Содержание к диссертации
Введение
Глава I. СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОБЪЕКТОВ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ 14
1.1. Динамика возбужденных состояний в пигментных матрицах 14
1.2. Светособирающий аппарат красных и сине-зеленых водорослей 24
1.2.1. Состав и структура фикобилисом 24
1.2.2. Направленный перенос энергии возбуждения по фикобилиновым пигментам в фикобилисомах 29
1.3. Первичные процессы фотосинтеза высших растений... 35
1.3.1. Состав и структура фотосистемы I 37
1.3.2. Сопряжение переноса энергии возбуждений по светособирающим пигментам фотосистемы I и захват ее реакционными центрами 41
1.4. Первичные процессы фотосинтеза у пурпурных бактерий 44
1.4.1. Состав, структура и функционирование све-тособирающей антенны у пурпурных фотосинте-зирующих бактерий 45
1.4.2. Состав и строение реакционных центров пурпурных фотосинтезирующих бактерий 50
1.4.3. Захват энергии возбуждения и разделение зарядов в реакционных центрах 51
1.5. Факторы, усложняющие исследование первичных процессов фотосинтеза при использовании метода пикосекундной спектроскопии 56
Глава II. ПРИБОРЫ И МЕТОДИКИ ИЗМЕРЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ СТАДИЙ ФОТОСИНТЕЗА. МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОБЪЕКТОВ .
2.1. Пикосекундный абсорбционный спектрометр на базе параметрических генераторов света и ЭВМ 64
2.2. Методика выделения фотосинтезирующих объектов 73
2.2.1. Выделение хроматофоров пурпурных бактерий..73
2.2.2. Выделение фотосистемы I из хлоропластов высших растений 73
2.2.3. Выделение фикобилисом из красной водоросли Porphyridium omentum 74
Глава III. ИССЛЕДОВАНИЕ ПИКОСЕКУНДНЫХ СТАДИЙ ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ ВОЗБУЖДЕНИЙ ПО СВЕТОСОБИРАЮЙМ ПИГМЕНТАМ И ЗАХВАТА. ЕЕ РЕАКЦИОННЫМИ ЦЕНТРАМИ
3.1. Исследования сопряжения переноса энергии с разделением зарядов и аннигиляции возбуждений в фотосинтетическом аппарате пурпурных бактерий методом пикосекундной абсорбционной спектроскопии 76
3.2. Методика прямого измерения кинетики фотоокисления димера реакционного центра в хроматофорах методом дифференциальной пикосекундной спектрофотометрии 99
3.3. Исследование переноса возбуждений по пигментам фикобилисом методом лазерной дифференциальной пикосекундной. спектрофотометрии 108
3.4. Перенос энергии возбуждения от антенны на реакционный центр Р700 в пигмент-белковом комплексе фотосистемы I 121
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 138
ПРИЛОЖЕНИЕ . , 176
П.І. Программа для математического моделирования кинетических кривых экспонентами на микро-ЭВМ "Электроника ДЗ-28" .177
П.2. Программа на языке QUASIC для моделирования дифференциального спектра при одновременном сдвиге и выцветании основной полосы поглощения в хроматофорах пурпурных бактерий 180
- Динамика возбужденных состояний в пигментных матрицах
- Пикосекундный абсорбционный спектрометр на базе параметрических генераторов света и ЭВМ
- Исследования сопряжения переноса энергии с разделением зарядов и аннигиляции возбуждений в фотосинтетическом аппарате пурпурных бактерий методом пикосекундной абсорбционной спектроскопии
Динамика возбужденных состояний в пигментных матрицах
Проблема миграции энергии возбуждения была затронута в классических работах (Emerson, Arnoia, 1932.).
-В них предложена концепция фотосинтетической единицы (ФСЕ), т.е. высказано, что лишь часть Хл и Бхл фотосинтетического аппарата участвует в фотохимических трансформациях, а основная масса пигментов обеспечивает поглощение и перенос световой энергии к центрам фотохимической трансформации. Общая схема быстрого и эффективного переноса энергии по ССА и захват ее РЦ невызывает сомнений, но конкретные механизмы миграции и захвата энергии возбуждения являются предметом сегодняшних исследований и дискуссий. Концентрация Хл и других пигментов в ФСЕ варьирует в промежутке между значениями 0,1 М - 0,5 М, что соответствует переходным экспериментальным условиям от слабого к сильному взаимодействию (Клейтон, 1984). Поэтому при описании миграционных процессов теоретики должны рассматривать несколько возможных механизмов переноса .энергии возбуждений.
1) Резонансный перенос энергии возбуждений: а) индуктивно-резонансный (Ферстеровский перенос), б) перенос энергии делока-лизованными возбуждениями (например - экситон), в) обменно-резо-нансный перенос.
2) Перенос энергии электрическими зарядами, или полупроводниковым механизмом. В этом случае энергия возбуждения переносится разделенными зарядами (электроном и дыркой).
Резонансный перенос энергии возбуждений применяется при описании миграции энергии в ССА, а полупроводниковый механизм - при разделении и стабилизации разделенных зарядов в РЦ.
class2 . ПРИБОРЫ И МЕТОДИКИ ИЗМЕРЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ СТАДИЙ ФОТОСИНТЕЗА. МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОБЪЕКТОВ class2 .
Пикосекундный абсорбционный спектрометр на базе параметрических генераторов света и ЭВМ
Пикосекундный абсорбционный спектрометр отличается возможностью плавной перестройки в широком диапазоне частоты возбуждающего излучения и высокой степенью автоматизации процесса измерения и обработки данных. Эти два обстоятельства позволяют проводить эксперименты с широким классом объектов при селективном возбуждении и достичь высокой точности измерений абсорбционных изменений (до 2.КГ опт.ед.) (Гадонас и соавт., 1981; Данелюс и соавт., 1982).
В качестве источника возбуждающего излучения применялся оптимизированный ППГС на кристаллах ЩР. Область спектральной пере-стройки.-данного ППГС перекрывает длины волн от 330 до 1200 нм. Применение ППГС в канале возбуждения пикосекундного спектрометра в настоящее время является, по-видимому, наиболее приемлемым, поскольку плавная перестройка в широкой области может проводиться быстро и без замены элементов установки.
В канале зондирования могут использоваться ППГС на кристалле LiUbO-j или источник пикосекундного континуума, представляющий собой кювету с тяжелой водой. Использование ППГС в канале зондирования является более рациональным. Во-первых, излучение ППГС отличается более высокой стабильностью энергетических, спектральных и временных характеристик по сравнению с пикосекундным континуумом. Во-вторых, с помощью ППГС перекрывается более широкий спектральный диапазон, включающий ближний УФ и ИК диапазоны... И в-третьих, спектральная яркость и монохроматичность излучения ППГС на несколько порядков выше по сравнению с континуумом. Это позволяет работать без монохроматора и применять для регистрации полупроводниковые фотодиоды. Они менее чувствительны по сравнению с ФЭУ, но имеют большой динамический диапазон, меньший разброс параметров и работают в ближней ЙК области (до 1,8 мкм).
Если преимущество использования ППГС для исследования кинетических и световых (зависимость изменения поглощения от энергии возбуждающих импульсов) зависимостей в выбранных точках спектра не вызывает сомнений, то для измерения дифференциальных спектров нестационарного поглощения ППГС менее пригоден. При перестройке длины волны, особенно в видимом диапазоне, меняется расходимость пучка и происходит пространственный снос зондирующего пучка. Поэтому трудно сохранить идентичные условия эксперимента при зондировании в различных спектральных диапазонах. Это может внести дополнительную систематическую ошибку. Использование для зондирования пикосекундного континуума дает возможность проводить измерения дифференциальных спектров в области 400 - 1200 нм.
Оптическая часть дифференциального абсорбционного спектрометра состоит из оптической системы сведения зондирующего и возбуждающего пучков, кюветы с объектом, оптической линии задержки, ослабителя, монохроматора, электромеханического затвора и фотодатчиков. Кроме того, оптическая часть включает разделительные пластинки, зеркала, линзы для фокусировки возбуждающего и зондирующего пучков, оптические фильтры. Линия задержки, ослабитель и монохроматор позволяют по команде ЭВМ проводить изменения трех параметров: временной задержки, интенсивности возбуждающего света и длины волны зондирования. Электромеханический затвор позволяет перекрывать канал возбуждающего света и измерять оптическое пропускание образца как с возбуждением так и без него. Применение затвора исключает ряд ошибок, связанных с медленным дрейфом параметров как образца, так и установки.
Исследования сопряжения переноса энергии с разделением зарядов и аннигиляции возбуждений в фотосинтетическом аппарате пурпурных бактерий методом пикосекундной абсорбционной спектроскопии
В середине семидесятых годов появились первые работы по применению пикосекундной спектроскопии в исследованиях первичных процессов фотосинтеза. Пикосекундная абсорбционная спектроскопия применялась для исследования процесса разделения зарядов и дальнейшего переноса электрона по электроннотранспортной цепи в выделенных реакционных центрах. Флуоресцентная методика была особенно плодотворна при описании миграции энергии возбуждения в светособирающей антенне фотосинтезирующих объектов. Флуоресценцию самого реакционного центра, как правило, довольно трудно зарегистрировать, поскольку она незначительна и спектрально слабо отличается от того или иного компонента антенны. С помощью стационарных флуоресцентных измерений можно оценить эффективность переноса энергии на реакционные центры, выяснить последствия прекращения такого переноса и исходя из этого, определить (косвенным путем) эффективность захвата световой энергии реакционными центрами. Но эксперименты такого рода следует интерпретировать с осторожностью, поскольку нельзя предполагать априори, что реакционный центр перестает быть эффективной ловушкой для квантов возбуждения в состоянии, когда не может осуществляться нормальный фотохимический процесс (Клейтон, 1984).
В настоящее время, благодаря развитию методики абсорбционной пикосекундной спектроскопии (Гадонас и соавт., IS8I; Данелюс и соавт., 1982), появилась возможность прямого экспериментального исследования взаимодействия антенны с реакционным центром на различных фотосинтезирующих объектах. Абсорбционная пикосекунд-ная спектроскопия имеет существенное преимущество перед флуоресцентной методикой потому, что она позволяет регистрировать все стадии как переноса возбуждений по пигментным антеннам, так и переноса электронов по молекулам реакционного центра. И что особенно важно - с помощью абсорбционной пикосекудной спектроскопии удается в одном эксперименте наблюдать за спектрально-кинетической картиной и. стехиометрией исчезновения сигналов, связанных с антенными молекулами, и появлением сигналов, характерных для разделения зарядов в центрах. Это позволяет выделять кинетику прямого переноса энергии на реакционный центр из многокомпонентной кинетики дезактивации возбуждений в светособирающей антенне и исследовать свойства этого процесса.
Для реализации этого преимущества необходимо выполнить следующие наиболее важные условия:.а) обеспечить селективное возбуждение фотосинтезирующих препаратов в видимой и ближней инфракрасной областях спектра; б) обеспечить высокую чувствительность для измерения малых (около 1%) изменений абсорбции на фоне исходного поглощения образца порядка одной оптической единицы; в) обеспечить возможность работы с достаточно слабыми пикосекундными возбуждающими импульсами, чтобы. исключить нелинейные процессы, возникающие в случае мощных лазерных импульсов и искажающие результаты измерений (см. обзор Breton, Geacintov, 1980). Перечисленные условия были выполнены при создании дифференциального спектрофотометра с-пикосекундным временным разрешением на основе параметрических генераторов света на кафедре астрономии и квантовой электроники Вильнюсского государственного университета (Гадонас и соавт., 1981; Данелюс и соавт., 1982).
