Хилла существенно не изменяется по сравнению с растворами гембелка (а = 2,41 ± 0,10). Эти результаты также находятся в хорошем соответствии с литературными данными (СА. Рябов, 1988). Можно заключить, что изменение уровня обратимой оксигенации гемоглобина в клетке определяется суммой факторов, обеспечивающих функционирование эритроцита как изолированной системы. В первую очередь, это связано с активной ролью в регуляции газообмена эритроцитарной мембраны (втом числе и за счет связанной с мембраной фор мы гемоглобина),- а также определенными условиями внутриклеточной среды эритроцита (например, присутствие 2,3-ДФГ, иных метаболитов, ионный состав и др.). Вопросы о механизмах связывания гемоглобина с мембраной и роли этого процесса в оптимальном снабжении тканей организма кислородом до сих пор остаются дискуссионными и малоизученными. Как отмечалось ранее (разд. 1.7), существует представление о том, что иммобилизованный на мембране гембелок незначительно отличается по основным макроскопическим характеристикам кислородсвязывающей активности (величинам давления полунасыщения лигандом и константы Хилла) от водных растворов. С целью выявления кислородсвязывающей способности мембраносвя-занной формы гемоглобина нами были зарегистрированы ее сатурационные кривые. Для этого использовали суспензии теней эритроцитов, содержащих гемоглобин («розовые тени»), в Na-фосфатном буфере, содержащем ОД 5 моль/л NaCl (рН 7,4). Данные, представленные на рис. 15, подтверждают, что КДО для растворов гембелка и суспензий мембраносвязанного гемоглобина близки и существенно отличаются по положению от таковых, зарегистрированных для эритроцитов в целом. Значение Р50 для мембраносвязанного гембелка в наших исследованиях составляет 15,9 ± 0,6 мм рт.ст..
Однако обращает на себя внимание факт некоторого снижения величины а по сравнению как с растворами, так и с эритроцитарными клетками — до 2,21 ± 0,05. По-видимому, это может быть объяснено снижением уровня конформационной подвижности молекул гемоглобина при иммобилизации на мембране и, как следствие, затруднением структурных перестроек, необходимых для осуществления кооперативного взаимодействия субъединиц в составе олигомера. В крови здорового человека постоянно образуется метгемоглобин, содержание которого в норме незначительно по сравнению с общим количеством гембелка(Т.С. Истаманова, 1973; И.Е. Ганелина, К. А. Самойлова, 1986). Однако при недостаточной активности восстанавливающих ферментных систем эритроцитов либо в результате превышения их функциональных возможностей при попадании в организм больших доз некоторых токсических агентов, являющихся метгемоглобинообразователями, содержание ферриге-моглобина может существенно повышаться (Б.Ф.Сухомлинов и соавт., 1988). Метформа гембелка может образовываться и при действии на биообъекты внешних физических факторов, в частности таких, как, например, у-ради-ация (Z, Szweda-Lewandowska etal., 1981; W. Duda, 1983) или УФ-излучение (I. Schuberth, 1956, 1960; В.Г. Артюхов, 1983), при некоторых видах гемоглобинопатии (Р. Марри и др., 1993). Следовательно, присутствующие в крови in vivo различные лигандные формы гемоглобина функционируют в организме как единая интегрированная система, С другой стороны, в разд. 1.5 была показана возможность протекания процессов диссоциации-реассоциации молекул гемоглобина, что может приводить к формированию тетрамеров с различным валентным состоянием центрального атома железа («гибридов валентности»). Наличие таких структурных форм также будет вносить вклад в интегральные характеристики уровня кислородтранспортной активности образцов гембелка. Исходя из вышеизложенного, нами были изучены функциональные свойства оксигемоглобина в условиях повышенного содержания метгемоглобина. Как следует из данных, представленных на рис. 16, добавление к контрольному образцу НЬ02 метгемоглобина в концентрации 3x10 5 моль/л (объемное соотношение Hb02:MtHb составляло 3:1) не приводит к заметным изменениям сродства гемоглобина к кислороду. Величина Р50 в этом случае составляет 18,5 ± 1,9 мм рт.ст., однако, константа Хилла в данных
Исследование кислородсвязывающих свойств образцов полигемоглобина
В настоящее время весьма актуальной является проблема создания эффективных кровезаменителей. При этом необходимо предотвратить быстрое выведение кровезаменителя почками и их повреждение. В качестве одного из способов решения данной задачи было предложено использовать гемоглобин со значительно увеличенным размером модифицированных молекул (Н.П. Кузнецова и др., 1996; Т.М. Chang, 1998; 1999). То есть, для создания эффективных кровезаменителей может быть осуществлена полимеризация гемоглобина.
В качестве полимеризугошего агента обычно используют глутаровый альдегид (K.D. Vandegriff, Y.C. Le Tellier, 1994; A.I. Alayash et al., 2001; V. Budhiraja, J.D. Heliums, 2002), который связывается с молекулами гемоглобина без остатка при соотношении молекул реагент—белок до 16:1. Альде гидные группы глутарового альдегида реагируют в основном с е-аминог-руппами лизиновых остатков белка. Наиболее вероятным представляется образование глутаровым альдегидом связи с Lis82(p) (Е. Bucci et al., 1998; М.В. Johnson et al., 1998). Помимо внутри- и межмолекулярных связей (эффективная сшивка), из-за стерических затруднений некоторое количество молекул глутарового альдегида может присоединяться к гемоглобину только одной связью (неэффективная сшивка). Вместе с тем необходимо учитывать, что мономерная форма самого глутарового альдегида ОНС-(СН2)з-СНО неустойчива. В слабокислых растворах он существует в равновесии с гидрати-рованными линейными и циклическими формами. В нейтральных и слабощелочных растворах глутаровый альдегид способен образовывать оли-гомеры (в основном три- и пентамеры), несущие несколько альдегидных групп.
Явление полимеризации обнаружено и в естественных условиях для гемоглобина серповидных эритроцитов (С. Dong et al., 1992). Установлено, что молекулы оксигенированного гемоглобина серповидных эритроцитов могут осуществлять дополнительные межмолекулярные взаимодействия, отсутству-ющие у нормального гемоглобина. Количество дополнительных взаимодействий для аномального гемоглобина в клетках увеличивается по сравнению с растворами. Сопоставление этих результатов с данными о вязкости оксигенированного гемоглобина позволило сделать вывод о том, что при концентрациях, сравнимых с внутриклеточными значениями, молекулы оксигенированного гемоглобина серповидных эритроцитов образуют агрегаты размером в несколько тетрамеров. Дезоксигенированный гемоглобин серповидных эритроцитов также подвержен полимеризации (J.G. Louderback et al, 1999; М.Е. Yohe et al., 2000).
Зарегистрированные нами электронные спектры поглощения полигемоглобина характеризуются полосами с максимумами при тех же длинах волн, что и спектр оксигемоглобина (рис. 21). Величина кажущейся молекулярной массы полигемоглобина в ходе наших экспериментов составила 310,0 ± 0,3 кДа (рис. 22), т. е. при данной концентрации оке и гемоглобина образуются агрегаты, включающие в себя пять тетрамеров гембелка.
Кислородсвязывающие свойства растворов поли гемо глобин а характеризуются снижением значений давления полунасыщения и константы Хилла по сравнению с нативными тетрамерами: Р50= 14,9±0,3 мм ртхт., а=1,97±0,02. Обнаруженный факт свидетельствует о конформационных перестройках апо-белковой части молекулы гемоглобина при химической модификации.Обращает на себя внимание факт близости основных параметров функциональной активности полигемоглобина таковым, выявленным для мемб-раносвязанной формы гембелка. Можно предположить, что иммобилизация на мембране и химическая модификация глутаровым альдегидом имеют близкую природу и затрагивают сходные аминокислотные остатки. Это проявляется в аналогичных конформационных перестройках апобелка.
С целью выявления возможных нарушений, вызываемых в глобиновой части химически модифицированного гемоглобина, нами были исследованы структурно-функциональные свойства образцов, сформированных из различных форм гембелка, каждая из которых имеет собственную конформацию, обусловленную различиями лигандов (см. гл. 1).
Введение в полимеризуемую смесь метгемоглобина в объемном соотношении 3:2 приводит к изменению электронного спектра поглощения исследуемого образца: наряду с уменьшением интенсивности а- и р-полос оксиформы гембелка появляется новый максимум с A,max = 625 нм, характерный для кислых растворов MtHb.
При объемном соотношении в исходном растворе окси- и метгемоглобина 3:1 сатурационные кривые полученных молекул характеризуются повышенным сродством к кислороду и ослабленным кооперативным взаимодействием субъединиц по сравнению с таковыми для поли гемоглобина, Повышение содержания метгемоглобииа (соотношение НЬ02—MtHb 3:2) приводит к дальнейшим изменениям функциональных свойств полиме-ризованных молекул. Величина давления полунасыщения белка лигандом снижается до 8,4±0,6 мм рт.ст., а значение константы Хилла достоверно не изменяется и составляет 1,44±0,05. Анализ полученных результатов позволяет утверждать, что присутствие метформы в полимеризованнои молекуле гембелка индуцирует изменение конформации глобиновой части НЬ02, проявляющееся в усилении его сродства к кислороду. Снижение значений константы Хилла указывает на нарушение взаимодействия между гемами, вызываемое включением в общую систему взаимодействий молекулы MtHb. Нельзя также исключить, что присутствие метформы в полимере ускоряет процесс аутоокисления гемопротеида, модифицированного глутаровым альдегидом.полигемоглобина, содержащих карбоксигемоглобинВключение в ассоциат, наряду с оксигемоглобином, карбоксиформы (соотношение 3:2) не оказывает существенного влияния на спектральные характеристики образцов, которые остаются сходными со спектром поглощения полигемоглобина, сформированного из оксиформьг. При соотношении в полимеризуемом растворе НЬ02—НЬСО 3:1, как и в случае с использованием метгемоглобина, наблюдается смещение КДО исследуемых образцов влево по сравнению с образцами полигемоглобина, содержащими только оксиформу (табл. 4). Величины Р50 и а составляют 11,4±0,2 мм рт.ст. и 1,41 ±0,01 соответственно, что указывает на увеличение сродства полученных полимерных молекул к кислороду и уменьшение кооперативного взаимодействия субъединиц.
Увеличение содержания карбоксигемоглобина до соотношения НЬ02— НЬСО 3:2 приводит к дальнейшему снижению давления полунасыщения ли-гандом до 9,1 ±0,1 мм рт.ст. и константы Хилла до 1,44±0,01.Обращает на себя внимание тот факт, что основные параметры кисло-родсвязывающей способности молекул полнмернзованного гемоглобина, содержащих различные лигандные формы, соответствуют таковым для частично диссоциированного на димеры гембелка. По-видимому, присутствие в полимеризованных молекулах MtHb и НЬСО индуцирует конформационные перестройки, затрагивающие непосредственное белковое окружение гема и области субъединичных контактов. Это позволяет предположить, что в указанных условиях димеры НЬ02 функционируют как независимые структурные элементы кислородтранспортной системы.
