Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
-
Физико-химические свойства рибулозо-1,5-дифосфат-карбоксилазы 7
-
Каталитические свойства РДФ-азы 9
-
Химическая природа групп активного центра РДФ-азы.. 10
-
Особенности метода спиновых меток 16
-
Зависимость параметров спектров ЭПР иминоксильных радикалов от полярности окружения 21
-
Исследование белков с помощью метода спиновых
меток 23
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
-
Выделение белка и его модификация спин-меткой 29
-
Получение спин-меченых субьединиц рибулозо-1,5-ди-фосфаткарбоксилазы 33
-
Методика обработки носителей для иммобилизации рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы 34
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПИН-МЕЧЕНОЙ РИБУЛ030-1,5-ДИФОСФАТ-
КАРБОКСИЛАЗЫ 35
-
Идентификация места присоединения спин-меток на молекуле РДФ-азы 35
-
Анализ спектра ЭПР спин-меченой РДФ-азы. Измерение времени корреляции макромолекулы РДФ-азы 38
3.3 Изменение конформации молекулы РДФ-азы при взаимо
действии с субстратами и активатором 49
3.3.1. Изменение конформации РДФ-азы при взаимодействии
с рибулозо-І,5-дифосфатом (РДФ) 49
3.3.2. Изменение конформации молекулы РДФ-азы при взаимо
действии с NaHCOg 53
3.3.3. Изменение конформации молекулы РДФ-азы при взаимо
действии сМдС^ 55
-
Изменение конформации субьединиц РДФ-азы при взаимодействии с субстратом и его аналогом 57
-
Избирательная модификация SH-групп РДФ-азы спин-меткой 69
-
Окисление нитроксильных радикалов на молекуле фермента после удаления восстановителя 69
-
Модификация активного центра РДФ-азы спин-меткой .. 73
-
Модификация РДФ-азы N-этилмалеинимидом с последующим спин-мечением 75
Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ РИБУЛ030-1,5-ДИФ0СФАТКАРБ0КСИЛАЗЫ
ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЯХ 83
4.1. Исследование спин-меченой РДФ-азы иммобилизованной
на силикагеле, активированном глутаровым альдегидом ..83
4.2. Использование иммобилизованных препаратов РДФ-азы
для поглощения СОр из воздуха 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97
ВЫВОДЫ 102
ЛИТЕРАТУРА 104
Введение к работе
Центральную роль в процессе фиксации углекислого газа при фотосинтезе, как известно играет рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксила-за ( РДФ-аза, КФ.4.1.1.39 ) - фермент осуществляющий две важнейшие реакции в метаболизме растений : реакцию карбоксилирования рибулозо-1,5-дифосфата ( РДФ ) до 2-х молекул 3-фосфорноглицери-новой кислоты ( 3-ФГК ) ( фотосинтез )-и окисление РДФ до одной молекулы 3-ФГК и одной молекулы 2-фосфогликолата ( фотодыхание ) (9).
Изучение структуры активного центра РДФ-азы и механизма его действия позволит целенаправленно воздействовать на соотношение карбоксилазной и оксигеназной реакций этого бифункционального фермента. Несмотря на интенсивное изучение структурной организации РДФ-азы различными методами, до сих пор не выяснена роль малых субьединиц в ферментативной реакции (42). Остается неясным вопрос о конформационных изменениях активного центра в процессе катализа, то есть неизвестно изменяется ли структура активного центра при изменении четвертичной структуры РДФ-азы. Совершенно неисследовано взаимодействие субьединиц фермента с субстратами.
Исходя из этого, целью данной работы явилось :
Исследование поведения РДФ-азы в растворе и в комплексе с субстратами и активатором, измерение времени корреляции макромолекулы фермента.
Изучение конформационной подвижности субьединиц РДФ-азы при взаимодействии с субстратами и активатором.
Селективная модификация S Н -групп белка спин-метками и определение с помощью метода ЭПР их чувствительности к связыванию субстрата и активатора ферментом.
Модификация активного центра РДФ-азы спин-меткой и изуче- ниє конформационных изменений в каталитическом центре при взаимодействии фермента с субстратом и активатором.
Для решения поставленных задач использовали метод спиновых меток (I), позволяющий следить за микроокружением модифицированных групп, а также за поведением самой макромолекулы.
Использованный метод позволил получить информацию о конформационных изменениях в макромолекуле РДФ-азы и её субьединиц при взаимодействии с субстратами и активатором. С помощью спин-меток было выявлено два типа SH~rPynn> отличающихся характером белкового окружения. По зависимости параметров спектров ЭПР спин-меченой РДФ-азы от вязкости среды было определено время корреляции белка. Показано, что отсутствие малых субьединиц приводит к образованию высокомолекулярных агрегатов больших субьединиц, что позволяет судить о роли малых субьединиц, как стабилизаторов четвертичной структуры фермента.
С помощью спин-метки, введенной в активный центр фермента были зарегистрированы конформационные перестройки активного центра РДФ-азы при взаимодействии фермента с субстратом и ионом М g , результатом которых явилось изменение электронной структуры фрагмента иминоксильного радикала.
При анализе спектров ЭПР использовали модель анизотропного быстрого вращения радикала относительно макромолекулы белка или сравнивали экспериментальные спектры с расчетными теоретическими спектрами (б, 92). Использование модели анизотропного быстрого вращения радикала относительно макромолекулы белка позволило получить количественные характеристики, такие как угол переориентации нитроксильного радикала и время корреляции белка.
Изучение структуры и функции РДФ-азы имеет важное практическое значение, в связи с возможностью использования этого фермента, как активного элемента систем очистки воздуха от углекислого газа. Исходя из этого, исследовались с помощью метода спин-метки иммобилизованные на неорганическом носителе препараты РДФ-азы. Был подобран оптимальный носитель и условия для иммобилизации РДФ-азы и на основе иммобилизованного фермента создана долговременная система очистки воздуха от углекислого газа.
