Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Общие представления о протеазах и их роли в биологических процессах 9
2.1.1. Протеазы 9
2.1.2. Протеазы: функции в нормальных и патологических процессах 9
2.1.3 Про-протеинконвертазы: роль в нормальных и патологических процессах 10
2.2. Роль протеаз в вирусных заболеваниях 10
2.2.1. Механизм проникновения вирусов внутрь клеток 10
2.2.2. Вирус Лихорадки Западного Нила 11
2.2.3. Протеиназа NS3 - роль в жизненном цикле флавивирусов 12
2.3. Роль протсолиза в бактериальных инфекционных
заболеваниях 13
2.3.1. Бинарные бактериальные токсины 13
2.3.2. Токсины сибирской язвы 15
2.3.3. Связывание РА с клетками мешенями 16
2.3.4. Сборка токсина и эндоцитоз 16
2.3.5. Транслокация EF/LF 18
2.3.6. Ферментативная активность 20
2.4. Роль центросом и металлопротеиназы МТ1-ММР в хромосомной нестабильности и туморогенезе 20
2.4.1. Матриксная металлопротеиназа мембранного типа МТ1-ММР 21
2.4.2, Центросома - органелла, отвечающая за генетическую стабильность 22
3. Материалы и методы 24
3.1. Реагенты 24
3.2. Антитела, белки и клеточные линии 24
3.3. Разделение цитоплазматической и ядерной фракций 26
3.4. Расщепление клеточного МЕК1 интернализованным LF 27
3.5. Определение цитотоксичности LF 27
3.6. Расщепление про-протеинконвертазами РА83 28
3.7. Интернализация биотин-меченых РА и LF 29
3.8. Иммунофлуоресцентная микроскопия 30
3.9. in silico моделирование 30
3.10. Клонирование генов и получение рекомбинантных плазмид 31
3.11. Экспрессия и очистка белков 31
3.12. Расщепление протеиназой NS3 белковых субстратов 33
3.13. Гидролиз пептидов протеиназой NS3 33
3.14. Определение протеолитической активности NS3 с помощью флюоресцентных пептидов 34
3.15. Мутагенез и трансфекция клеток 35
3.16. Получение рекомбинантного лентивирусного вектора и сборка вируса 36
3.17. Инфекция рекомбинантным лентивирусом линии клеток 184В5 и получение клонов 37
3.18. Определение хромосомной нестабильности 38
3.19. Модель рака молочной железы в иммунодефицитных (nude) мышах 39
4. Результаты 40
4.1. Активация и эндоцитоз летального токсина сибирской язвы 40
4.1.1. Расщепление РА83 про-протеинконвертазами 40
4.1.2. Эндоцитоз и расщепление РА 41
4.1.3. Расщепление Mekl интернализованным LF 43
4.1.4. Интернализация смешанных РА83-РА63 гептамеров мышиными макрофагами 45
4.1.5. Иммунофлуоресцентная микроскопия 47
4.2. Характеристика NS3 протеиназы из вируса Лихорадки
Западного Нила 48
4.2.1. NS3 расщепляет сайт фурина в белковых субстратах 48
4.2.2. Вероятные белки-мишени NS3 протеиназы в клетках хозяина 51
4.2.3. Серпины и пептиды на основе D-аргинина как ингибиторы NS3 55
4.3. Онкогенный эффект МТ1-ММР и гидролиз перицентрина 55
4.3.1. Анализ пептидов, содержащих сайт узнавания МТ1-ММР из перицентрина человека, собаки и мыши 55
4.3.2. Расщепление D948G мутанта мышиного перицентрина МТ1-ММР 58
4.3.3. Определение хромосомной нестабильности в эпителиальных клетках молочной железы человека 184В5 60
4.3.4. Модель рака молочной железы в иммунодефицитной (nude) мыши 61
5. Обсуждение результатов 63
5.1. Альтернативный механизм активации и эндоцитоза летального токсина сибирской язвы 63
5.2. Белковые субстраты и ингибиторы NS3 протеиназы из вируса Лихорадки Западного Нила 66
5.3. Роль МТ1-ММР в хромосомной нестабильности и онкогенезе 61
6. Выводы 72
7. Список литературы
- Протеазы: функции в нормальных и патологических процессах
- Матриксная металлопротеиназа мембранного типа МТ1-ММР
- Клонирование генов и получение рекомбинантных плазмид
- Эндоцитоз и расщепление РА
Введение к работе
Протеолиз и участвующие в нем протеиназы регулируют важнейшие этапы жизнедеятельности и метаболизма клетки. Протеиназы важны для всех живых организмов, включая вирусы, бактерии и эукариотические организмы. Кроме того, протеолиз является неотъемлемой частью, а в ряде случаев и причиной многих патологических процессов. Так вирулентные протеазы играют важную роль в инфекционных заболеваниях, вызываемых бактериями и вирусами. Многие вирусы, такие как ВИЧ, гепатит С, вирусы Лихорадки Западного Нила, Желтой Лихорадки, полиомиелита и гриппа содержат гены протеиназ, необходимые для жизненного цикла вируса, преодоления механизмов клеточной защиты и контроля над метаболизмом клеток. Секреторные протеиназы патогенных бактерий зачастую являются их важнейшими вирулентными факторами. Протеиназы активируют белковые токсины бактерий. Абнормальный протеолиз характерен для роста и метастазирования злокачественных опухолей.
Цель нашей работы состояла в исследовании роли фуриноподобных протеиназ и металлопротеиназы МТ1-ММР в патологических процессах.
Первой задачей нашей работы являлось исследование взаимодействия человеческих фуриновых протеиназ с транспортными белками и ферментами, определяющими токсичность летального токсина сибирской язвы. Эта система включает: токсин сибирской язвы, рецепторы токсина, находящиеся на поверхности человеческих клеток, и человеческие фуриновые протеиназы, необходимые для процессинга компонентов токсина и его последующей интернализации человеческой клеткой.
Второй задачей было изучение свойств вирусной фуриноподобной протеиназы NS3, которая играет важную роль в инфекционном механизме вируса Лихорадки Западного Нила. Для изучения двухкомпонентной сериновой протеиназы, кодируемой геномом вируса, мы использовали рекомбинантную протеиназу, модельные белки и субстраты, что позволило нам избежать работы с высокоинфекционным и опасным вирусом.
Изучение протеолитического механизма, определяющего онкогенный эффект матриксной металлопротеиназы МТ1-ММР, стало третьей задачей нашего исследования. Нами были идентифицированы новые внутриклеточные белковые субстраты мембранной металлопротеиназы МТ1-ММР. В результате МТ1-ММР зависимого внутриклеточного гидролиза центросомальных белков возникают нарушения митотического веретена деления, что приводит к генетической нестабильности, хромосомным аберрациям и анеуплоидии. Анеуплоидия, по современным представлениям, является одним из главных факторов злокачественной трансформации клеток.
Важность протеолиза в патологических процессах несомненна, и по мере увеличения количества информации в периодической научной литературе только продолжает расти. Понимание того, как функционируют протеиназы в живых организмах, способствует разработке новых методов детекции, прогноза и лечения многих заболеваний. Идентифицированные в данной работе свойства и функциональные параметры фуриноподобных протеиназ и мембранной металлопротеиназы МТ1-ММР не были известны ранее. Полученные нами данные могут быть использованы при создании новых эффективных и безопасных ингибиторов сибирской язвы, ряда вирусных заболеваний и злокачественных новообразований.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Протеазы: функции в нормальных и патологических процессах
Общие протеолитические механизмы используются вирусами для проникновения в клетку, и сходные протеазы задействованы в репликации вирусного генома. Покрытые мембраной вирусы, такие как ВИЧ, Эбола вирус, Influenza H5N1 и флавивирусы (например: вирусы гепатита С, Денге и Лихорадки Западного Нила), обычно содержат один или несколько мембранносвязанных гликопротеинов. Эти гликопротеины отвечают за прикрепление вируса к клеточным рецепторам и слияние мембран клетки с мембраной вирусной оболочки. В ряде случаев, одна и та же молекула отвечает за обе функции, и рецепцию и слияние мембран (например, гемагглютинин вируса гриппа А), иногда эти функции выполняют разные гликопротеины, что характерно, например, для семейства альфавирусов. Гликопротеины вирусной оболочки способны взаимодействовать с поверхностными рецепторами клеток. Протеиназы, чаще всего PC, протеолизуют вирусный гликопротеин. Адсорбировавшись на клеточной поверхности, вирионы интернализуются за счет эндоцитоза и оказываются локализованными в эндоцитозных визикулах. После закислення эндосом происходят конформационные изменения гликопротеинов. Эти изменения происходят только после акта протеолиза. Активация гликопротеинов необходима для слияния оболочки вириона с мембраной хозяйской клетки. Слияние вирусной оболочки, либо с цитоплазматической, либо с эндосомальной мембранами, обеспечивает доставку вирусного генома в цитозоль инфецированной клетки.
Вирус Лихорадки Западного Нила (WNV) - это арбовирус, относящийся к семейству Flaviviridae, переносчиком которого являются комары. Кроме WNV в семейство флавивирусов входят: вирус желтой лихорадки, Денге вирус, вирус гепатита С, вирус омского энцефалита и другие родственные вирусы. Сферический, окруженный оболочкой капсид вируса, имеет диаметр около 50 nm и содержит позитивную одноцепочечную РНК, кодирующую в одной рамке считывания полипептид-предшественник, длиной приблизительно 3,400 аминокислотных остатков. Вирусная РНК длиной 11 kb траснлируется в полипротеин, состоящий из предшественников трех структурных белков (С, М и Е) и семи неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, и NS5) [6]. В процессинге полипротеина принимают участие протеиназы клетки-хозяина (фурин и сигнальная пептидаза), а также вирусная сериновая протеиназа NS3 [4, 7] (Рис.1). NS3 или флавивирин, это трипсиноподобная протеиназа размером 184 аминокислотных остатка. NS3 протеиназа необходима для созревания вириона. Активность NS3 зависит от присутствия кофактора, вирусного белка NS2B. Протеиназа способна автопротеолитически выщепляться из последовательности вирусного полипротеина и гидролизовать связи между белками: NS2AjNS2BNS3J,NS4A. Почти все флавивирины имеют высокую гомологию аминокислотной последовательности, что может говорить о структурной гомологии.
Лихорадки Западного Нила, содержащего каталитическую триаду активного центра (His51, Asp75, Ser135), имеет гомологию более 70% с NS3 белком вируса Денге, на основе чего можно предполагать, что NS3 протеиназы в различных флавивирусах выполняют похожие функции.
Несмотря на то, что вирусные субстраты NS3 протеиназы изучены довольно детально, остается неизвестным, расщепляет ли NS3 клеточные белки, и если да, то какой вклад это может вносить в патогенез вирусной инфекции.
Важными вирулентными факторами патогенных микроорганизмов являются бактериальные токсины. Многие бактериальные токсины относятся к так называемым бинарным токсинам. Наиболее известными и изученными токсинами являются: нейротоксин бутулизма, BoNT (Clostridium botulinum) [8], Clostridium botulinum C2 токсин [9], тетанотоксин, TeNT (Clostridium tetani) [10, 11], холератоксин (Vibrio cholerae) [12], дифтерийный токсин, DT (Corynebacterium diphtheriae) [13, 14], эдема и летальный токсины сибирской язвы (Bacillus anthracis) [15], Clostridium difficile токсин (CDT), Clostridium perfringens iota (i) toxin, Clostridium spiroforme токсин (CST).
Данные токсины являются бинарными или "А-В" токсинами, так как они состоят-из двух субъединиц. Интоксикация начинается со специфического связывания "В" - субъединиц с рецепторами клеток мишеней. Затем следует ограниченный протеолиз "В" - субъединиц, приводящий к формированию на клеточной поверхности "В" олигомеров. "В" олигомер-рецепторныи комплекс затем служит стыковочной платформой, отвечающей за связывание и в дальнейшем, транслокацию в цитозоль "А"-субъединиц токсина, обладающих ферментативной активностью. Транслокация токсичных субъединиц происходит через мембрану закисленных эндосом. Попав в цитозоль, "А"-субъединицы оказывают токсическое действие на клетку, ингибируя нормальные клеточные функции:
1. ADP-рибозилирование. MoHO-ADP-рибозилирование G-актина токсином Clostridium botulinum С2 [16], приводящее к разрушению цитоскелета и смерти клеток; дифтерийный токсин катализирует ADP-рибозилирование эукариотической аминоацил-трансферазы II (EF-2), таким образом блокируя процесс трансляции белков [17].
2. Протеолиз белков, выполняющих важную роль в физиологических процессах клетки.
Тетанотоксин (TeNT) и нейротоксин бутулизма (BoNT) гидролизуют пресинаптический белок синаптобревин 2, что приводит к блокаде высвобождения нейротрансмиттеров из синаптических везикул и таким образом нарушается проведение нервного импульса [10]. Протеолиз киназ митоген-активируемой протеинкиназы (МАРКК) летальным токсином (LeTx) Bacillus anthracis ингибирует клеточный сигналинг [18].
3. Увеличение уровня внутриклеточного циклического AMP, что приводит к отеку и иммуносупрессии. Примерами таких токсинов являются холерный токсин и эдема токсин (EdTx) Bacillus anthracis [19].
Матриксная металлопротеиназа мембранного типа МТ1-ММР
Центросомы, это маленькие немембранные органеллы (1-2 им в диаметре), обычно локализованные в непосредственной близости около ядра. Они состоят из двух перпендикулярных друг другу центриолей, окруженных перицентросомальным материалом (скопление белков, выполняющих регуляторную функцию). Нормальное функционирование центросом необходимо для организации цитоскелета и деления клеток [76, 77]. Удвоение центросом происходит только один раз в течение клеточного цикла, и этот процесс жестко зарегулирован. Во время митоза две центросомы располагаются в полюсах биполярного веретена деления, являясь его центрами организации и регуляции. Формирование биполярного веретена исключительно важно для правильного разделения хромосом между двумя дочерними клетками. В результате митоза обе клетки получают равное количество хромосом и имеют одинаковый генотип.
Наличие в клетке более чем двух центросом (амплификация центросом) приводит к нарушению митоза; формируется многополярное веретено деления, что значительно увеличивает вероятность ошибок разделения хромосом (хромосомная нестабильность) [78, 79]. Амплификации центросом частое явление почти во всех типах рака и считается наиболее важным фактором хромосомной нестабильности в раковых клетках [77, 80, 81]. Хромосомная нестабильность, вызванная амплификацией центросом, приводит к образованию и развитию опухолей [82-84].
Апротинин, iV-posyl-L-Lys-CHO, ингибитор катепсина В [L-3-/raw.s-(propylcarbarnoyl)oxirane-2-carbonyl]-L-Ile-L-Pro и [L-3rans-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl]-L-Ile-L-Pro метиловый эфир, а так же Boc-QAR-AMC (где Вое, t-бутоксикарбонил и АМС, 7-амино-4-метилкумарин) пептидные субстраты, а также все основные реагенты, за исключением перечисленных ниже, были приобретены в Sigma (St. Louis, МО, USA). Серпины (а 1-антитрипсин и а 1-антитрипсин вариант Портланд), пептидный субстрат Z-RR-AMC (где Z, бензилоксикарбонил) и ингибиторы Boc-D-Я-тозил-ОН и dec-RVKR-cmk (где dec, деканоил и cmk, хлорметилкетон) приобретены в Calbiochem (San Diego, СА, USA). Boc-RVRR-AMC, Pyr-RTKR-AMC (где Руг, пироглутаминовая кислота) и Boc-AGPR-AMC пептидные субстраты, были куплены в American Peptide (Sunnyvale, СА, USA). МВР (основной белок миелина) был приобретен в Biodesign (Saco, ME, USA). IPTG (isopropyl /?-Dhiogalactoside) приобретен в Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). EZ-link sulfo-NHSLC-biotin куплен в Pierce (Rockford, IL, USA). Олиго-О-аргининовые пептиды были получены от Dr. Ziwei Huang (Burnham Institute).
РА83, РА63, LF дикого типа и каталитически инертный Е687С мутант LF [85], а также козьи поликлональные антитела против РА приобретены в List Biological Laboratories (Campbell, CA, USA). Мышиные моноклональные антитела к РА МАВ8081 (клон ВАР0101), к LF МАВ8085 (клон BAL0105), кроличьи поликлональные антитела АВ815 к МТ1-ММР и пептидный гидроксаматный ингибитор GM6001
были приобретены в Chemicon (Temecula, СА, USA). Мышиные моноклональные антитела 5D1 к МТ1-ММР каталитическому домену были получены совместно с компанией Chemicon. Кроличьи антитела против Rab5B закуплены в Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, СА, USA). Мышиные моноклональные антитела против нуклеопорина nucleoporin р62 (клон 63), CD44 (клон 515) и кавеолина-1 (клон 2297), были из Becton-Dickenson (San Diego, СА, USA). Кроличьи антитела анти-Mekl, NT, полученные к N-концу МЕК1 (МАРКК1), были из Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Антитела к V5 эпитопу приобретены в Invitrogen (Carlsbad, СА, USA). Кроличьи поликлональные антитела 4b и М8 к С-концевому и N-концевому районам перицентрина, соответственно, были любезно предоставлены Dr. Stephen Doxsey и охарактеризованы ранее [86, 87].
Линия клеток глиомы человека U251 была детально охарактеризована в наших ранних работах [88, 89]. Мышиные макрофаго-подобные клетки RAW264.7 были взяты в АТСС (Manassas, VA, USA). Клетки выращивались в среде DMEM с добавлением 10% FBS (Gibco, Carlsbad, СА, USA) и пенициллина-стрептомицина (50 иг/мл). A PA83-SNKE-deltaFF-E308D мутант (не расщепляемый фурином вариант РА, в котором сайт расщепления фурина заменен последовательностью SNKE, и в котором, в дополнение, за счет мутаций E308D и deltaFF инактивированы два сайта протиназ [90]) был любезно предоставлен доктором Стивеном Лепплой, Dr. Stephen Leppla (NIDCR, NIH, Bethesda, MD, USA).
Клонирование генов и получение рекомбинантных плазмид
Реакция проводилась в буфере следующего состава: 10 мМ Tris-НС1, рН 8.0, 20% (v/v) глицерол, 0.005% Brij 35. Концентрация субстратов и фермента была равна 24 дМ и 10 нМ, соответственно. Конечный объем реакции составлял 0.1 мл. Начальные скорости реакции измерялись непрерывно при .ех (длина волны возбуждения) ЗбОнм и Хет (длина волны испускания) 465 нм на флуоресцентном спектрофотометре SpectramaxGemini ЕМ (Molecular Devices). Все измерения были проведены в трех повторах в ячейках 96-луночного планшета. Значения Km и cat определены по формуле: 1/Vo = Km/Vmax х 1/[S] + 1/Vmax, где V0 - начальная скорость реакции гидролиза субстрата, [S] - концентрация субстрата, VmaX -максимальная скорость реакции гидролиза и Кт - константа Михаэлиса-Ментен. Концентрация каталитически активной протеиназы определялась с помощью титрования активного центра ингибитором (апротинин) с известной концентрацией. Концентрация активной NS3 протеиназы была близка к 100% относительно общей концентрации белка.
Для определения констант ингибирования (Kj), NS3 протеиназу инкубировали в течение 60 мин при температуре 18С с повышающимися концентрациями ингибиторов. После этого в реакции добавляли субстрат Boc-RVRR-AMC и скорость гидролиза субстрата измерялась как описано выше. Константы ингибирования (Kj) ингибиторов с Kj, заметно уступающими концентрации фермента в реакции, определяли с использованием формулы: a = 1 - {([E]o + [I]o + i) - [([E]o + [I]0 + K{)2 - 4[E]0[I]o]1/2}/2[E]o, где a = Vj/Vo, V; - начальная скорость реакции при заданной концентрации ингибитора, Vo - начальная скорость при отсутствии ингибитора, [Е]о - конечная концентрация фермента и [1]0 - конечная концентрация ингибитора. Для конкурентных ингибиторов константу ингибирования (К;) определяли по уравнению Ченга-Прусова: Ki = IC5o/(l + [S]o/Km)[96]. Рекомбинантная плазмида pLPX7, содержащая ген мышиного перицентрина-2 была любезно предоставлена нам доктором Стивеном Докси. Плазмида содержала ген резистентности к бластицидину. Прямой и обратные олигонуклеотиды (5 CTCCGAGATGCCCTGAGGAGACTTCTAGGCCTGTTTGGGGACAC ACTGAAGGCAGC-3 и 5 GCTGCCTTCAGTGTGTCCCCAAACAGGCCTAGAAGTCTCCTCAGG GCACTCGGAG-3\ соответственно; позиции мутаций подчеркнуты) были использованы для PCR мутагенеза, целью которого было ввести точечную замену D948G в последовательность гена мышиного перицентрина. Наличие замены в мутантном гене было подтверждено ДНК сиквенированием.
Линия глиомы человека U251, трасфецированная исходной плазмидой pcDNA3.1 (контрольные клетки), клетки стабильно экспрессирующие рекомбинантную МТ1-ММР (МТ клетки) и клетки, в которых экспрессия МТ1-ММР стабильно репрессирована с помощью короткой интерферирующей RNA (siRNA) 5" GAAGCCUGGCUACAGCAAUAU-3 (siMT клетки), были получены и охарактеризованы ранее ([88, 97, 98]). Контролем служила 5"-GGUCCAUGCUGCAGAAAAACU-3 siRNA, так же как и siMT RNA синтезируемая с плазмидной матрицы. Обе siRNA последовательности были клонированы в плазмидный вектор psiLentGene-puromycin (Promega, Madison, WI). Контрольная siRNA не оказывала влияния на экспрессию гена МТ1-ММР в U251 клетках (результаты не показаны). Клетки выращивались в DMEM с добавкой 10% фетальной бычей сыворотки. Контрольные клетки, МТ и siMT клетки были дополнительно трансфецированы плазмидой pLPX7, содержащей гены дикого типа и D948G мутанта мышиного перицентрина-2. Бластицидин-устойчивые клетки были отобраны через 7 дней. Экспрессия рекомбинантного мышиного перицентрина была установлена с помощью Вестерн блоттинга клеточных лизатов, приготовленных из общей популяции бластицидин-устойчивых клеток. Для идентификации обоих, N-концевого и С-концевого фрагментов перицентрина, в эксперименте была использована смесь 4Ь и М8 антител. В дополнение, экспрессия перицентрина в трансфецированных клетках была подтверждена методом иммунофлуоресцентной окраски с последующей микроскопией. Ген МТ1-ММР использовался в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидов: 5 - CACCATGTCTCCCGCCCCAAGAC 3 и 5 GACCTTGTCCAGCAGGGAAC - 3\ прямого и обратного, соответственно. Полученный продукт был клонирован в вектор pLenti6/V5-DOPO (Invitrogen). Последовательность итоговой конструкции была подтверждена ДНК-сиквенированием.
Эндоцитоз и расщепление РА
В вирусном полипротеиновом белке-предшественнике, NS3 чаще всего гидролизует последовательности, содержащие положительно заряженные аминокислотные остатки в положениях Р1 и Р2 [111]. Эта субстратная специфичность характерна также для катепсина В и фурина [4, 112]. В наших экспериментах NS3 эффективно расщепляла фуриновые флуоресцентные субстраты Вос RVRR-AMC и Pyr-RTKR-AMC, в то время как эффективность расщепления субстрата катепсина В была существенно ниже (см. табл.1).
Константы Михаэлиса-Ментен, Vmax и cat/Km, для гидролиза этих субстратов приведены в таблице 1. Присутствие в позиции Р2 аминокислоты, отличной от положительно заряженных аргинина или лизина, делает субстрат устойчивым к гидролизу NS3.
В соответствии с гипотезой о фурино-подобной субстратной специфичности NS3, было показано, что NS3 протеиназа расщепляет фуриновый canrRKKR167jS168TS в последовательности РА83. Подобно фурину, гидролиз по этому сайту превращает белок РА83 в зрелую форму РА63 (Рис.10). В последовательности РА83 отсутствуют другие мотивы, которые могли бы расщепляться NS3.
Для того, чтобы подвердить способность NS3 протеолизовать последовательности из полипротеинового вирусного предшественника, которые чувствительны к протеолизу фурином, мы проанализировали гидролиз пептида K83TRHSRRSRRSL94 из ргМ белка вируса Лихорадки Западного Нила (сайт узнавания фурином подчеркнут).
Известно, что во время секреторного экспорта вирусных частиц гликопротеин вирусной оболочки ргМ расщепляется фурином [113, 114]. В результате этого расщепления образуется зрелый М белок, который необходим для последующей реорганизации Е-гликопротеина и инфекционности вируса. В ходе анализа мы гидролизовали пептид K83TRHSRRSRRSL94 протеиназой NS3, и затем определяли массу продуктов гидролиза с помощью MALDIOF масс-спектрометрии (рис.11).
Каталитическое количество NS3 протеолизовало пептид массой Da и приводило к образованию продукта К TRHSRR массой 941 Da. Таким образом мы установили, что расщепление происходит по R89S90 сайту. В качестве контроля NS3 гидролиза мы использовали A94INRZ)98STKQKKRGG107 пептид, содержащий известный сайт расщепления NS3 KRjGG107 в заякоренном капсидном С белке [115]. Пептидная последовательность A INRD S была модифицирована с помощью замены R98D, чтобы инактивировать второй сайт расщепления NS3 и таким образом избежать множественного гидролиза пептида. Как и предполагалось, NS3 протеиназа эффективно гидролизовала A94INRD98STKQKKR1GG107 пептид в ожидаемом г 105./-. 106 „„« R и сайте. После созревания вирусных белков и формирования вириона, NS3 протеиназа высвобождается из инфецированных погибших клеток [116]. Внеклеточная каталитически активная протеиназа может гидролизовать клеточные белки, и таким образом вносить собственный вклад в патогенез Лихорадки Западного Нила в дополнение к вирусной инфекции. Для того чтобы идентифицировать потенциальные белки мишени NS3, мы использовали программу для предсказания белков мишеней PoPS (http://pops.csse.monash.edu.au). Ранее с помощью этой программы в нашей лаборатории были предсказаны потенциальные белки-мишени, расщепляемые мембранной матриксной металлопротеиназы МТ1-ММР. Расщепление этих белков-мишеней далее было подтверждено непосредственно в экспериментах по гидролизу этих белков МТ1-ММР [97].
Если известна субстратная специфичность протеиназы, эта программа сканирует последовательности белков протеома человека и определяет участки последовательности, которые могли бы расщепляться протеиназой. Для использования PoPS мы сконструировали вырожденную матрицу Р4-Р4,последовательности узнавания NS3. Для этого каждой позиции было присвоено значение от -5 до +5, в соответствии со значением аминокислотного остатка в этом положении для протеолиза NS3.
