Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор данных литературы 13
1.1. Феномен апоптоза 13
1.2. Роль каспаз в механизмах апоптотической клеточной гибели 16
1.3. Роль каспазы-3 в нормальном развитии и функционировании мозга и при нейродегенеративных заболеваниях 18
1.4. Неапоптотическая роль каспазы-3 19
1.5. Неапоптотическая роль каспазы-3 в нервной системе 20
1.6. Предполагаемые механизмы участия каспазы-3 в нейропластичности 25
1.6.1. Калпаин - протеиназа, регулируемая каспазой-3 26
1.6.2. Каспаза-3 регулирует функции рецепторов 28
1.6.3. Компоненты трансдукции сипіала - субстраты каспазы-329
1.6.4. Белки цитоскелета - субстраты каспазы-3 35
1.6.5. Другие субстраты каспазы-3, участвующие в нейропластичности 38
1.6.6. Каспаза-3 в протеолитическом каскаде, вовлеченном в нейропластичность 39
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Материалы 41
2.2. Методы 41
2.2.1. Подготовка биологических образцов 41
2.2.2. Определение активности каспазы-3 42
2.2.3. Поиск оптимальных условий определения активности каспазы-3 в мозге 43
2.2.4. Определение концентрации белка 47
2.2.5. Исследование активности каспазы-3 у сусликов в разные стадии гибернационного цикла 47
2.2.6. Эксперимент по определению активности каспазы-3 в отделах мозга крыс двух инбредных линий - Fischer-344/N и WAG/G 48
2.2.7. Динамика изменения активности каспазы-3 в период раннего постнатального онтогенеза 48
2.2.8. Влияние экспериментального невроза на активность каспазы-3 в отделах мозга крыс 50
2.2.9. Активность каспазы-3 в культурах клеток крысиной нейробластомыВЮЗ 52
2.2.10. Влияние цитотоксического фрагмента р-амилоидного пептида и фактора некроза опухоли а на активность каспазы-3 в отделах мозга крыс 53
2.2.11. Статистическая обработка и анализ результатов 55
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 56
3.1.1. Изменение активности каспазы-3 в течение гибернационного цикла у якутских сусликов Citellus undulatus 56
3.1.2. Обсуждение результатов 59
3.2.1. Изменение активности каспазы-3 в период раннего постнатального онтогенеза 67
3.2.2. Обсуждение результатов 72
3.3.1. Активность каспазы-3 в отделах мозга инбредных линий крыс Fischer-344/N и WAG/G 76
3.3.2. Обсуждение результатов 79
3.4.1. Влияние экспериментального невроза на активность каспазы-3 в отделах мозга крыс 83
3.4.2. Обсуждение результатов 84
3.5.1. Активность каспазы-3 после введения цитотоксического фрагмента Р-амилоидного пептида и фактора некроза опухоли а в отделах мозга крыс 89
3.5.2. Обсуждение результатов 94
3.6.1. Активность каспазы-3 в культуре клеток после индукции дифференцировки 97
3.6.2. Обсуждение результатов 98
Заключение 105
Выводы 113
Литература 115
- Роль каспазы-3 в нормальном развитии и функционировании мозга и при нейродегенеративных заболеваниях
- Поиск оптимальных условий определения активности каспазы-3 в мозге
- Активность каспазы-3 в культурах клеток крысиной нейробластомыВЮЗ
- Влияние экспериментального невроза на активность каспазы-3 в отделах мозга крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы
Выяснение механизмов запрограммированной клеточной гибели -апоптоза - является одной из самых актуальных задач современной биологии. Понимание механизмов клеточной смерти должно обеспечить прорыв в лечении целого ряда тяжелых заболеваний, среди которых нейродегенеративные болезни и рак. Пристальное внимание ученых приковано к каскадам внутриклеточных биохимических реакций, запускаемых при апоптозе. Идентифицировано семейство протеаз, активирующихся при апоптозе и выполняющих ряд функций по инициации и реализации апоптотической программы (Earnshaw et al., 1999). Во многих случаях показано, что реализация программы клеточной гибели сопровождается активацией этих протеаз, названных каспазами, и, наоборот, активация каспаз приводит, как правило, к апоптозу (Thomberry, Lazebnik, 1998; Yuan, Yankner, 2000; Troy, Salvesen, 2002). Каспазы принято разделять на две группы - инициаторные, передающие сигнал к запуску апоптоза, и эффекторные, непосредственно разрушающие внутриклеточные белки (Hengartner, 2000).
Особенно важным является правильное выполнение апоптотической программы в головном мозге. Апоптоз необходим для правильного установления нейрональных связей при формировании мозга, а избыточный апоптоз, как принято считать, лежит в основе нейродегенеративных заболеваний. Каспаза-3 является основным эффектором внутриклеточной апоптотической программы в клетках головного мозга (Salvesen, 2002; Troy, Salvesen, 2002). Ишемическое повреждение или травма мозга вызывают активацию каспазы-3 (Namura, 1998; Clark et al., 1999). Мутация гена каспазы-3 приводит к смерти животного либо в эмбриогенезе, либо в раннем постнатальном онтогенезе (Kuida et al., 1996). Таким образом, общепринято представление о том, что каспаза-3 - основной «палач» клетки.
Однако в последнее время в различных лабораториях появляются свидетельства того, что каспаза-3 может выполнять ряд важных неапоптотических функций. В частности, в нейронах каспаза-3 принимает участие в нейропротекции при ишемическом прекондиционировании (McLaughlin et al., 2003). Каспаза-3 быстро активируется в ограниченных внутриклеточных компартментах при формировании конусов роста клеток сетчатки и необходима для установления правильных нейрональных связей (Campbell, Holt, 2003). Каспаза-3 расщепляет GluRl субъединицу глутаматного рецептора, сокращая таким способом кальциевый ток в клетку (Chan et al., 1999; Meyer et al., 2002). И, на первый взгляд неожиданно, ингибирование каспазы-3 блокирует долговременную потенциацию на срезах гиппокампа (Gulyaeva et al., 2003). Таким образом, процессы, в которых каспаза-3 принимает участие, могут иметь непосредственное отношение к феноменам нейропластичности.
Итак, можно предположить, что каспаза-3 не только необходима для реализации большинства сценариев апоптоза в головном мозге, но и принципиально важна для реализации важнейших неапоптотических процессов, без которых невозможно выживание и функционирование нейрона. Выявление «дополнительных» (с точки зрения сегодняшних представлений) функций основного апоптотического фермента головного мозга позволит лучше понять природу многих заболеваний, биохимическую основу формирования нервных цепей в онтогенезе, возможно, способствовать новым подходам к проблемам рака. Кроме того, выявление и неапоптотических, и апоптотических функций одновременно у одного фермента поможет лучше понять механизмы регуляции ферментативной активности, принципы «включения» и «выключения» ферментов, идентифицировать основных участников внутриклеточных каскадов, опосредующих апоптоз и нейропластичность одновременно. Иными словами, продемонстрировать плеиотропность каспазы-3 и понять адаптивные преимущества такой плейотропности для клетки и целого организма. Исследование роли каспазы-3 в нейропластических процессах позволит лучше понять основные принципы деятельности головного мозга.
Цель работы и основные задачи исследования
Основной целью работы было исследование активности каспазы-3 в различных отделах головного мозга животных в ситуациях, не связанных с апоптозом. Для этого были поставлены следующие задачи:
Исследовать активность каспазы-3 на разных стадиях гибернационного цикла сусликов.
Исследовать активность каспазы-3 в раннем постнатальном онтогенезе крыс в норме и после электроболевого стресса.
Исследовать активность каспазы-3 у крыс разных линий, различающихся по психофизиологическим характеристикам.
Исследовать активность каспазы-3 у крыс с экспериментальным неврозом.
Исследовать активность каспазы-3 при моделировании нейродегенерации у крыс в результате центрального введения 0-амилоидного пептида и фактора некроза опухоли а.
Исследовать активность каспазы-3 при дифференцировке нейроноподобных клеток в культуре под действием различных агентов.
Научная новизна
В работе впервые проведено систематическое исследование неапоптотической функции каспазы-3 в головном мозге и показана плейотропность функций данного фермента. Сформулировано представление об участии каспазы-3 в реализации нейропластичности.
Впервые показано, что активность каспазы-3 изменяется в некоторых отделах мозга сусликов на разных стадиях гибернациоиного цикла. Установлены различия активности каспазы-3 в отделах мозга крыс, различающихся по психофизиологическому статусу.
Продемонстрированы изменения активности каспазы-3 в гиппокампе крыс в период раннего постнатального онтогенеза, когда не происходит значимой апоптотической гибели нейронов, однако осуществляются перестройки синаптической пластичности.
Впервые показано, что экспериментальный невроз сопровождается снижением активности каспазы-3 в разных отделах мозга. На модели болезни Альцгеймера показано, что каспаза-3 играет двойственную роль и участвует в реализации как апоптотической, так и неиропротекторнои программ.
Впервые продемонстрировано, что каспаза-3 активируется при сАМР-зависимом сценарии дифференцировки нейроноподобных клеток.
Теоретическая и практическая ценность
В работе выявлена важная, но до сих пор не исследованная, неапоптотическая функция каспазы-3 в мозге. Установление плейотропности каспазы-3 (один и тот же фермент работает и при клеточной гибели, и при реализации неапоптотических программ) способствует пониманию общих, фундаментальных процессов, лежащих в основе апоптоза и нейропластичности. Результаты нашей работы подтверждают, что активность протеолитических ферментов в клетке тонко регулируется, и это позволяет каспазе-3, в зависимости от природы субстрата и локализации фермента и определенного субстрата, участвовать в разных, функционально важных для нейрона, процессах.
Полученные результаты и сделанные выводы имеют, наряду с фундаментальным, потенциально важное практическое значение. В связи с обнаружением апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях ряд исследователей предлагает блокирование активности каспаз в мозге как перспективный подход к лечению. Из полученных нами данных и концепции о роли каспазы-3 в нейропластичности следует, что ингибирование ферментов семейства каспаз в мозге потенциально опасно не может быть перспективным подходом к лечению нейр оде генерации, поскольку неминуемо приведет к нарушению важнейших функций мозга.
Положения, выносимые на защиту
Каспаза-3 в мозге является плейотропным ферментом. Наряду с участием в апоптотической гибели, каспаза-3 вовлечена в процессы структурной и функциональной адаптации головного мозга к изменяющимся условиям внешней и внутренней среды (нейропластичности) и в механизмы дифференцировки нервных клеток.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены (и опубликованы тезисы) на XLIII, XLIV и XLV научных конференциях Московского физико-технического института (Долгопрудный, 2000, 2001, 2002), XVIII съезде физиологического общества имени И. П. Павлова (Казань, 2001), международной конференции «Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging» (Санкт-Петербург, 2001), конференции центральноевропейских стран по нейробиологии (Краков, Польша, 2001), совместной 18-ой конференции международного нейрохимического общества и 32-ой конференции американского нейрохимического общества (Буэнос-Айрес, Аргентина, 2001), 31-ой конференции нейробиологического общества (Сан-Диего,
США, 2001), 3-ем европейском форуме по нейронаукам (Париж, Франция, 2002), 11-ой конференции "New Frontiers of Neurochemistry and Neurophysics on Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases" (Мартин, Словакия, 2003).
Роль каспазы-3 в нормальном развитии и функционировании мозга и при нейродегенеративных заболеваниях
Среди каспаз мозга каспаза-3 является наиболее активной и часто активируемой протеазой, активация каспазы-3 играет центральную роль в апоптозе нейронов различных классов (Salvesen, 2002; Troy, Salvesen, 2002). У дефицитных по каспазе-3 мышей мозг размером в два раза больше, чем нормальный, что связано с уменьшением апоптоза и смертностью клеток в пренатальном онтогенезе (Kuida et al., 1996). Такая мутация приводит к летальному исходу или в течение эмбриогенеза, или вскоре после рождения (Kuida et al., 1996). Специфические пептидные ингибиторы активного сайта каспазы-3 предотвращают гибель нейронов in vitro во многих ситуациях (Villa et al., 1997). Каспаза-3 выступает медиатором нейрональной клеточной смерти в экспериментальных моделях ишемии (Chen et al., 1998; Naraura, 1998), при повреждении мозга при травме (Clark et al., 1999), в модели лимбических судорог (Henshall et al., 2000). Каспаза-3 активируется при болезни Альцгеймера (Shimohama et al., 1999), болезни Паркинсона (Hartmann et al., 2000). Именно этот фермент участвует в биохимическом каскаде, активируемом в синаптических терминалях и нейритах, результатом которого может стать либо смерть клетки, либо морфологические и функциональные перестройки нейрона (Mattson, Duan, 1999). Среди субстратов каспазы-3 ПАРП (Nicholson et al, 1995; Los et al, 2002) и ДНК-зависимая протеинкиназа (Han et al., 1996), два фермента, ответственные за репарацию поврежденной ДНК. Их инактивация в результате расщепления приводит к ингибированию репарации ДНК в клетке. Ядерные белки ламины являются субстратами каспазы-3 (Liu et al., 1997).
Интрануклеосомальное расщепление ДНК, одна из основных особенностей апоптотической клеточной гибели, происходит под действием фермента CAD (caspase-activated deoxyribo nuclease - дезоксирибонклеаза, активированная каспазами) (Enari et al., 1998). Однако в интактной клетке этот фермент ингибируется ICAD (ингибитор CAD) (Enari et al., 1998), который каспаза-3 расщепляет при апоптозе (Nagata, 2000).
В настоящее время каспазу-3 рассматривают как фермент, принадлежащий к группе апоптотических каспаз, передающих и реализующих сигнал клеточной гибели. Однако сейчас становится ясным, что некоторые протеиназы - не просто ферменты деградации, но и строго регулируемые сигнальные молекулы, контролирующие критические биологические процессы путем специфического ограниченного протеолиза. Мнение о том, что каспазы - не только убийцы (Los et al., 2001), находит подтверждение в результатах, полученных в последние годы и свидетельствующих о том, что каспазы участвуют в различных неапоптотических клеточных физиологических процессах. Каспаза-3 принимает участие в регуляции клеточного цикла (Zhou et al., 1998; Eymin et al., 1999), процессинге цитокинов (Zhang et al., 1998), дифференцировке миоцитов (Fernando et al., 2002) и клеток-предшественников при гематопоэзе (Di Вассо, Cotter, 2002), развитии волокон хрусталика (Ishizaki et al., 1998; Weil et al., 1999), пролиферации T лимфоцитов (Alam et al., 1999; Kennedy et al., 1999). Иными словами, эти каспаза-3 имеет плейотропные функции (Fadeel et al., 2000; Robertson, Zhivotovsky, 2002), далеко не ограничивающиеся участием в реализации внутриклеточной апоптотической программы.
К настоящему времени накоплено очень мало данных о неапоптотической роли каспазы-3 в мозге. Однако, некоторые результаты, полученные отечественными и зарубежными учеными, позволяют предположить, что каспаза-3, участвующая в гибели нейронов как в физиологических, так и в патологических ситуациях, может принимать участие в связанной с развитием мозга пластичности нейронов, а также в иных формах нейропластичности. Так, некоторые механизмы апоптотического сигналинга регулируют синаптическую пластичность и подвижность конусов роста (Gilman, Mattson, 2002). Показано, что ферменты апоптотического каскада активируются локально в синапсах, нейритах и конусах роста, более того, введение панкаспазного ингибитора в первичную культуру эмбриональных нейронов гиппокампа приводит к значительному увеличению скорости роста аксонов и дендритов (Gilman, Mattson, 2002). Локальная, быстрая активация каспазы-3 в конусах роста клеток сетчатки необходима для установления правильных нейрональных связей (Campbell, Holt, 2003).
Группой японских ученых продемонстрирована различная экспрессия белков семейства каспаз в мозге крысы при развитии и старении, а также различная внутриклеточная локализация этих белков в мозге взрослых крыс (Shimohama et al., 2001а, б). Установлено, что уровень экспрессии каспазы-3 в мозге изменяется с возрастом, а в клетках головного мозга взрослых крыс этот фермент присутствует во всех внутриклеточных компартментах (Shimohama et al., 2001а, б). В ядре и в нейритах каспаза-3 в норме имеет уровень экспрессии лишь немного ниже, чем в цитоплазме (Shimohama et al., 2001а). Функциональная значимость такого распределения фермента пока неясна, однако авторы предположили, что каспаза-3, как и другие представители семейства каспаз, в норме вовлечена не только в реализацию механизмов гибели нейронов, но и в синаптическую пластичность.
Поиск оптимальных условий определения активности каспазы-3 в мозге
В предварительных экспериментах устанавливали применимость метода определения активности каспазы-3 для определения активности этого фермента в мозге. Для этого крысу в возрасте два месяца декапитировали, на льду выделяли кору больших полушарий, ткань замораживали в жидком азоте.
Супернатант разводили охлажденной средой выделения до определенных концентраций белка. В полученных пробах описанным способом определяли активность каспазы-3. Пробы инкубировали в течение 80, 120 или 160 мин. Полученные результаты представлены на рис. 1. На рисунке представлена флюоресценция пяти проб с различной концентрацией белка. Для каждой пробы проведены измерения флюоресценции на трех временных точках. Зависимость флюоресценции от времени для всех белковых образцов представляет собой прямую. Небольшое отклонение обнаружено для раствора белка с самой высокой концентрацией, но такого рода отклонение может являться погрешностью эксперимента. Результаты корреляционного анализа приведены в таблице 1.
Время инкубации, мин Рис. 1. Зависимость флюоресценции проб от времени инкубации. В пробах разная концентрация белка: 1 - 3.14 мг/мл, 2 - 2.50 мг/мл, 3 1.50 мг/мл, 4 - 0.50 мг/мл, 5 - 0.25 мг/мл. Данные представлены в виде M±SEM.
Таким образом, предварительными экспериментами установлен факт линейной зависимости флюоресценции продукта реакции от времени для белковых растворов супернатантов мозга с концентрацией белка 0.25-3.0 мг/мл (рис. 1).
Для каждой временной точки строили зависимость флюоресценции от концентрации белка. Результаты представлены на рис. 2. Зависимость флюоресценции от концентрации белка для белковых растворов с концентрацией белка выше 1.5 мг/мл заметно отклоняется от линейности. Однако для растворов с концентрацией белка ниже 1.5 мг/мл представленные зависимости можно считать линейными. Результаты корреляционного анализа приведены в таблице 2.
Исходя из результатов предварительных экспериментов, в последующих экспериментах время инкубации выбирали между 80 и 160 мин, а концентрацию белка между 0.25 и 1.5 мг/мл. В каждом конкретном эксперименте подбирали оптимальное соотношение концентрации белка в пробе и времени инкубации, заметных отклонений от линейности для зависимости флюоресценции от концентрации белка в пробе или от времени инкубации ни в одном из экспериментов обнаружено не было.
В предварительных экспериментах также была проведена проверка специфичности методики для определения активности каспазы-3 в мозге. Для этого был использован специфический ингибитор каспазы-3, Ас-DEVD-CHO (Nicholson et al., 1995). Оказалось, что для ингибирования каспазы-3 мозга достаточно концентрации ингибитора 1.0 мкМ. При этом сохраняется определенная неспецифическая активность, расщепляющая субстрат каспазы-3. При исследовании белковых образцов с разной концентрацией белка доля специфической активности составляла 66.7±0.4% (M±SEM, п=7). В последующих экспериментах концентрация субстрата была равна 50 мкМ (пятикратное превышение Км, по данным производителя), а концентрация ингибитора 5 мкМ.
Активность каспазы-3 в культурах клеток крысиной нейробластомыВЮЗ
Культивирование клеточных линий проводили на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, совместно с сотрудниками лаборатории клеточной инженерии под руководством д.б.н. И.П. Белецкого. Для культивирования клеточной линии крысиной нейробластомы В103 использовали среды DMEM. Необходимое количество сухой среды, содержащей L-глутамин, взвешивали и растворяли в дистиллированной дважды деионизированнои воде. После добавления антибиотика антимикотика (0.1% от объема среды) и ИаНСОз (3.7 г на 1 л среды DMEM) среду фильтровали через стерильную нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0.22 мкм. Полученную культуральную среду хранили до дальнейшего использования при 4С. Фетальную сыворотку теленка перед использованием инактивировали путем инкубации на водяной бане в течение 30 мин при температуре 56С. Для культивирования клеточных линий использовали 10%-ный раствор сыворотки в культуральной среде. Клетки выращивали на чашках диаметром 10 см.
Клеточные культуры инкубировали в термостатируемом CCV инкубаторе при температуре 37С и концентрации СОг 5%. Форсколин хранили в виде спиртового раствора концентрации 10 мг/мл, конечная концентрация в культуральной среде составляла 2 мкг/мл. РМА хранили в виде спиртового раствора с концентрацией 1.25 мг/мл, конечная концентрация 10 нг/мл. С чашек клетки снимали раствором, содержащим 0.25% трипсин и 0.02% ЭДТА. Клетки собирали, промывали дважды PBS и замораживали в жидком азоте. Клетки лизировали в буфере, содержащем 20 мМ HEPES, рН 7.4, 10 мМ КС1, 1.5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1% детергент NP-40 с добавлением ингибиторов протеаз (по 10 мкг/мл апротинина, пепстатина, лейпептина, 1 мМ PMSF) на льду в течение 10 мин. Полученные таким образом образцы центрифугировали 14000xg в течение 30 мин при 4С и отбирали супернатанты для определения активности каспазы-3 и концентрации белка.
Статистическую обработку и анализ результатов проводили с использованием непараметрического анализа ANOVA для зависимых величин.
Работа по изучению активности каспазы-3 у животных после введения Р-амилоида фА) и фактора некроза опухоли а (ФНОа) была проведена на 32 самцах крыс линии Wistar массой 230-290 г (питомник «Столбовая» РАМН). Крыс содержали по 5 особей в клетке в условиях вивария при искусственном цикле освещения (день 08.00-20.00, ночь 20.00-08.00) и свободном доступе к воде и пище.
Для введения препаратов животных, наркотизированных хлоралгидратом (325 мг/кг, внутрибрюшинно), помещали в стереотаксическую установку. Инъекции осуществляли в соответствии с координатами стереотаксического атласа (Paxinos, Watson, 1982): координаты для интрацербровентрикулярных введений: АР—0.8, L=±1.5, DV=+3.8; для интрагиппокампальных введений: АР—3.8, L=±2.0, DV=+3.5. Перед началом эксперимента крысы были случайным образом разделены на 4 группы: 1) ложнооперированные (ЛО); 2) группа, получавшая рА(25-35); 3) группа, получавшая ФНОа; 4) группа, получавшая рА(25-35)+ФНОсс. Животным из этих групп вводили следующие вещества: 1) по 3 мкл изотонического раствора NaCl в латеральные желудочки и интрагиппокампально - по 2 мкл дистиллированной воды; 2) интрацеребровентрикулярно по 3 мкл изотонического раствора NaCl, в левый гиппокамп - 3 нмоля агрегированного фрагмента рА(25-35), в правый гиппокамп - 2 мкл дистиллированной воды; 3) интрацеребровентрикулярно вводили по 0.5 мкг ФНОа и интрагиппокампально - по 2 мкл дистиллированной воды; 4) интрацеребровентрикулярно вводили по 0.5 мкг ФНОа, в левый гиппокамп - 3 нмоля рА(25-35) и в правый гиппокамп - 2 мкл дистиллированной воды. Все инъекции выполняли со скоростью 1 мкл/мин. Фрагмент р-амилоидного пептида рА(25-35) растворяли в стерильной воде и агрегировали согласно методу, описанному ранее (Maurice etal., 1996).
Для определения активности каспазы-3 животных (по 5 в каждой группе) декапитировали на седьмой день после операции, мозг извлекали, промывали в охлажденном изотоническом растворе NaCl и на льду разделяли на структуры. Кору и гиппокамп из левого и правого полушарий по-отдельности замораживали и хранили в жидком азоте до исследования. Ткань гомогенизировали как описано в разделе 2.2.1.
Для патоморфологического анализа и иммуногистохимических исследований крыс (число животных в каждой группе равно трем), наркотизированных хлоралгидратом (350 мг/кг, внутрибрюшинно), транскардиально перфузировали 50 мл изотонического раствора NaCl, затем 250 мл фиксатора AFA (96% этиловый спирт, 39% формалин, ледяная уксусная кислота, 7:2:1). После перфузии мозг оставляли на 3 часа при температуре 4С, затем извлекали и хранили в 70%-ном спирте. Мозг заключали в парапласт и делали фронтальные срезы толщиной 10 мкм. Парафиновые срезы окрашивали по Нисслю крезилвиолетом, а также с использованием терминальной трансферазы для обнаружения фрагментированной ДНК, с помощью набора Apoptag (Intergene, USA), согласно протоколу фирмы-производителя. В срезах, окрашенных крезилвиолетом, была проведена оценка нейродегенерации в верхней ветви зубчатой фасции и поле СА1 гиппокампа согласно методу, описанному в работе (Miguel-Hidalgo, Cacabelos, 1998).
Статистическую обработку и анализ результатов проводили с использованием дисперсионного анализа с последующим множественным сравнением средних по методу Ныомена-Кеулса.
Влияние экспериментального невроза на активность каспазы-3 в отделах мозга крыс
Моделирование неврозов на животных, как и других патологий, необходимо для исследования механизмов патогенеза невротических расстройств. Несмотря на активные исследования в этой области, к настоящему времени не получено достаточно данных о молекулярных механизмах невротических расстройств на уровне нейронов и других клеточных элементов мозга. Возможность контроля функции мозга на уровне мембранных и внутриклеточных рецепторов, процессов трансдукции сигнала, а также структурных белков локальным изменением активности каспазы (Гуляева, 2003) позволяет предположить, что каспаза-3 может быть вовлечена в молекулярные механизмы изменений, происходящих в клетках разных отделов мозга при неврозе.
Активность каспазы-3 в отделах мозга контрольных и невротизированных крыс представлена на рис. 6. Во всех исследованных отделах мозга можно проследить снижение активности каспазы-3 в результате экспериментального невроза. Так, в коре больших полушарий невротизированных крыс активность фермента составила 0.9±0.1 пмоль/мин/мг белка, что достоверно ниже активности фермента у контрольных животных, 1.1±0.1 пмоль/мин/мг белка (р 0.05). В гиппокампе невротизированных животных активность каспазы-3 также (1.2±0.1 пмоль/мин/мг белка) достоверно ниже контрольного уровня (1.4±0.1 пмоль/мин/мг белка, р 0.05). В мозжечке невротизированных крыс активность каспазы-3 ниже, чем в контрольной группе (0.8±0.1 пмоль/мин/мг белка и 1.0±0.1 пмоль/мин/мг белка, р=0.1), однако различие достоверно лишь на уровне тенденции.
Исследования механизмов неврозов осложняются тем, что эта группа заболеваний представляет собой пограничные патологии (Айрапетянц, Вейн, 1982). Как правило, при невротических расстройствах наряду с обратимыми психосоматическими нарушениями отсутствуют видимые патоморфологические изменения (Айрапетянц, Вейн, 1982). Ранее было показано, что при моделировании экспериментального невроза использованным нами способом у животных развивается стойкое неврозоподобное состояние (Гуляева, Левшина, 1984). Показателями невротических расстройств в этой модели невроза служат длительные нарушения в системе условных рефлексов и вегетативных реакциях.
Основным действующим фактором, вызывающим экспериментальный невроз, является хроническое эмоционально-болевое стрессорное воздействие (комбинированное электро болевое и звуковое раздражение). Имеется ряд работ, в которых проведено исследование влияние действия стрессорных факторов на клеточную гибель в головном мозге. В ряде исследований показано, что продолжительное стрессорное воздействие приводит к нейродегенерации. Показано, что хроническое стрессорное воздействие разного типа может приводить к гибели нейронов в гиппокампе животных (Uno et al., 1989; Kerr et al., 1991). Трехмесячное воздействие высокого уровня кортикостерона (имитирующее повышение уровня кортикостероидов при стрессе) приводит к потере клеток в поле САЗ гиппокмапа (Sapolsky et al., 1985). Несмотря на то, что в результате продолжительного стресса в некоторых областях мозга происходит гибель нейронов, в нашей работе обнаружено снижение активности каспазы-3 -основного эффектора клеточной гибели в мозге — во всех исследованных областях мозга невротизированных крыс. Если бы изменения активности каспазы-3 при экспериментальном неврозе были связаны с гибелью нейронов, мы ожидали бы зарегистрировать повышение активности, но не ее снижение. В связи с этим мы полагаем, что выявленные нами в этой модели патологии на животных активность каспазы-3 связаны с ее неапоптотической функцией.
Данные литературы свидетельствуют о морфологических изменениях клеток разных отделов головного мозга при экспериментальном неврозе. Так, при исследовании сенсомоторной коры головного мозга кроликов при экспериментальном неврозе были выявлены определенные перестройки, в частности, увеличение числа клеток микроглии и уменьшение числа астроцитов (Александровская, Кольцова, 1978). В слое V сенсомоторной коры кроликов выявлено появление значительного числа олигодендроцитов необычной, измененной формы, причем общее число клеток глии уменьшалось (Александровская, Кольцова, 1980). Как и в коре, в гиппокампе выявлены вызванные стрессом изменения структуры нейронов. Например, хронический стресс приводил к изменению дендритов нейронов поля САЗ гиппокампа (Watanabe et al., 1992). Методом электронной микроскопии установлено, что мшистые волокна (основной возбуждающий вход в нейроны поля САЗ) также претерпевали морфологические изменения после воздействия хронического стресса (Magarinos et al., 1997). В частности, происходили значительные перестройки синаптических терминалей мшистых волокон, изменение плотности синаптических везикул, увеличение мощности энергетического аппарата синаптических окончаний. При этом однократное воздействие стресса не вызывало морфологических изменений ни сразу, ни спустя день после его окончания. Таким образом, можно заключить, что хроническое, но не острое, стрессорное воздействие приводит к морфологическим изменениям в коре больших полушарий и в гиппокампе мозга животных разных видов.
Стресс может являться причиной нарушений процессов синаптической пластичности у животных. Показано, что сразу после воздействия острого стресса в гиппокампе значительно ухудшается ДП (Foy et al., 1987). Значительное ингибирование ДП обнаружено через 4 ч после острого стресса (Yamada et al., 2003), но не через 1 ч после стресса, В другой работе показано, что нарушение ДП в гиппокампе в результате острого стресса отмечается через 2 дня после стресса, а через 4 дня этот эффект исчезает (Shors et al., 1997). Очевидно, временные характеристики нарушения пластичности связаны с характеристиками использованного стрессорного фактора. Хронический эмоционально-болевой стресс нарушает ДП в гиппокампе (Shors et al., 1989) и, наряду с подавлением ДП вызывает усиление ДД (Kim et al., 1996). Показано, что хронический психогенный стресс приводит к ингибированию низкопороговой формы ДП в гиппокампе (Diamond et al., 1996). В этой же работе продемонстрировано, что в результате стресса страдает в первую очередь гиппокамп-зависимая память. Повреждения пространственной гиппокамп-зависимой памяти найдены также в результате хронического иммобилизационного стресса (Luine et al., 1994). При этом нарушения памяти не были отмечены, если у животных была заблокирована глутаматергическая нейротрансмиссия. В этом исследовании также продемонстрированы обратимые изменения дендритов гиппокампальных нейронов после воздействия стресса. Таким образом, стрессорные факторы различной силы и продолжительности, прежде всего хронически действующие, вызывают нарушение пластичности мозга на разных уровнях, причем эти нарушения проявляются не только в функциональных, но и в структурных изменениях нейронов, в первую очередь гиппокампальных.
