Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 8
2.1. Особенности строения молекул коллагена и их свойства, определяющие образование упорядоченных макромолекулярных структур 8
2.2. Структура коллагеновых фибрилл 11
2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели 12
2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл 12
2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл 15
2.4. Образование коллагеновых фибрилл in vivo 19
2.5. Фибриллогенез коллагена in vitro. Факторы и параметры, влияющие на самосборку молекул in vitro: температура, рН, ионная сила, концентрация молекул, компоненты внеклеточного матрикса 29
2.5.1. Состав ионов 31
2.5.2. Ионная сила 32
2.5.3. РН 32
2.5.4. Температура 32
2.5.5. Концентрация 36
2.5.6. Компоненты внеклеточного матрикса 37
2.5.6.1. Гликозаминогликаны 38
2.6. Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей 42
2.7.Методы исследования коллагеновых фибрилл 44
2.7.1. Метод электронной микроскопии 44
2.7.2. Метод рентгеновской днффракции 46
2.7.3. Метод поляризационной микроскопии 48
2.8. Метод калориметрии 49
3. Материалы и методы исследования. .54
3.1. Материалы и реактивы 54
3.1.1. Объекты исследования. 54
3.1.2. Реактивы.. 54
3.2. Выделение коллагена и очистка 54
3.2.1. Коллаген из кожи свиней 55
3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс 55
3.2.2.1. Коллаген с телопептидами 55
3.2.2.2. Коллаген без телопептидов. 57
3.3. Методы исследования 57
3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов 57
3.3.2. Определение концентрации коллагена 58
3,З.З.Оптические методы 58
3.3.3.1.Инфракрасная спектроскопия 58
3.3.3.2. Спектрофотометрия 58
3.3.3.3. Поляризационно-оптическая микроскопия 59
3.3.4, Метод сканирующей калориметрии 60
3.3.5. Методы электронной микроскопии 61
3.3.5.1. Метод сканирующей электронной микроскопии 61
3.3.5.2. Метод негативного контрастирования 61
3.4. Формирование коллагеновых фибрилл 62
3.4.1. Определение физико-химических характеристик коллагеновых молекул 62
3.4.2.0птимизация начальных условий фибриллогенеза коллагена w 63
3.4.2.1.Выбор методов образования нативных коллагеновых фибрилл 63
3.4.2.2. Выбор кинетического режима для самосборки молекул при температуре 4С с изменением температуры до 25С, 30С, 35С 65
3.4.2.3. Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с молекулами внеклеточного матрикса 65
3.4.3. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных и варьируемых параметров. 65
4. Результаты и их обсуждение 68
4.1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена типа I с удаленными телопептидами 68
4.2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл 72
4.3. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул. 75
4.4. Образование комплексов коллагена с компонентом внеклеточного матрикса хондроитин-4-сульфатом в зависимости от ряда условий 83
Заключение .89
Выводы .90
- Структура коллагеновых фибрилл
- Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей
- Выделение коллагена и очистка
- Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл
Введение к работе
Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. Сначала синтезируется предшественник коллагена -проколлаген. После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток. Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток. Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве.
Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса. В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена. Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей. Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон. При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой.
Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза. В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл. Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.
Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул. До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве.
6 Упаковка молекул коллагена в фибриллы in vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов. Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет. Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогенеза in vitro в условиях, близких к условиям in vivo. Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.
Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами. При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов. Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления.
Цель и задачи исследования. Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул. In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена. Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo. Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа І в условиях, приближенных к физиологическим условиям. Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы. Решались следующие задачи:
Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл.
Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.
Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых к протеолизу фибрилл.
Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структура коллагеновых фибрилл
Для строения фибрилл характерно ступенчатое расположение молекул со сдвигом на четверть их длины (рис,2). Расположенные в один ряд молекулы не связаны N- и С-концами. Между концом одной молекулы и началом следующей существует промежуток, размером — 40 нм. На электронно-микроскопических снимках наблюдается чередование светлых и темных полос, где светлой полосе соответствует область перекрывания молекул (overlap -зона), а темной полосе - область с промежутками между молекулами (gap -зона). Коллагеновые фибриллы по данным рентгеновской диффракции и электронной микроскопии имеют период поперечной исчерченности D, равный 64-67 нм. Анализ аминокислотных последовательностей полипептидных цепей выявил, что D-периоду соответствует группировка аминокислот в блоки по 234 аминокислотных остатка на а-цепь (Hulmes, 1973; Fraser, MacRae, 1987). В молекуле коллагена четыре таких последовательно расположенных блока. Пятый, С-концевой участок тройной спирали, имеет размер 0,4D и состоит из 90 аминокислотных остатка. На С-участке одной молекулы и перекрывающего его такого же размера N- концевом участке другой молекулы в связывании молекул участвуют глобулярные N- и С- телопептиды (Scott, Orford, 1981; Vitalgiano et al., 1995). Телопептиды составляют 2% от молекулярного веса коллагена, тем не менее они существенно влияют на структуру фибрилл. Включение телопептидов в поперечное связывание молекул способствует не только образованию прочных фибрилл, но и сохраняет им гибкость. В этих участках молекул происходит образование ко валентных связей между тройной спиралью и концевыми телопептидами. 2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели. 2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл. В отличие от многих фибриллярных белков образование коллагеновых фибрилл происходит при одновременном росте молекул в продольном и поперечном направлении. Связывание молекул регулируется распределением вдоль пептидной цепи специфично взаимодействующих аминокислотных остатков. Связи образуются как между глобулярными телопептидами и тройными спиралями, так и между тройными спиралями коллагена. Для спираль-спиральных взаимодействий оптимальным является сдвиг молекул на D-период (Ward et al, 1986). D-участок в молекуле коллагена образован в основном гидрофобными и полярными аминокислотными остатками. Гидрофобные аминокислоты имеют более четкий период распределения, чем полярные. D-период является максимумом для гидрофобных контактов при связывании молекул в фибриллы. Гидрофобные взаимодействия минимизируют поверхность коллагеновых молекул, доступную для молекул воды (Wallace, 1985). Последовательный сдвиг молекул коллагена на D-период дает достаточно большой участок (-200 нм) для взаимодействий между соседними молекулами.
Поэтому связывание в длину имеет большие преимущества. Для телопептид-спиральных взаимодействий оптимальным является сдвиг молекул на 4 D (Helseth et al, 1979). В работе (Veis, George, 1994) установлено, что смещение двух молекул на период 4 D связано с максимизацией электростатических взаимодействий в фибриллах. Определено, что максимальные величины положительных и отрицательных зарядов в молекуле локализованы на концах тройной спирали. В молекуле фибриллярного коллагена типа II участки Dl, D4 имеют повышенную стабильность, а участки D2, D3 пониженную стабильность (Arnold et al, 1998). Для коллагена характерна высокая степень упорядоченности в продольном направлении фибрилл - дальнодействующая упорядоченность. Дапьнодействующая упорядоченность регулируется максимизацией электростатических и гидрофобных взаимодействий. В процессах фибриллогенеза электростатические взаимодействия преобладают над гидрофобными, так как в коллагеновых молекулах число заряженных аминокислотных остатков составляет 16 %, а число гидрофобных аминокислотных остатков составляет 6 % (Brodsky et al., 1995). Полярные группы на тройной спирали образованы из аминокислот с чередующимися положительными и отрицательными зарядами. Такое распределение полярных групп приводит к внутримолекулярной нейтрализации зарядов, а также к сильным межмолокулярным контактам. При связывании образуется сеть положительных и отрицательных зарядов, после чего может возрастать отрицательный заряд и энергия связывания между молекулами (Chapman, 1984). Полярные аминокислотные остатки являются гибкими и менее ограничены во взаимодействиях, чем гидрофобные аминокислотные остатки. Полярные группы аминокислотных остатков образуют связи не только между собой, но и с ионами растворов. Известно, что число заряженных групп на тройной спирали коллагена типа I составляет 531(WaIlace, 1990), В то же время разные авторы (Li et al., 1975; Piez, 1982; Silver, 1982) представили данные, что в процессе образования фибрилл связывается 40-150 заряженных аминокислотных остатка. Это свидетельствует, что не все заряженные группы на тройной спирали доступны для взаимодействий между молекулами. Предполагают, что механизм упаковки в продольном направлении включает взаимодействия между необычными блоками заряженных пар, локализованных на тройной спирали коллагена в позиции 53, 54, 56 и 990, 992, а также в неспиральных концах (Silver, 1982). Заряженные пары притягиваются к друг другу либо электростатически, либо в форме гидрофобных кластеров между молекулами. Полярные аминокислотные остатки, вероятно, находятся в протяженной конформации. Так как лизин и аргинин являются наиболее длинными боковыми цепями, возможно, что именно эти аминокислотные остатки притягиваются на начальных этапах образования фибрилл. Перед таким сильным взаимодействием молекулы воды, связанные с этими остатками, должны быть удалены. По-видимому, такой процесс происходит при физиологических температурах. Высокая степень трансляционной симметрии фибрилл по отношению к оси фибрилл, определенная по меридиональным рефлексам под малыми углами, и регулярный D-период указывают на то, что межмолекулярные контакты в продольном направлении особенно предпочтительны.
Это обусловлено комплементарными взаимодействиями между двумя молекулами, а также значительным расстоянием в продольном направлении фибрилл, на протяжении которого распространяется периодический тип межмолекулярного связывания. Получены данные, что свободная энергия зависит от аксиальных параметров, т.е. минимум свободной энергии определен аксиальной составляющей (Wess et al, 1995). Термодинамические исследования формирования фибрилл in vitro как функции плотности коллагеновых молекул показали, что основной вклад в изменение свободной энергии при встраивании молекул в фибриллы дает энтропийная составляющая. При этом энтальпия системы положительна. В построении фибрилл в продольном направлении участвуют N- и С-концевые глобулярные телопептиды. N-телопептид влияет на образование димеров, расположенных с периодом 4D. Сначала N-телопептид на одной молекуле претерпевает конформационное изменение и связывается со спиральной областью соседней молекулы. Затем С-телопептид стабилизирует упаковку молекул в продольном направлении, связываясь с комплементарным участком тройной спирали. С-телопептид влияет также на боковое объединение линейных агрегатов. После самосборки концевые телопептиды способствуют вторичному связыванию молекул и стабилизации фибрилл путем образования новых межмолекулярных связей (Wallace, 1990). Таким образом, концевые телопептиды играют существенную роль как на ранних стадиях образования фибрилл, так и в процессе стабилизации фибрилл. Исследования последних лет свидетельствуют, что молекулы коллагена упакованы не параллельно длине фибрилл, но под некоторым углом в форме спирали. Для оценки упаковки в продольном направлении фибрилл требуются дополнительные данные о пространственной структуре макромолекул, включая углы суперспиральности а-цепей и радиальной ориентации молекул. 2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл. Все взаимодействия молекул в фибриллах принято различать на аксиальные, совпадающие по направлению с длинной осью фибриллы и радиальные -боковые взаимодействия.
Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей
Установлено, что нарушения в упаковке молекул коллагена связаны со многими заболеваниями соединительных тканей, из которых наиболее распространенными являются остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. (Никитин и др., 1977; Сиро et al., 1981; Frockop, Kivirikko, 1995). Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл до 110-140 нм, который в норме равен 90-100 нм (Kucharz, 1992). Кроме того, в фибриллах нарушается регулярная D-периодическая упаковка молекул. Это может быть следствием заниженного синтеза фибронектина и протеогликанов. Известно, что протеогликаны влияют на упаковку и размеры коллагеновых волокон. В культуре фибробластов in vitro было обнаружено снижение синтеза молекул коллагена типа III, что приводит к изменению соотношения коллагенов типа I и III в коже и в конечном итоге к увеличению диаметра фибрилл. Отсутствие коллагена типа III изменяет упаковку фибрилл таким образом, что диаметр фибрилл существенно увеличивается по сравнению с нормой. Сверхрастяжимость кожи и связок связана с ингибированием поперечного связывания при образовании фибрилл из-за пониженной активности лизилоксидазы, а, следовательно, сниженного числа альдегидных групп в молекулах. На образование фибрилл из молекул коллагена в присутствии pN-коллагена также влияет активность проколлаген-Ы-пептидазы. При пониженной активности фермента значительно нарушается упаковка коллагеновых структур, что приводит к повышенной растяжимости связок при сколиозе и других заболеваниях костно-мышечной системы. Дефекты при синдроме Марфана, которые связаны с аномалиями в тканях глаз, скелетной и сердечно-сосудистой системы, являются также примером изменения упаковки коллагеновых молекул. Повышенная растяжимость тканей связана с пониженной степенью поперечного связывания, которые были вызваны изменениями в структуре а2(1)-цепей. Следовательно, по причине нарушения упаковки тройных спиралей коллагена ослаблены контакты между боковыми цепями аминокислотных остатков в фибриллах. Несовершенный остеогенез относится к группе болезней, связанных как с наследственными дефектами, так и с нарушениями обмена веществ. Наиболее распространенной болезнью является остеопороз.
Наследственные заболевания остеопорозом проявляются не только в повышенной хрупкости костей, но и в истонченной коже, в опалесцирующей зубной эмали и в голубом цвете склеры. Основные дефекты, по-видимому, связаны с коллагеном типа I. Известно, что фибриллы костей состоят только из молекул коллагена типа I. Однако в молодых тканях наряду с коллагеном типа І в небольших количествах присутствует коллаген типа V. При заболевании остеопорозом обнаружено более высокое содержание коллагена типа V по сравнению с нормой, а также коллагена типа III. Молекулы коллагена типа Ш и V могут связываться в фибриллах в gap-зоне, где в норме локализован фосфат кальция, и таким образом могут изменять упаковку молекул коллагена типа І в костях. При остеопорозе обнаружены мутации в генах, кодирующих определенные аминокислоты, как например, глицина (Baum, Brodsky, 1999). Следовательно, изменяется регулярная последовательность триплетов и упаковка молекул в фибриллах. Также обнаружены мутации в генах, приводящие к удалению целых блоков аминокислот, что приводит к укорачиванию а-цепей и изменению упаковки, как молекул, так и фибрилл. Кроме того, при остеопорозе наблюдается пониженный синтез про-а1(І)-цепей, В результате нарушается упаковка тройной спирали коллагена, что впоследствии изменяет упаковку фибрилл. Ненаследственные формы остеопороза, по-видимому, связаны с изменением степени гидроксилирования лизина в молекулах коллагена. Понижение гидроксилирования лизина происходит, когда в организме низкая концентрация Са, что коррелирует с дефицитом витамина D (Кгапе, 1984). Повышение степени гидроксилирования лизина может происходить при заниженной скорости транспортировки про-а-цепей через эндоплазматический ретикулум или в процессе экзоцитоза молекул проколлагена из клетки. При летальной форме остеопороза повышенный уровень гидроксилирования лизина коррелирует с необычно низким диаметром фибрилл (Gay, Miller, 1978). По-видимому, увеличение внутриклеточного разрушения коллагена при пониженной секреции молекул, приводит к низким концентрациям коллагена во внеклеточном пространстве, что значительно изменяет упаковку фибрилл. Методом ренгеноструктурного анализа было показано, что в сухожилиях цыплят с мышечной дистрофией степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой (Stinson, 1975). 2.7. Методы исследования упорядоченных коллагеновых структур. 2.7.1. Метод электронной микроскопии. Большие успехи по установлению упорядоченной структуры коллагеновых фибрилл связаны с применением методов электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Так на электронно-микроскопических снимках коллагеновых фибрилл из разных соединительных тканей выявлена одинаковая поперечная исчерченность в продольном направлении фибрилл (Brodsky, Eikenbary, 1982). Основной участок периодической исчерченности D, равный 64 нм, включает светлую и темную полосы, разделенные на субполосы. Исчерченность коллагеновых фибрилл связана с разной степенью окрашивания полярных и нейтральных аминокислотных остатков при получении образцов для электронно-микроскопических исследований.
Для коллагеновых фибрилл типа I, реконструированных in vitro, показано, что связывание красителей с положительно и отрицательно заряженными группами дает 12 полос на D-период. Регулярность D-периода по данным электронной микроскопии варьирует от 50 им до 67 нм. Периодичность в фибриллах, по-видимому, зависит от типа соединительной ткани и возраста животного. Scott et al в 1981г. определили, что у взрослых животных связывание коллагена с протеогликанами в сухожилиях приводит к периодичности 62 нм, а у молодых к снижению периодичности до 50 нм. У новорожденных периодичность еще ниже и составляет 45 нм. Особенностью фибрилл с пониженной периодичностью является высокое содержание хондроитин-сульфата в молодых тканях. Установлено также изменение периодичности до 53 нм в сухожилиях кролика и до 55 нм в коллагеновых фибриллах роговицы. В работе (Scott, 1988) показано связывание протеогликанов с фибриллами молодых тканей вдоль поверхности фибрилл, а также в gap-зоне. Электронная микроскопия определяет не только периодичность упаковки фибрилл, но и фиксирует ассимметричное строение фибрилл, соответствующее ориентации упаковки молекул от N- к С- концу (Kadler et al, 1996). Было показано, что аксиальный рост фибрилл в сухожилиях эмбрионов цыпленка происходит неравномерно на разных концах фибриллы. На электронно-микроскопическах снимках видны несимметричные острый и тупой концы фибриллы, которые называются а- и Р-концами. Сначала рост фибриллы наблюдается на а-конце, затем через некоторое время — на Р-конце. Показано, что оба конца фибриллы эллипсоидны по форме. Это влечет за собой линейную зависимость увеличения массы фибриллы в зависимости от расстояния. Метод электронной микроскопии, фиксируя D-периодичную упаковку молекул, позволяет установить упорядоченную структуру фибрилл в продольном направлении. Однако упаковка молекул в поперечном направлении не сохраняется, что связано к дегидратацией образцов при их подготовке для анализа. Если сравнивать фибриллы по диаметру, то метод электронной микроскопии дает на 10-40% более низкие значения диаметра по сравнению с методом рентгеновской диф фракции.
Выделение коллагена и очистка
Для выделения и очистки белка из разных тканей применяли методики, предложенные авторами работ (Хилькин и др., 1976; Chandrakasan et aL, 1976; Gelman et al., 1979; Veis et al, 1981) и модифицированные в наших работах. Кожу свиньи очищали от жира и волос, разрезали на кусочки размером 5x5 мм. Проводили предварительную обработку ткани раствором 2 % NaOH, в 2,8 % NaSOj в течение 48 час. Экстракт центрифугировали при 7000g в течение 20 мин. Супернатант отбрасывали, осадок обрабатывали 2% раствором борной кислоты до нейтрального рН. Затем промывали осадок дистиллированной водой и обрабатывали 10-кратным объемом 0,5 М раствора уксусной кислоты. Экстракцию проводили в течение 72 час. Для удаления нерастворимого материала гомогенат дважды пропускали через капроновое сито. Проводили осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 30%. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М NaOH до рН 5,0. Экстракт оставляли на 12 час, а затем центрифугировали при 7000g в течение 20 мин. Осадок растворяли в растворе 0,5М уксусной кислоты. Нерастворимую часть удаляли центрифугированием при 18000g в течение 1 час. Проводили повторное осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 14%. Осадок перерастворяли в 3-хкратном объеме 0,5М уксусной кислоты и диализовали против 40-кратного объема раствора 0ДМ уксусной кислоты с 3-4 сменами раствора. Диализат центрифугировали при 100000g в течение 2 час. Осадок отбрасывали, супернатант использовали для экспериментов. Все процедуры проводили при температуре 4-6С. 3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс 3.2.2.1. Коллаген с телопептидами Коллаген получали из сухожилий хвостов молодых белых крыс. Хвосты замачивали на ночь в дистиллированной воде. Сухожилия выделяли следующим образом: делали продольный разрез хвоста, снимали кожу и, начиная с конца, разламывали хвост на фрагменты и вытягивали сухожилия. Сухожилия промывали в дистиллированной воде и обрабатывали 10-кратным объемом раствора 0,5 М уксусной кислоты. Экстракцию проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 72 час в результате 3-х последовательных экстракций, каждая по 24 часа. 1-ый, 2-ой и 3-ий экстракты объединяли и фильтровали через несколько слоев марли. Экстракт разбавляли раствором 0,5М уксусной кислоты и центрифугировали при 30000g в течение 2-х час. Нерастворимые остатки ткани отбрасывали, коллаген супернатанта подвергали 3-хкратной очистке.
Очистку коллагена от примесей и высокомолекулярных агрегатов проводили на разбавленных растворах коллагена концентрации - 1м г/мл. Коллаген получали путем осаждения с последующим центрифугированием и перерастворением в растворе 0,5 М уксусной кислоты. Осаждение проводили раствором 30% NaCI до конечной концентрации 5% NaCI при постоянном перемешивании экстракта на магнитной мешалке и добавлении раствора NaCI из бюретки небольшими порциями. Экстракт оставляли на 12 час. Осадок коллагена отделяли центрифугированием при 7000g в течение 1 час. Перерастворяли коллаген в растворе 0,5 М уксусной кислоты в течение 12 час. Затем проводили диализ в течение 24 час против 40-кратного объема раствора 0,5 М уксусной кислоты с 3-4-хкратной сменой раствора. Диализат центрифугировали при 30000g в течение 2-х час. Верхнюю половину супернатанта использовали для 2-ой очистки по описанной выше процедуре. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. 3-е осаждение коллагена проводили охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 14%. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М NaOH до рН 5,0. Центрифугирование и перерастворение коллагена было выполнено как ранее. Диализ был проведен против раствора 0,1 М уксусной кислоты. Диализованный раствор коллагена центрифугировали на ультрацентрифуге при 160000g в течение 2 час. Верхнюю половину супернатанта использовали для проведения экспериментов. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. Экстракт коллагена, полученный из сухожилий хвостов крыс, центрифугировали при 30000g в течение 2 час для удаления нерастворимого материала, использовали для получения коллагена без телопептидов. Обработку пепсином молекул коллагена проводили при температуре 25С в течение 24 час следующим образом: пепсин добавляли в 0,5М уксуснокислый раствор коллагена концентрации 1мг/мл, рН 2,5 при соотношении фермент/субстрат 1:10, а через 12 час добавляли то же количество пепсина. Затем проводили инактивирование пепсина раствором О, IN NaOH до рН 7,0 и осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 30%. Осадок отделяли центрифугированием при 7000g в течение 1 часа. Супернатант отбрасывали, осадок коллагена ресуспепдировали и перерастворяли в растворе 0,5М растворе уксусной кислоты на магнитной мешалке. Для удаления телопептидов и примеси пепсина проводили второе осаждение коллагена с последующим центрифугированием, перерастворением в растворе 0,5М уксусной кислоты, диализом и ультрацентрифугированием по описанному ранее методу очистки коллагена типа I. 3.3. Методы исследования 3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов Гомогенность коллагеновых молекул после выделения и очистки, а также наличие разных типов коллагена, были проверены методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. В работе использована стандартная система электрофореза, предложенная Лемли (Lammli, 1970) и модифицированная в нашей работе. Белок находился в растворе 0,02М Na2HP04, 0,15 NaCl, рН 6,0. Образцы коллагена растворяли в 50 тМ трис-HCl, рН 7,5 с 0,5% SDS и проводили нагревание в течение 5 мин. Использовали 3% концентрирующий и 5% разделяющий гели. Окрашивание белков проводили 0,1% кумасси R-250 в системе метанол-уксусная кислота-вода. В качестве маркерных белков использовали, фосфорилазу Ь: мономер (97400 Да), димер (194800 Да), тример (292000 Да), тетрамер (389600 Да). 3.3.2. Определение концентрации коллагена Концентрацию коллагена определяли по сухому весу белка (Kupke D.W., Dorrier Т.Е.,1978) и модифицированному методу Лоури (Stoscheck, 1990). Коллаген в растворе 0,1М уксусной кислоты и в фосфатно-буферном растворе 0,02 М Na2HP04, 0,15 М NaCl, рН 7,2 высушивали при 105С под вакуумом в течение 4-5 суток. Применяли стеклянные бюксы, где бюксы контроля заполняли растворителем. Взвешивание проводили с точностью до ±0,1 мг. При использовании метода Лоури калибровочным белком была желатина. 3.3.3. Оптические методы. 3.3.3.1. Инфракрасная спектроскопия.
Нативность молекул коллагена была проверена по спектрам поглощения в инфракрасной области на спектрометре UR-20 (ГДР). ИК-спектр тройной спирали коллагена характеризуется рядом полос, связанных с колебаниями амидных и пептидных групп а-цепей. Максимум полосы амид А расположен при - 3330 см 1, а максимум полосы амид I расположен при 1665 см 1. Для анализа использовали пленки образцов, высушенные на кварцевых подложках. Подложки помещали в герметичную кювету с постоянной температурой. 3.3.3.2. Спектрофотометр и я Наличие телопептидов проверяли по спектру поглощения тирозина в дальней ультрафиолетовой области на спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР). На УФ-спсктрах поглощения молекул коллагена с целыми телопептидами в растворе 6 М Gu-HCl, 0,03 М Na2HP04,pH 6,5 тирозину соответствует основной пик при 276 нм и дополнительный пик при 282 нм (Na, 1988). Использовали концентрацию молекул 20 мг/мл. Кинетику образования фибрилл изучали по изменению мутности растворов коллагена, как изменения оптической плотности, в зависимости от параметров самосборки молекул. Измерения проводили на спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР) на длине волны 400 нм. Использовали 0,5 см и 1 см кварцевые кюветы. Перед заполнением в кювету образец дегазировали. Термостатирование образца в кювете проводили с помощью термостата U 8 (Венгрия). Для калибровки температуры использовали полупроводниковое термо сопротивление МТ-54. Точность определения температуры составляла ±0,ГС. Температура образца достигала нужного значения в течение 2 мин. 3.3.3.3. Поляризационно-оптичсская микроскопия Разрушение комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом под действием коллагеназы исследовали методом поляризационно-оптической микроскопии. Для проведения измерений использовали термомикроскоп типа BOETIUS РНМК-05 (ГДР). Термомикроскоп включает в себя малогабаритный нагревательный стол, встроенное поляризационное устройство и устройство наблюдения. Исследуемый образец помещается между скрещенными полярами.
Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл
Результаты, полученные из кинетических кривых (рис. 9), показывают, что длительность лаг-фазы зависит как от концентрации коллагена, так и от температуры. Увеличение концентрации от 0,3 мг/мл до 1,2 мг/мл (в четыре раза) уменьшает длительность лаг-фазы в два раза, что соответствует увеличению числа контактов между молекулами коллагена и облегчает инициацию самосборки (Silver, ВІгк, 1983). Продолжительность лаг-фазы при Т=30С по сравнению с продолжительностью лаг-фазы при Т=25С уменьшена в пять раз. Обнаруженная зависимость лаг-фазы от температуры определяется конформационными изменениями молекул коллагена (Crabtree, Fujimori, 1980; Helseth, Veis, 1981). С увеличением температуры во время лаг-фазы может ускоряться инициация образования микрофибрилл или рост микрофибрилл до промежуточных фибрилл - субфибрилл (Silver, Birk, 1983). В работе (Suarez et al, 1985) показано, что повышение температуры от 25С до 30С приводит к увеличению скорости образования фибрилл и числа субфибрилл в лаг-фазе. При физиологической температуре возможно быстрое изменение конформации молекул, поэтому самосборка молекул коллагена происходит без лаг-фазы при Т=35С. Данные таблицы 4 показывают, что при Т = 30С параметр Ьл увеличивается в четыре раза, а при Т = 35С - в восемь раз по сравнению с параметром t при Т=25С. Так как установлено закономерное изменение величин Ь/г при всех исследуемых концентрациях коллагена (0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл), можно сделать заключение, что, начиная с Т = 30С значительно возрастает скорость образования коллагеновых фибрилл. При Т=35С и концентрации коллагена 1,2 мг/мл образование коллагеновых фибрилл протекает с наибольшей скоростью (параметр Ь/г- 2 мин.). Время формирования стабильной структуры фибрилл, определенное по параметру tp, снижается в три раза с повышением температуры от25Сдо35С. Этими исследованиями показано, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул регулируется кинетика процесса фибриллогенеза in vitro. Известна корреляция между температурой, скоростью образования коллагеновых фибрилл и диаметром фибрилл. Wood et al. в I960 г. определили, что повышение температуры от 25С до 37С приводит к увеличению скорости образования фибрилл в 5-8 раз и к снижению диаметра фибрилл в два раза. Кроме того было установлено, что при Т=20 С диаметр фибрилл равен 200 нм, а при Т= 34С равен 20-70 нм, (Kadler et al., 1996).
По нашим данным при Т= 25С фибриллы образуются с низкой скоростью и могут иметь большой диаметр. Но при Т=26С электронно-микроскопическими измерениями выявлена неплотная упаковка фибрилл (Williams et al, 1978). Изменение диаметра ранее (Wood et al,, 1960) связывали с изменением упаковки молекул лишь в поперечном направлении фибрилл. Коллагеновые молекулы в фибриллах при физиологических температурах (Т=34С) претерпевают два конформационных перехода: в конце лаг-фазы, а также во время фазы насыщения (George, Veis, 1990). Изменение конформации связано с формированием суперспиральной структуры фибрилл и взаимной подгонкой молекул как в поперечном, так и в продольном направлении фибрилл. Из этого следует, что при физиологической Т=35С возможна более плотная упаковка фибрилл. Структурные изменения в коллагеновых фибриллах при варьировании температуры и концентрации анализировали по данным, полученным из калориметрических кривых. Для кривых теплопоглощения коллагеновых фибрилл характерны асимметричные пики (рис. 10). С ростом температуры от 25С до 35С интенсивность пика перехода и острота пика возрастают, что характеризует повышение степени кооперативности фибрилл. Полуширина перехода AT возрастает в два раза при относительно низких концентрациях коллагена (0,3-0,6 мг/мл) и в полтора раза при относительно высокой концентрации коллагена (1,2 мг/мл), если сравнивать величины ДТ при Т=25С и Т=35С. Термостабильность фибрилл снижается на 1,5С при увеличении температуры от 25С до 35С. Повышение концентрации в четыре раза не влияет на термостабильность фибрилл. Получены результаты о максимальном значении энтропии и энтальпии фибрилл, образованных при температуре 30С (таблица 5). В работе (Na et al, 1989) установлено, что с ростом температуры от 12С до 27,5С величина энтальпии увеличивается. Однако, Cooper в 1970 г. определил, что образование фибрилл при повышении температур от 20С до 37С сопровождается последовательным уменьшением энтропии и энтальпии. По нашим данным увеличение температуры от 25С до 30С приводит к повышению энтропии, а, следовательно, к разупорядоченпости фибрилл. Увеличение температуры от 30С до 35С приводит к снижению энтропии, что характеризует образование упорядоченной структуры фибрилл. Падение энтропии компенсируется падением энергии из-за образования контактов между сближающимися молекулами коллагена. Когда связывание белковых молекул происходит быстро (сек., мин.), тогда падение энтропии быстро компенсируется падением энергии. В таких условиях процесс самосборки молекул не перекрыт высоким свободно-энергетичесим барьером (Финкельштейн, Птицын, 2002). При физиологической температуре 35С образование фибрилл происходит быстро при всех исследуемых концентрациях коллагеновых молекул (мин.) и сопровождается минимальными величинами энтропии и энтальпии. По-видимому, при температурах 250С,, 30С и 35С коллагеновые фибриллы формируются разными путями за счет молекул мономерного коллагена, связываемых и не связываемых в фибриллы. Известно, что на количество коллагеновых молекул, связанных в фибриллы in vitro, влияют условия фибриллогенеза (Cooper, 1970; Na, 1989). По данным Cooper при Т=30С количество связанных молекул максимально, при Т=25С их число меньше, а при Т=35С еще меньше. Общая энтальпия фибрилл складывается из энтальпии коллагеновых молекул и энтальпии образования фибрилл. Результаты по энтальпии сидетельствуют, что общая энтальпия может быть изменена за счет вклада энтальпии несвязанных молекул коллагена.
По величине энтальпии возможна оценка относительного содержания нековалентных связей в макромолекулах (Эдсол, 1986). Для анализа процесса фибриллогенеза in vitro важно оценить вклад образующихся межмолекулярных связей. Зная энтальпию денатурации молекул коллагена, можно определить энтальпию образования фибрилл AHf (Tiktopulo et al, 1998). Величины AHf указывают (таблица 5), что количество слабых межмолекулярных связей увеличивается с повышением температуры от 25С до 30С и уменьшается с повышением температуры от 30С до 35С. Если сравнивать влияние температур 30С и 35С на фибриллогенез коллагена в зависимости от концентрации, следует отметить снижение числа межмолекулярных связей в два раза при температуре 35С и концентрации 1,2 мг/мл. В физиологических условиях рН, ионной силы и температуры упорядоченная структура фибрилл формируется за счет снижения количества слабых межмолекулярных связей и более плотной упаковки молекул в фибриллах. Компактность коллагеновых молекул или степень их кооперативности в фибриллах оценивали по числу кооперативных участков, формирующих единую кооперативную систему. Число кооперативных участков в молекулах коллагена, л, при условии, что структурные единицы плавятся независимо, вычисляется по формуле (Lumry et al., 1966): н=ДЯ-М Д774Д-Гт2,(1) где М — молекулярный вес коллагена; R - газовая постоянная; Д// — теплота перехода из нативного состояния в разупорядоченное, рассчитанная на грамм белка; Тт - температура перехода из нативного состояния в разупорядоченное; ДТ- полуширина перехода из нативного состояния в разупорядоченное. При физиологической температуре 35С образование фибрилл происходит быстро при всех исследуемых концентрациях коллагеновых молекул (мин.) и сопровождается минимальными величинами энтропии и энтальпии. По-видимому, при температурах 250С,, 30С и 35С коллагеновые фибриллы формируются разными путями за счет молекул мономерного коллагена, связываемых и не связываемых в фибриллы. Известно, что на количество коллагеновых молекул, связанных в фибриллы in vitro, влияют условия фибриллогенеза (Cooper, 1970; Na, 1989). По данным Cooper при Т=30С количество связанных молекул максимально, при Т=25С их число меньше, а при Т=35С еще меньше. Общая энтальпия фибрилл складывается из энтальпии коллагеновых молекул и энтальпии образования фибрилл. Результаты по энтальпии сидетельствуют, что общая энтальпия может быть изменена за счет вклада энтальпии несвязанных молекул коллагена.
