Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Дифракция на спиралях 5
1.2 "Запрещенные" рефлексы на рентгенограммах спиральных биополимеров 11
1.3 Молекулярная структура коллагена 13
1.4 Экспериментальные исследования полипептидных моделей коллагена 26
1.5 Теоретический конформационный анализ моделирующих коллаген политрипептидов 40
Глава 2. Исследование дифракционных эффектов, возникающих при упаковке спиральных молекул
2.1 Расчет дифракции на системе спиралей. Общий случай 55
2.2 Описание меридиональных "запрещенных" рефлексов 59
2.3 Применение разработанного метода к расчету дифракции на знакопеременной спирали 62
Глава 3. Кошормационный анализ политрипептвдов gly-pro-ala)n, (gly-pro-ser)n,(gly-ala-hyp)n,(gly-ala-ala)n и (gly-val-hyp)n в связи с проблемой структуры коллагена
3.1 Метод расчета 71
3.2 Результаты расчетов 72
3.3 Обсуждение рузультатов 90
Выводы 108
Литература 110-125
- "Запрещенные" рефлексы на рентгенограммах спиральных биополимеров
- Экспериментальные исследования полипептидных моделей коллагена
- Теоретический конформационный анализ моделирующих коллаген политрипептидов
- Применение разработанного метода к расчету дифракции на знакопеременной спирали
Введение к работе
Охарактеризуем специфику рентгенографического исследования фибриллярных структур. Вариант структурного анализа, применяемый для исследования, например, глобулярных белков - прямой метод. Здесь не делается никаких априорных предположений о фазах рефлексов и, имея набор интенсивностей рассеяния для чиотого белка и несколько изоморжных производных в введенными тяжелыми атомами, мы можем однозначно получить структуру исследуемого белка. При анализе же фибриллярных структур мы используем непрямой метод, то есть задаем определенную модель и ищем параметры данной модели. Вместе с тем, используя такой вариант структурного анализа, мы практически однозначно и достоверно определяем структуру. С чем это связано? Дело в том, что в данном случае задание модели эквивалентно поотулированию спиральной симметрии молекулы, а это - единственно возможная конформация регулярного полимера (структуры с углами спирального вращения, равным 0° или 180°), являются частными случаями спирали. Задав такую модель и имея в виду, что размеры молекулы много больше размеров асимметричной единицы, мы можем теперь определить спиральные параметры молекулы только из геометрии дифракционной картины, то есть из расположения слоевых линий и максимумов интенсивности на них. При этом, конечно, остается загадкой сшроение асимметричной единицы спирали, здесь необходима информация об интенсивностях. Возможность получения не априорных данных о расположении атомов в спирали связана со степенью информативности рентгенограмм, определяющейся количеством рефлексов и общей степенью кристалличности рентгенограш хотя для определения только симметрии спирали необходимо получить рентгенограммы образцов, в которых по возможности молекулы не упакованы правильным образом.
Для того, чтобы на рентгенограммах не проявлялись эффекты межмолекулярной интерференции, в качестве образцов используют, в некоторых случаях, сильно увлажненные ориентированные гели. Интенсивность интерференции на таких рентгенограммах полностью описывается усредненным по азимуту квадратом модуля Фурье-трансформа молекулы полимера.,
В соответствии с особенностями упаковок опиральных молекул возможны различные типы дифракционных картин. Их условно можно назвать: кристаллический /I/, пара- /или семи-/ кристаллический /2-5/ и "молекулярный".
Теория дифракции на спиралях была развита Стоксом, не опубликовавшим свои результаты. Затем аналогичные исследования были изложены в работах Кохрана, Крика и Ванда /6/ и Клуга, Крика и Уайкова /7/. Рассмотрим спираль, имеющую проекцию аоимметричной единицы С% шаг спирали С и период С0 (рис.1). Спираль содержит р асимметричных единиц в G оборотах непрерывной спирали, то есть С(Э=С С1= рС2 . Амплитуда рассеяния на такой структуре имеет вид
В случае непрерывного сдвига /9/ только на экваторе останутся рефлексы, соответствующие упаковке молекул, а на остальных слоевых линиях рассеяние будет определяться Фурье-трансфор-мом молекулы. Нарушения сетки 2-го рода проявляются в размытии картины дифракции с ростом R, , причем в случае тангенциальных нарушений на непрерывное распределение интенсивности будут наложены острые рефлексы. Повороты молекул вокруг главной оси будут приводить к тому, что функции Бесселя с номерами п і будут ослабевать тем сильнее, чем больше . Для "чистого" вращения погашенными окажутся все слоевые, кроме тех, рассеяние на которых описывается функцией Бесселя нулевого порядка. При винтовых нарушениях, характеризующихся разупорядочиванием атомов одних молекул относительно других вдоль спиральных линий, дискретные рефлексы будут наблюдаться только на слоевых, соответствующих шагу спирали, по которой происходит разупорядочение; на остальных слоевых линиях распределение интенсивности будет непрерывным, а сами величины интенсивности- уменьшенными /10/.
"Запрещенные" рефлексы на рентгенограммах спиральных биополимеров
Заметим, что все вышеперечисленные нарушения порядка в агрегате спиралей, как видно из формулы (5), не приводят к появлению рефлексов в том месте, где Фурье-трансформ опиральной молекулы имеет нулевое значение. Фактор упаковки может обусловить лишь дополнительные погасания. Поэтому, когда на рентгенограммах спиральных молекул появляются рефлексы, запрещенные Фурье-трансфрр-мом, их называют "духами".
Разобраны некоторые случаи появления таких рефлексов. В 1969 году Каспар и Холмс связали дифракционные эффекты, наблюдавшиеся на рентгенограммах Далемского штамма вируса табачной мозаики с периодическим возмущением спиральной симметрии ВШ, вызванным, по мнению авторов, неэквивалентностью прилежащих друг к другу витков спирали /II/. Это приводит к увеличению истинного периода вдоль оси 1L в два раза, причем все четные порядки нового периода соответствуют дифракции ш обычной спирали ВШ, а все нечетные - "запрещенной" дифракции.
В поли-1 -аланине возникновение "запрещенных" рефлексов авторы объяснили искажениями его сб-спиральных молекул при упаковке в гексагональную ячейку /12,13/. В поли-Ї-бензил- -глю-тамате специальные дифракционные эффекты связаны с упаковкой бензольных колец в "колодце" между молекулами с образованием квази-спирали с проекцией бензольного кольца, равной 5,15 А /14/.
Общий период квази-спирали, равный 330 А, включает 64 бензольных кольца. Суперспирализация также может быть одной из причин возникновения "запрещенных" рефлексов /15,16/. Опуская описание характера возникающей картины, отметим только, что в результате суперспирализации появляется истинный меридианальный рефлеко на слоевой линии, близкой линии, соответствующей шагу спирали.
В ряде случаев и, прежде всего, на рентгенограмме коллагена, происхождение "запрещенных" рефлексов не ясно. Они также имеют место на рентгенограммах Ф-актина, реконструированных тонких нитей /4/, мышцы /2,4/ и других объектов. В.Н.Рогуленковой была разработана процедура приготовления кристаллической формы олиго-трипептида (Giy-Pro-Pro)10 и получена рентгенограмма /17/. Оказалось /17/, что на рентгенограмме кристаллической формы полимера, в отличие от фибриллярной формы присутствует ряд "запрещенных" меридианальных рефлексов: четыре малоугловых рефлекса с интенсивностью, убывающей с увеличением угла и два близко лежащих рефлекса вместо одного, соответствующего проекции асимметричной единицы на ось спирали.
Молекула коллагена представляет собой три скрученные в канат оС-цепи, каждая из которых имеет левоспиральную конформацию, типа поли- с -пролин П (или поли- I-глицин П) /18,19/. Синтезируются пять генетически различных типа коллагенов /20,21/. Из коллагена типа I состоят кости и сухожилия, он являетоя основным компонентом кожи. Тройная спираль молекулы коллагена типа I состоит из двух видов гомологичных цепей oil(I) ж d-2 и имеет состав [oii(I)]noC2 . Гиалиновые хрящи содержат коллаген типа П, состоящий из трех идентичных цепей и обозначаемый как feLiQl)} /22,23/. В коже, кроме коллагена типа I содержится также немного коллагена типа Ш /24/, первичная последовательность которого для кожи теленка сейчас полностью известна /25/. В базальних мембранах обнаружен коллаген, который называют коллагеном типа ЗУ /26/.Лучше всего изучена первичная последовательность коллагена типа I. oil (Г) цепь коллагена из кожи теленка содержит в своей спиральной части 1014 амино-(имино-)-кислотных остатков /27/. Приведем первые пятнадцать амино(имино-)кислотных остатков: Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Arg-Gly-beu-Hyp-Gly-Pro-Hyp Gly-Ala-Hyp-.
Экспериментальные исследования полипептидных моделей коллагена
Изучение синтетических полипептидов, которые моделируют коллаген, имеет давнюю историю. Их изучение актуально по нескольким причинам. Во-первых, нативное коллагеновое волокно дает бедную рентгенограмму с сильным диффузным фоном. Поэтому исследователи пытались найти полимеры, моделирующие коллаген, надеясь закристаллизовать их и получив кристаллическую рентгенограмму, определить детальную молекулярную структуру гомополипептида как пример структуры коллагенового типа. Однако фибриллярные рентгенограммы синтетических полипептидов были худшего качества, чем рентгенограммы нативных коллагеновых волокон, несущих черты кристаллического порядка, и даже определение только спиральных параметров для модельных полипептидов часто было невозможным. (Gly-Pro-Pro),, который был закристаллизован, и спиральные параметры которого были получены со значительной точностью. Однако, полученные данные не укладывались в диапазон допустимых для коллагена значений. Второй причиной, определяющей незаменимость исследований синтетических моделей коллагена как этапа на пути определения детальной структурц коллагенного волокна, причиной, существенной в большей степени для теоретических конформационых исследований, является малое количество независимых переменных, которые точно определяют структуру регулярного гомополимера. В случае гете-рополимера, каким является реальный белок, между однотипными двугранными углами (например, углами при глицине) может появляться разница, возникающая из-за особенностей первичной последовательности. Это обстоятельство затрудняет непосредственный анализ молекулярной структуры с одной стороны, и делает необходимым изучение структур гомополитрипептидов как нулевого приближения структуры коллагеновой молекулы. а) Экспериментальное изучение гомополипептидов. В середине пятидесятых годов, когда первичная последовательность об-цепей коллагена еще была неизвеотна, а знали только, что х-цепи содержат много глицина, пролина и оксипролина, были предложены структури ДО таких полимеров, как (Gi7)n и (РГО)П . Левые спирали, характерные для форм поли- -пролин П (РРИ) И полиглицин П (PGII) и стали основой для построения тройной спирали коллагенового типа. Структурная форма PGII получается при осаждении полимера из водного раствора бромистого лития. Крик и Рич /59/ на основании рентгеноструктурных данных /60/ предложили модель для структурной формы П, в которой остатки глицина образуют спираль з1 о период структуры (совпадает с шагом спирали) равен 3.1 А, а угол спирального вращения t =120. Молекулы располагаются в гексагональной решетке, соседние молекулы овязанн- G-- —H-N водородными связями. Поскольку остатки глицина не имеют асимметричного с атома углерода, то возможны как левая спираль (t-I20), так и зеркально симметричная правая (t=I20). Если только что синтезированный полимер (Рго)п растворить в уксусной кислоте, то он принимает конформацию, называемую формой I /61,62/, которая со временем переходит в форму П. Этот переход был объяснен /62/ переходом конформации пептидной группы из цис-формы ( f =0) в транс-форму ( =180). Коуэн и Макгэвин /63/ получили рентгенограмму ориентированных пленок поли- -пролина П, которая была проиндицирована на ооновании о гексагональной решетки с 0.=6.22 А и С=9.36 А (ось Z направлена вдоль оси полимера). Молекула являла собой левую спираль 3/1 (t= -120) с периодом 9.36 А и проекцией остатка 3.12 А. Сасисекхаран /64/, а затем Арнотт и Доувер /65/ уточнили координаты, полученные Коуэн и Макгэвином. Углы Y , полученные в этих работах, равны: 145.1 /63/, 145.9 /64/ и 84.9 /65/.
Остальные углы фиксировались при значениях гсГ=180 и = -70. В целом конформация поли- -пролина П оказалась очень близкой к конформации полигливдна П, в дальнейшем такого типа конформации мы будем называть РРИ - PGII , следуя Фрэзеру и Макраэ /66/. Сасисекхаран /67/ показал, что пож--оксипролин также может принимать конформацию левой опирали 3 с параметрами к= 3.05 А и t= -120. Политрипептиды начали изучать вскоре после того, как стало известно, что в последовательности oC- їепей коллагена остаток глицина является каждым третьим аминокислотным остатком. Эти исследования, начатые в нашей стране в лаборатории Н.С.Андреевой явились естественным продолжением работ конца пятидесятых годов /68-71/, посвященных проблемам строения коллагена. После твго, Как бЫЛ синтезирован ПОЛИМер (Gly-Pro-Hyp)n /72/, в 1961 году впервые было показано, что дебаеграммы пленок полимера содержат отражение с межплоскостним расстоянием d «2.9 А, что указывало на трехспиральную структуру коллагенового типа /73/. В дальнейшем был экспериментально изучен ряд полижрипеп-тидов, содержащих остатки глицина, пролина, окоипролина, аланина, тирозина, серина и лизина; результаты работы были обобщены в обзоре /74/. Самым распространенным трипептидов в первичной последовательности КОЛЛагеНа ЯВЛЯеТСЯ ТрИПеПТИД (Gly-Pro-Hyp) который на ранних стадиях фибриллогенеза существует в виде трипептида Gly-Pro-Pro . Поэтому экспериментальные исследования ПОЛИ- И ОЛИГОТрИПеПТИДОВ, СОДерЖаЩИХ ТрИПеПТИДЫ Gly-Pro-Pro И Gly-Pro-Hyp ОСОбеННО ВЭЖНЫ. Сдвиг частоты колебаний N-H группы, характерный для коллагеновой структуры и являющийся одним из способов идентификации трехспиральной структуры /73/, также указывал на коллаге-ноподобную структуру полимера. Окончательным доказательством схожести структур полимера (Gly-Pro-Hyp) и коллагена явилось получение рентгенограмм ориентированных пленок полимера /76/. Рентгенограмма полимера, содержавшая меридиональный рефлекс с i 2.82 А, и по характеру распределения интенсивности очень походила на рентгенограмму волокон из хвоста крысы. Точно спиральные параметры не определялись, дифракционная картина была описана как рассеяние на спирали 10/3.
Теоретический конформационный анализ моделирующих коллаген политрипептидов
Теоретический конформационный анализ политрипептидов с применением ЭВМ необходим постольку, поскольку экспериментальные исследования полиярипептидов не позволяют определить детальную структуру полимеров (единственным исключением сейчас является олиготрипептид (Giy-Pro-Pro)10 ). На смену молекулярным моделям из шариков, применение которых, вообще говоря, можно считать частным случаем метода атом-атомных потенциальных функций, пришли машинные методы, с помощью которых, во-первых, можно систематически сканировать конформационное пространство и, во-вторых, гораздо более точно получать координаты атомов. Впервые подобный подход был применен Енатом и Траубом в работе /51/. В работе вычислялись координаты тройного комплекса с заданными спиральными параметрами (проекцией остатка на ось п- 2.87 А и углом спирального вращения t s 36 , характерным для спирали 10/3), которые не варьировались. Рассчитывался цилиндрически усредненный Фурье-трансформ, который должен был достигнуть соответствия с эксперименталлно наблюдаемым распределением интенсивности на рентгенограмме полимера. Дополнительным условием являлось отсутствие неблагоприятных контактов между атомами. Полная энергия структуры не вычислялась и не оптимизировалась. Изучение конформационных возможностей тройной спирали поли- трипептида (Giy-Pro-Pro)n с помощью метода атом-атомных потенциальных функций провел В.Г.Туманян /ЇІ4/ в работе 1970 года. Конформация каждой цепи, составляющей тройной комплекс описывалась с помощью четырех углов j j ) 2 и так как конформация пирролидиновых колец иминокислот считалась жесткой и 2 " % - ""SO0 (рис.5). Был разработан метод, являющийся модификацией метода Зугеты и Миядзавы, с помощью которого по двугранным углам вычислялись спиральные параметры t и /г и находилось положение оси тройного комплекса.
В работе найдено несколько удовлетворительных конформаций типа Коллаген П со спиральными параметрами значительно отклоняющимися от о 2.86 А и 36; завязывание водородных связей по типу Коллаген I сопровождалось увеличением энергии приблизительно на 8 ккал/моль. Работа Хопфингера /115/, в которой вычислялась межмолекулярная энергия для разных тройных комплексов с заменами аминокислота иминокислота была сделана в неудовлетворительном приближении прямых спиралей, то есть тройной комплекс задавался несуперспира-лизованным. Для более тщательного, чем в работе /114/ сканирования кон-формационного пространства Туманян и Есипова /116,117/ наложили уоловие образования водородной связи N -H "- О2=С2 , что, по существу, свело задачу к однопараметрической, однако, поскольку явно разрешить уравнения, связывающие углы / и У не удается, осуществлялся перебор по сетке с шагом 1 углов: Ф. в диапазоне от -80 до -55 и Ж от 130 до 160. При этом углы У[и менялись в пределах 140-160 и 140 170 соответственно. Оптимальная структура, полученная таким образом, в приближении жесткого пролина ( = Р3 - -60) имела угол спирального вращения t =51. Двугранные углы полученной структуры приведены в табл.4. В двух работах: Миллер и Шераги /118/, а также Миллер, Немети и Шераги /95/ исследовались политрипептиды (Giy-Pro-Pro) и Giy-Pro-Hyp)n соответственно. Сразу заметим, что несмотря на значительный объем работы авторы не получили ни одного нового результата. Детальную структуру тройного комплекса полимеров в коллагеновом минимуме они также не получили, так как вычисляли энергию в приближении жесткого пролина. Было исследовано шесть видов комплексов: А. Тройная суперспираль о расположением цепей против часовой стрелки, если смотреть от N конца к с концу (Коллагеновый тип). в- Тройная суперспираль с расположением цепей против часовой стрелки. О- Тройная суперспираль, в которой отдельные цепи связаны поворотной осью третьего порядка. D« Тройной комплеко из параллельных молекул, связанных спиральным преобразованием с t =120 цепи расположены против часовой стрелки. в« Тройной комплекс из параллельных молекул с t = -120. F» Тройной комплекс из параллельных молекул, связанных поворотной осью третьего порядка.
Применение разработанного метода к расчету дифракции на знакопеременной спирали
Плодотворность вышеописанного подхода к расчету дифракции на разного рода спиральных системах можно проиллюстрировать на примере знакопеременной спирали. В данном случае специфика подхода заключается в том, что мы выражаем структурную амплитуду рассеяния на знакопеременной спирали F"2 (R/H wO через Fl(R;Y, Vco) то еоть структурную амплитуду рассеяния на спирали одного знака.
Важность этой задачи определяется тем, что в последнее время широко обсуждалась так называемая «5i.de - (?у -9lde» структура ДНК (9 В 5 ДНК) /132-136/. Во веек моделях такого рода две цепи ДНК образуют комплементарные пары оснований так же, как и в модели Устсона и Крика, и антипараллельные поли-нуклеотидные цепи образуют попеременно то правую, то левую спираль. Координаты модели приведены в статье Родди и др. /132/. Модель ДНК Уотсона и Крика (УК ДНК) была предложена на основании рентгенограммы ДНК после того, как Кохраном, Криком и Вандом была развита теория дифракции на спиралях /6/. Теория позволяла только на основании геометрии рентгенограммы определить спиральные параметры. Поэтому необходимым условием возможности существования SB5 ДНК является соответствие дифракции от 5BS ДНК имеющимся рентгенограммам ДНК.
Главной причиной появления BS моделей, кроме биологических резонов, явилось утверждение, которое можно сформулировать следующим образом : "Рентгенограммы правой спирали и зеркально отраженной левой спирали тождественны, то есть дифракция на спирали не чувствует ее знака. Поэтому, если мы будем чередовать участки правой и левой спиралей в ДНК, то дифракционная картина будет той же, что и для спирали одного знака, если асимметричная единица левой спирали будет зеркально симметрична правой. Учет их отличия не дает принципиального отличия геометрии рентгенограммы".
Этот тезис в течение трех лет не подвергался сомнению, а напротив утверждалось, что поскольку единственный прямой структурный метод дает одинаковую картину для SBS модели и моделей Уотсон-Крикоского типа, то доказательства УК модели надо искать в косвенных данных о ДНК. Это и сделал Арнотт, который в 1979 году опубликовал в " Nature " статью /137/, в которой мельком приведя значения R -фактора, большего для SBS , чем для улучшенной УК модели, писал исключительно о других доказательствах УК модели, в частности, о данных по суперспирализации кольцевых замкнутых ДНК.
Наконец, в декабре 1979 года появилась статья Гринолла, Пигрэма и Фуллера /138/, где они рассмотрев SBS модель, характеризующуюся суммарным поворотом, равным 36 на десять остатков, показали, что на рентгенограммах, полученных от этой модели, будет наблюдаться совершенно другая система слоевых линий, так как общий порядок этой системы будет равным 345 А. Тогда авторы преобразовали приведенные в /132/ координаты атомов SBS модели таким образом, что суммарный поворот на десять пар нуклеотидов оказался равным нулю, а период и, следовательно, система слоевых линий получились такими же, что и для УК модели, т.е. С=34.5 А. Авторы использовали в качестве асимметричной единицы десять нуклеотидов, которые повторяются с периодом С и найдя координаты всех атомов этих десяти нуклеотидов, произвели раочет дифракции для этой конкретной модели по общим формулам. Распределение интенсивностей на слоевых оказалось совершенно другим, чем при дифракции от УК спирали.
Здесь важно отметить, что расчет проводился для конкретных координат атомов модели и всегда остается возможность для утверждений, что за счет выбора координат можно добиться соответствия дифракционной картины от SBS модели экспериментальной картине. И для этого есть определенные основания. Так, например, соответствие экспериментальных и теоретических интеноивностей для первоначальной УК модели очень плохое и Е -фактор больше 0.5. Тем не менее, геометрия полученных рентгенограмм оказалась такой, как предсказывала теория дифракции на спиралях (характерный "крест"), и на основании анализа только геометрии рентгенограммы была получена принципиально правильная структура.
Поэтому представляется важным показать, что в общем случае для любых координат атомов, будет отличаться от экспериментальной именно геометрия рентгенограммы для SBS модели и указать характер этих различий /139-140/. Это сделает возможным анализ рентгенограмм образцов, подозреваемых на наличие в них SBS структур, с учетом особенностей геометрии картины для SBS моделей.
Покажем, что геометрии рентгенограмм от гладкой спирали и спирали о периодически чередующимися правыми и левыми участками в общем случае будут явно различаться. Наглядно это легко продемонстрировать на таком примере: пусть полтора витка непрерывной спирали идут вправо, затем влево и т.д. Очевидно, что период структуры теперь будет равен не одному витку как для спирали,одного знака, а в три раза больше, отчего слоевые будут расположены в три раза чаще, т.е. геометрия дифракционной картины совершенно изменится. Таким образом, для всех случаев, кроме одного, изменение геометрии картины проявится в том, что изменится система слоевых линий, а это всегда легко обнаружить.
