Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Проблема сворачивания белка 8
1.2. Модели сворачивания белка 11
1.3. Промежуточные состояния белковой молекулы, реализующиеся в процессе ее сворачивания 15
1.4. Переходное состояние и ядро сворачивания белка 20
1.5. Характеристика объекта исследования 28
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Материалы 34
2.2. Приборы, параметры и условия измерений 35
2.3. Биохимические методы 39
2.3.1. Экспрессия генов 39
2.3.2. Выделение и очистка белков 40
2.4 Физические методы исследования 41
2.4.1. Абсорбционная спектроскопия 42
2.4.2. Флуоресцентная спектроскопия 43
2.4.3. Круговой дихроизм 45
2.4.4. Сканирующая микрокалориметрия 47
Глава 3. Разработка подхода к анализу кинетических данных для белков с промежуточным состоянием на примере апомиоглобина 50
3.1. Экспрессия и выделение апомиоглобина и его мутантных форм 50
3.2. Выбор условий для равновесных и кинетических исследований апомиоглобина 54
3.3. Исследование равновесных свойств апомиоглобина при 11С,рН6.2 63
3.4. Исследование кинетики сворачивания/разворачивания апомиоглобина 65
3.5. Построение и анализ зависимостей констант скоростей сворачивания/разворачивания апомиоглобина от концентрации денатуранта 70
3.6. Анализ зависимости констант скоростей сворачивания/разворачивания от концентрации денатуранта в случае отсутствия загиба на ветви сворачивания 75
3.7. Построение зависимостей свободной энергии состояний апомиоглобина от концентрации денатуранта 77
Глава 4. Исследование мутантных форм апомиоглобина 81
4.1. Выбор аминокислотных замен для исследований ядра сворачивания апомиоглобина 81
4.2. Исследование равновесного процесса разворачивания мутантных форм апомиоглобина 84
4.3. Кинетическое исследование процессов сворачивания и разворачивания мутантных форм апомиоглобина 87
Заключение 93
Выводы 95
Список цитируемой литературы 97
- Промежуточные состояния белковой молекулы, реализующиеся в процессе ее сворачивания
- Приборы, параметры и условия измерений
- Выбор условий для равновесных и кинетических исследований апомиоглобина
- Исследование равновесного процесса разворачивания мутантных форм апомиоглобина
Введение к работе
Выяснение механизма спонтанного сворачивания белков является одной из важнейших задач биофизики. Известно, что многие болезни связаны с агрегацией или неправильным сворачиванием белка. Оба этих процесса могут быть следствием замедления скорости сворачивания белка или завязывания боковыми группами белка ненативных контактов в результате мутаций. Чтобы понять, чем определяется быстрое и правильное сворачивание полипептидной цепи в стабильную нативную функционирующую структуру, необходимо изучить влияние отдельных аминокислотных (а/к) остатков на различные стадии сворачивания белка. Путь сворачивания белков проходит через формирование переходных состояний и, в большинстве случаев, через образование наблюдаемых промежуточных состояний. В связи с этим для понимания механизма сворачивания белков необходимо исследование структурных и энергетических характеристик стабильных промежуточных и нестабильных переходных состояний. Однако такое исследование осложняется тем, что формирование ранних промежуточных состояний находится в миллисекундном временном интервале и, зачастую, не может быть измерено экспериментально методом «остановленного потока», хотя присутствие промежуточных состояний оказывает влияние на видимую константу скорости сворачивания белка. Для исследования же структуры переходных состояний необходимо знание скоростей всех этапов сворачивания и разворачивания белка в широком диапазоне концентраций денатуранта. Только в этом случае возможно оценить вклад отдельных остатков в процесс сворачивания белка, в частности, в ядро сворачивания белка, т.е. в структуру белка, образующуюся в переходном
состоянии и обеспечивающую последующее быстрое и правильное сворачивание белка в нативную структуру.
Данная диссертационная работа состоит из двух частей. Первая часть работы была посвящена разработке подхода, при помощи которого было бы возможно определять скорости отдельных переходов в белках с тремя состояниями. Целью второй части работы было исследование ядра сворачивания апомиоглобина, имеющего промежуточное состояние на пути сворачивания, которое проводили путем введения точечных замен аминокислотных остатков и изучение влияния данных замен на стабильность белка и скорость его сворачивания.
Диссертационная работа состоит из «Введения», четырех глав, «Заключения», «Выводов» и «Списка цитируемой литературы». Во «Введении» раскрывается актуальность области исследования и дается краткое описание задач исследования. Глава 1 посвящена анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований в области сворачивания белка. В главе 2 дано описание используемых материалов и методов. Глава 3 посвящена анализу кинетических данных апомиоглобина и разработке подхода, при помощи которого удалось разделить вклады различных процессов в скорость сворачивания данного белка. Глава 4 посвящена равновесному и кинетическому исследованию мутантных форм апомиоглобина и оценке их вклада в структуру переходного состояния (ядро сворачивания) апомиоглобина. Раздел «Заключение» содержит основные итоги работы. В конце диссертации приведены основные выводы из данной работы и список цитируемой литературы, включающий 148 наименований. Диссертация изложена на 112 страницах, содержит 22 рисунка и 4 таблицы.
«
Основные результаты диссертационной работы отражены в 16 печатных работах, в том числе 3 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Промежуточные состояния белковой молекулы, реализующиеся в процессе ее сворачивания
Проанализировав все имеющиеся данные по ненативным конформационным состояниям белковых молекул, Тэнфорд в 1968 году показал [Tanford, 1968], что в присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) большинство белков представляют собой полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи, тогда как более мягкие денатурирующие условия (низкие рН, высокие температуры, высокие концентрации некоторых солей) приводят только к частично денатурированным конформационным состояниям белковой молекулы, физико-химические свойства которых являются промежуточными между свойствами нативных и полностью развернутых белков.
Исследования кинетики ренатурации белка из полностью развернутого состояния показали [Kuwajima, 1976; Goldberg, 1983; Semisotnov, 1987], что первая стадия сворачивания белковой молекулы - формирование, по крайней мере, части вторичной структуры - происходит в интервале менее 10"2 секунд. То, что это время меньше мертвого времени большинства приборов, использующих технику «остановленного потока», и является причиной возникновения так называемого эффекта " взрывной фазы ". Наличие такой фазы было обнаружено в исследовании кинетики сворачивания целого ряда белков [Schreiber and Fersht, 1993; Munoz. 1994; Kay and Baldwin, 1996; Parker, 1997; Burns. 1998; Cavagnero, 1999; Tang, 1999; Parker and Marqusee, 1999; Laurents, 2000]. Возникающее на ранних стадиях сворачивания белка промежуточное состояние достаточно компактно, обладает высоким содержанием вторичной структуры и нативоподобной укладкой элементов вторичной структуры, но плотная упаковка боковых групп при этом практически отсутствует [Kim and Baldwin 1990; Clarke and Waltho 1997; Roder and Colon 1997]. Последующее формирование нативной структуры у разных белков может происходить за различные промежутки времени - от секунд до часов.
Существует несколько предположений о том, что происходит с белком во время первой быстрой ("взрывной") фазы сворачивания. Одно из предположений состоит в том. что формирование промежуточных состояний является результатом завязывания белком ненативных взаимодействий, то есть данные промежуточные состояния выступают в роли кинетических ловушек (лежат вне пути сворачивания), и только замедляют дальнейшее сворачивание в нативную структуру (Kiefhaber, 1995; Sosnick, 1994; Rumbley, 2001). Ан&таз литературных данных позволяет сделать вывод о том. что неправильно свернутые состояния обычно появляются на поздних стадиях сворачивания, на которых или медленные конформационные изменения - такие как цис/транс изомеризация пептидных связей (Nail, 1994; Odefey, 1995; Vanhove, 1996), дисульфидный обмен (Creighton, 1990; Weissman and Kim, 1992), диссоциация ненативных лигандов (Sosnick, 1994; Elove, 1994), или ненативные взаимодействия между стабильными субдоменами приводят к появлению больших кинетических барьеров. Также есть мнение, выдвинутое при исследовании белков рибонуклеазы А и цитохрома с, что вся первая фаза сворачивания представляет собой перераспределение ансамбля развернутых состояний и проходит без преодоления энергетического барьера (Sosnick, 1997; Parker and Marqusee, 1999). И, наконец, существует гипотеза, заключающаяся в том, что в результате первой фазы образуется промежуточное состояние (лежит на пути сворачивания), отделенное от развернутого состояния энергетическим барьером (Shastry and Roder, 1998).
Наиболее общий подход к исследованию кинетики сворачивания белка основывается на использовании устройств быстрого смешивания, таких как установки «остановленного потока» (stopped - flow) и «постоянного потока» (continuous - flow), которые позволяют инициировать сворачивание белка благодаря скачкообразному изменению состава растворителя. Предварительное разворачивание белка достигается денатурирующими условиями, т. е. высокими концентрациями денатурантов или экстремальными значениями рН.
Поскольку в кинетических экспериментах задача осложняется малыми временами жизни исследуемых интермедиатов, оптимальным подходом в данном случае явилось изучение структурных свойств равновесных промежуточных состояний в мягких денатурирующих условиях (кислые рН, умеренные концентрации гуанидингидрохлорида, повышенная температура). Выяснение природы частично денатурированных промежуточных конформационных состояний явилось предметом интенсивных исследований за последние 25 лет. Существенное значение в такого рода исследованиях имело использование многих экспериментальных методов, когда в процессе денатурации белка измерялось несколько структурных характеристик (например, содержание вторичной структуры, гидродинамических параметров и жесткости третичной структуры). Так, было обнаружено, что в умеренно денатурирующих условиях белковые молекулы приобретают ряд общих свойств, позволивших описать эти денатурированные формы как флуктуирующее состояние без уникальной пространственной структуры, но компактное и обладающее хорошо выраженной вторичной структурой [Dolgikh, 1981]. Эта промежуточная форма обладает необычной комбинацией свойств, присущих нативной и развернутой формам, и представляет собой особое физическое состояние белковой молекулы. Так, наряду с уже известными нативным и развернутым состояниями белка, было открыто новое состояние белковых молекул - равновесное состояние расплавленной глобулы. Тщательное исследование структурных свойств такого промежуточного состояния позволило прийти к следующим выводам: во-первых, гидродинамические размеры молекулы белка в таком состоянии мало отличаются от нативного (увеличение гидродинамического объема находится в пределах 50% от нативного) [Bychkova and Ptitsyn, 1993]; во-вторых, несмотря на то, что жесткость третичной структуры белка утеряна (отсутствует спектр кругового дихроизма ароматических групп и кооперативное температурное плавление), некоторые нативноподобные специфические внутримолекулярные контакты сохраняются [Dolgikh, 1981; Dolgikh, 1985]; в-третьих, элементы вторичной структуры находятся в тех же участках аминокислотной последовательности, что и в нативном состоянии [Baum, 1989]. Таким образом, чтобы удовлетворять названию "расплавленная глобула", промежуточное состояние белка должно быть глобулярным (в смысле компактности и наличия гидрофобного ядра) и "расплавленным" (в смысле отсутствия кооперативного плавления).
Приборы, параметры и условия измерений
Трансформированные и выращенные до определенной оптической плотности клетки E.coli BL 21 (DE 3) осаждались ультрацентрифугированием на центрифуге Beckman J2-21 (США). Разрушение клеток E.coli BL 21 (DE 3) и выделение белков из тел включений осуществляли с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonic Dismembrator 550 (США). Очистку белков проводили с использованием HPLC системы на обратнофазной колонке С18. Спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1601 (Япония). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 281 нм. Коэффициент экстинкции был принят равным А1смімг/мл = 0-88 для апомиоглобина дикого типа и для всех его мутантных форм, кроме белка с заменой Тгр 14Ala, для которого А1смімг/мл - 0.56. Коэффициенты экстинкции для апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм были определены в лаборатории физики белка, Института белка РАН, микрометодом по азоту [Jaenicke, 1974]. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301PC (Япония). Использовали стандартные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Длина волны возбуждающего света была выбрана 293 нм, где триптофановые аминокислотные остатки вносят основной вклад в спектр флуоресценции. Регистрация спектров испускания триптофановой флуоресценции проводилась в интервале 300-500 нм. Рабочая концентрация белка составляла 0.03 мг/мл. Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли на слектрополяриметре JASCO-600 (Япония).
Для измерений КД в дальней ультрафиолетовой (УФ) области использовали кюветы с длиной оптического пути 0.01 см. Концентрация белка для измерений дальнего КД составляла 1.0 мг/мл. Молярная эллиптичность [0] вычислялась по формуле [0]х=0х"МВО / їх, где 0. - измеряемая величина эллиптичности (в миллиградусах) на длине волны X; МВО - средний молекулярный вес остатка, вычисленный из аминокислотной последовательности; 1 - длина оптического пути (длина кюветы в миллиметрах); с - концентрация белка в мг/мл. Тепловая денатурация изучалась с помощью дифференциального адиабатического сканирующего микрокалориметра "Scal-1", оборудованном стеклянными цилиндрическими ячейками объемом 0.34 мл. Прибор разработан в группе термодинамики белка Института белка РАН. Скорость прогрева образца была фиксирована и равна 1 К/мин, точность измерения температуры составляла ±0.3 С. Все растворы перед измерениями уравновешивались диализом против 1 ОмМ Na-ацетатного буфера в течение ночи. Концентрация белка в растворе составляла 1 мг/мл. Кинетические эксперименты проводились с использованием спектрофлуориметра, состоящего из источника света (150W ксеноновая лампа), монохроматоров возбуждения и эмиссии (МДР-4, ЛОМО, Россия) и термостатируемой приставки «остановленного потока» (Unisoku Inc., Япония). Система регистрации включала в себя блок фотоэлектронного усилителя, интерфейс и персональный компьютер. Мертвое время прибора составляло 10 мс.
Кинетические измерения проводились в тех же условиях, что и равновесные исследования, при 11 С, рН 6.2. Конечная концентрация белка составляла 0.03 мг/мл. Начальная концентрация мочевины в экспериментах по сворачиванию ЛроМЬ составляла 5 М, в экспериментах по разворачиванию -ОМ. Исходный раствор белка смешивался с буфером, содержащим различные концентрации мочевины, с помощью приставки «остановленного потока» в соотношении 1:6. Длительность эксперимента составляла 15 секунд, каждая кинетическая кривая являлась результатом усреднения 3-6 независимых экспериментов. Исходная концентрация белка составляла 2 мг/мл; конечная концентрация белка в кювете после смешения - 0.03 мг/мл. Все полученные кинетические кривые зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции от времени I(t) описывались одно-экспоненциальной зависимостью: I(t) = a + b-exp (kobs), где а и b - параметры реакции, k0bs - наблюдаемая константа скорости, t- время. Все кривые обсчитывались при помощи программы Sigma Plot 8.0. Перед приготовлением растворов для измерений, исходные концентрированные растворы белков центрифугировали (с целью устранения возможных агрегатов) при скорости 12000 об/мин (на центрифуге Eppendorf 5415 D) при температуре 4С, в течение 5 минут, и затем фильтровали через фильтры Corning (Германия), с диаметром пор 0.20 мкм. Расчет доли промежуточного состояния: Сворачивание апомиоглобина происходит в две фазы. 1-ая быстрая фаза отвечает за формирование промежуточного состояния, возникающего за мертвое время прибора. 2-ая фаза, медленная, отражает сворачивание в нативную структуру из промежуточного состояния. Населенность промежуточного состояния пропорциональна значению интенсивности флуоресценции первой фазы сворачивания А(М). Параметр fi(M), соответствующий доле молекул в промежуточном состоянии, рассчитывался по формуле: где Аи(М) и Ai(M) - значения данного параметра для развернутого и промежуточного состояний, соответственно, полученные после экстраполяции базовых линий в область перехода.
Выбор условий для равновесных и кинетических исследований апомиоглобина
Для сравнения стабильности нативных состояний апомиоглобина (АроМЬ) и его мутантных форм было проведено калориметрическое изучение белков при рН 5.2, в условиях, где белок дикого типа характеризуется наличием жесткой упаковки, и в условиях реализации промежуточного состояния при рН 4.2. Как и предполагали, пиков теплопоглощения при рН 4.2 у всех белков не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии жесткой третичной структуры у белков в этих условиях. При рН 5.0 все мутантные белки имели пик плавления, кроме белка с заменой Тгр14А1а. Отсутствие пика теплопоглощения для данного мутантного белка указывает на то, что замена Тгр14 Ala приводит к сильной дестабилизации белка, и в этих условиях этот белок не имеет жесткой структуры. Для того чтобы найти условия, в которых Тгр14А1а имеет нативоподобную конформацию. было проведено температурное плавление данного белка при различных рН (Таблица 1а). Эти эксперименты показали, что пик, сходный по характеристикам с пиком теплопоглощения белка дикого типа, для мутанта Тгр14А1а появляется при рН 5.7 - 6.5. Для дальнейших измерений было выбрано рН6.2, где все изменения закончились. Поэтому плавление всех остальных белков было проведено уже при рН6.2. В таблице 16 представлены данные, полученные при плавлении белка дикого типа и его мутантных форм при рН6.2. Видно, что структура белка дикого типа (WT) проявляет большую устойчивость к температурной денатурации, и белок денатурирует при 62 С, тогда как температура денатурации всех исследованных мутантных форм белка ниже на 8-18 С в зависимости от введенной замены.
Далее, для того чтобы оптимально выбрать условия сравнительного изучения равновесных и кинетических свойств апомиоглобина и его мутантных форм, мы провели равновесное разворачивание АроМЬ WT при двух значениях рН: рН 5.7, обычно используемого в литературе [Cavagnero, 1999], и рН 6.2, где нативной конформацией обладает не только АроМЬ дикого типа, но и его наиболее дестабилизированная мутантная форма с точечной заменой Тгр 14 на Ala (как это следует из зависимости тепловой денатурации от рН). При обоих значениях рН АроМЬ находится в своей нативной конформации. Однако при рН 5.7 наблюдается дестабилизация нативной структуры, вызванная зависимостью от рН стабильности нативной структуры АроМЬ [Griko, 1988]. Такая зависимость от рН стабильности нативного состояния наблюдается для многих белков [Privalov, 1979]. В этой области рН титруются только гистидины, а конформационный переход в АроМЬ наблюдается при существенно более низких рН (между рН 4.8 и 4.0). когда при рН 4.2 образуется равновесное промежуточное состояние расплавленной глобулы [Hughson, 1990; Kay and Baldwin, 1996; Ellezer and Wright, 1996; Lecomte, 1999; Tcherkasskaya and Ptitsyn, 1999; Jamin, 2000]. Измерения были проведены при температурах 5С и 25С, как наиболее используемых в литературе [Griko, 1988; Hughson and Baldwin, 1989; Pace, 1990; Luo, 1997; Jamin and Baldwin, 1998; Nishimura, 2000], а также при 11 С, чтобы исключить, с одной стороны, возможное влияние холодовой денатурации, а с другой, не слишком ускорять процесс сворачивания белка.
Изменение свойств АроМЬ при его разворачивании мочевиной регистрировали методами триптофановой флуоресценции и кругового дихроизма в дальней УФ области. На рис. 4 представлены кривые разворачивания и сворачивания АроМЬ мочевиной, измеренные методом триптофановой флуоресценции. Из совпадения кривых прямого и обратного процессов можно сделать вывод о равновесности процессов сворачивания и разворачивания АроМЬ в данных условиях.
Результаты равновесного разворачивания АроМЬ мочевиной в различных условиях, тестируемые по триптофановой флуоресценции и спектрам КД в дальней УФ области, приведены на рисунках 5 а, б и в, г, соответственно. Видно, что при понижении температуры происходит сдвиг середины денатурационного перехода в сторону меньших концентраций мочевины, при этом при рН 6.2 этот сдвиг больше, чем для рН 5.7. Для того чтобы данные можно было сравнивать между собой, они были пересчитаны на долю свернутого состояния Ff (рис. 6 а, б). Для более точного определения базовых линий в конформационных переходах, наблюдаемых обоими методами, переходы были совмещены для каждой из температур и рН согласно работе [Кау and Baldwin, 1996]. Из рис. 6 видно, что, кроме сдвига середины переходов, при температуре 5С происходит уширение области перехода, что может свидетельствовать о влиянии холодовой денатурации на конформационный переход при данной температуре. При этом при рН 5.7 уширение перехода больше, чем при рН 6.2. При И С уширения переходов не наблюдается. Зная долю нативных и развернутых молекул белка при данной концентрации мочевины в переходе, можно рассчитать свободную энергию перехода из нативного в развернутое состояние ДО,ккал/моль (см. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ). Зависимость AG от концентрации мочевины в переходе для рН 6.2, 25С, полученная из данных по КД, представлена на рис. 7. Как видно из рисунка, она носит линейный характер.
Исследование равновесного процесса разворачивания мутантных форм апомиоглобина
С целью определения влияния мутаций на конформационную стабильность апомиоглобина были проведены эксперименты по равновесному разворачиванию мутантных белков мочевиной с использованием методов Тгр флуоресценции и КД в области поглощения пептидных связей. В качестве параметров, отражающих изменения на разных уровнях структурной организации белка, были выбраны интенсивность Тгр флуоресценции на длине волны 335нм и молярная эллиптичность на длине волны 222 нм. На рис. 19 представлены спектры кругового дихроизма в дальней УФ области апомиоглобина дикого типа (WT) и его мутантных форм в нативных условиях. Видно, что в зависимости от сделанной мутации меняется интенсивность спектров КД, однако их форма, характерная для полностью а-спирального белка, не меняется, кроме спектра для белка с заменой W14A. Изменение молярной эллиптичности, характеризующей содержание вторичной структуры в белке, в зависимости от концентрации мочевины представлено на рис. 20а,в. Видно, что изменения в спектрах КД, а, следовательно, и во вторичной структуре мутантных белков, начинаются при более низких концентрациях мочевины, чем для белка дикого типа (WT), т.е. их структуры дестабилизированы мутациями по отношению к действию мочевины. При этом, денатурационные переходы из нативного состояния в развернутое для мутантных белков становятся более широкими, т.е. менее кооперативными, чем для белка WT, особенно в мутантных белках с заменами Leu76Ala и Тгр14А1а. Для всех мутантных белков были рассчитаны свободные энергии перехода из нативного в развернутое состояние АО,ккал/моль (аналогично тому, как это было сделано для WT).
Полученные значения AGyi", [Сигеа]1/2и m для всех белков приведены в Таблице 3. Из нее наглядно видно, что середина перехода для мутантных белков смещена в сторону меньших концентраций мочевины и кооперативность перехода падает по сравнению с белком WT, что говорит о дестабилизации белка сделанными мутациями. Сопоставление молярной эллиптичности на 222 нм в О М мочевины (рис. 19), где белки находятся в свернутом состоянии, показывает, что часть мутантных белков имеет меньшее содержание вторичной структуры по сравнению с белком WT. В то же время, на зависимости интенсивности Тф флуоресценции на выбранной длине волны (335 нм) от концентрации мочевины (рис. 20 б, г), для всех мутантных белков, аналогично белку WT, наблюдается максимум этой зависимости, свидетельствующий о накоплении промежуточного состояния на пути разворачивания белка. При этом, у мутантных белков этот максимум более выражен, чем у белка WT, что может свидетельствовать о том. что разворачивание мутантных белков характеризуются более высокой населенностью промежуточного состояния по сравнению с разворачиванием белка WT.
Кинетические эксперименты по сворачиванию и разворачиванию мутантных форм апомиоглобина с заменами аминокислотных остатков в консервативных нефункциональных положениях (спирали A, G и Н) и в положениях, предсказанных с помощью «ландшафтного» подхода (спирали В, С, D, и Е), проводились с целью оценки включения этих аминокислотных остатков в предполагаемое ядро сворачивания апомиоглобина в переходе I«- N. Для всех мутантных белков были получены графики зависимости логарифма константы скорости сворачивания/разворачивания от концентрации мочевины в растворе (шевронные графики), а также оценена доля промежуточного состояния во всей области концентраций денатуранта. Далее, для всех мутантных белков был применен подход для анализа кинетических данных (рис. 21), разработанный нами для WT. чтобы определить скорости сворачивания и разворачивания для перехода через скорость-лимитирующий барьер I«- N (кік(М) и kNI(M)).
Похожие диссертации на Исследование ядра сворачивания апомиоглобина
