Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Отражательная и флуоресцентная спектроскопия как методы исследования биологических тканей 27
1.1. Методы определения оптических свойств биотканей 27
1.2. Формирование спектра диффузного отражения кожи человека 33
1.3. Формирование спектра автофлуоресценции кожи 47
1.4. Выводы 61
Глава 2 . In vivo отражательная спектроскопия биотканей 63
2.1. Исследование влияния хромофорного состава кожной ткани человека на спектр ее диффузного отражения 63
2.1.1. Экспериментальное исследование влияния содержания крови и меланина на спектр диффузного отражения кожи 63
2.1.1.1. Экспериментальное оборудование 63
2.1.1.2. Объект исследования 67
2.1.1.3. Результаты эксперимента 69
2.1.2. Математическое моделирование диффузного отражения света кожей 74
2.2. Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектрам диффузного отражения 79
2.2.1. Эффективная оптическая плотность рассеивающей среды 79
2.2.1.1. Среда с однородным объемным распределением поглощения 80
2.2.1.2. Тонкий поглощающий слой, помещенный в рассеивающую среду 85
2.2.2. Феноменологическая модель для анализа спектров диффузного отражения кожи 87
2.3. Определение индексов эритемы и меланина кожи человека 93
2.3.1. Методы определения индексов эритемы и меланина 93
2.3.2. Трехволновый метод определения индексов эритемы и меланина 99
2.4. Определение степени оксигенации гемоглобина крови 100
2.4.1. Методы определения степени оксигенации гемоглобина крови по спектрам диффузного отражения света биотканями 100
2.4.2. Метод определения содержания гемоглобина и степени его оксигенации по спектрам диффузного отражения кожи в видимом диапазоне 106
2.5. Исследование влияния рассеивающих свойств биоткани на спектр ее диффузного отражения 113
2.5.1. Экспериментальное исследование влияния осмотически активных иммерсионных жидкостей на рассеяние света in vitro образцами биотканей 116
2.5.2. Экспериментальное исследование влияния осмотически активных иммерсионных жидкостей на рассеяние света in vivo биотканями 122
2.6. Выводы 127
Глава 3. In vivo флуоресцентная спектроскопия биотканей 129
3.1. Исследование влияния хромофорного состава кожной ткани на спектр ее автофлуоресценции (АФ) 129
3.1.1. Экспериментальное исследование влияния содержания крови и меланина в кожной ткани на спектр ее АФ 129
3.1.2. Математическое моделирование АФ кожи 136
3.2. Количественная оценка содержания хромофоров в биоткани по спектрам ее АФ 140
3.2.1. Эффективная оптическая плотность тонкого поглощающего слоя, помещенного в рассеивающую среду 140
3.2.2. Феноменологическая модель для анализа спектров АФ кожной ткани 144
3.3. Определение индексов эритемы и меланина кожи человека по спектрам АФ кожи 149
3.4. Комбинированный метод отражательной и флуоресцентной спектроскопии исследования кожи in vivo 152
3.4.1. Исследование эффективности фотозащитных композиций 152
3.4.1.1. Методика определения солнцезащитного фактора фотозащитных препаратов 157
3.4.1.2. Клинико-экспериментальные исследования 159
3.4.2. Оценка количества меланина, вносимого в кожу с помощью меланинсодержащих косметических препаратов 164
3.4.3. Коррекция спектров АФ биоткани на эффект внутреннего поглощения 173
3.4.4. Некоторые применения флуоресцентной спектроскопии в дерматологии 175
3.4.4.1. Оценка реакции кожи на воздействие местно-раздражающих агентов 175
3.4.4.2. Мониторинг изменения кровотока в коже в условиях прекращения венозного оттока 178
3.4.4.3. Оценка глубины проникновения и времени нахождения псораленов в кожной ткани 180
3.5. Выводы 184
Глава 4. In vivo колориметрия биотканей 186
4.1. Цветовое восприятие отраженного кожей белого света 186
4.2. Цветовой анализ спектров отражения и АФ кожи 190
4.2.1. Методика расчета цветовых характеристик отраженного кожей белого света и АФ кожи 191
4.2.2. Исследование влияния хромофорного состава кожной ткани на цветовые характеристики диффузно отраженного кожей белого света и ее АФ 195
4.3. Эритема-меланинометр ЭММ-01 и некоторые результаты его применения в экспериментальной и клинической дерматологии 201
4.3.1. Модельные измерения in vitro 204
4.3.2. Измерения в условиях in vivo 209
4.4. Цветовая визуализация биологической ткани 218
4.4.1. RGB анализ цветного изображения биоткани 219
4.4.1.1. Определение площади кожной поверхности с патологией 220
4.4.1.2. Количественная оценка содержания меланина в волосяном стержне 221
4.4.1.3. Цветное изображение АФ биоткани 232
4.4.2. Изображение поверхности кожи в диагностических параметрах 232
4.4.2.1. 2D распределение индекса меланина кожной ткани 235
4.4.2.2. 2D распределение индекса эритемы кожной ткани 239
4.5. Выводы 241
Глава 5. Исследование влияния оптических характеристик рассеивающей среды на эволюцию состояния поляризации распространяющегося в среде света с исходной линейной поляризацией 243
5.1. Феноменологическая модель релаксации линейной поляризации света, распространяющегося в неупорядоченной многократно рассеивающей среде 243
5.2. Релаксации поляризации когерентного излучения с исходной линейной поляризацией при его распространении в многократно рассеивающей среде 250
5.2.1. Результаты экспериментального исследования 250
5.2.2. Результаты статистического моделирования 253
5.3. Исследование влияния анизотропии рассеяния на степень остаточной поляризации некогерентно обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией 257
5.3.1. Постановка задачи 257
5.3.2. Феноменологическое описание 261
5.3.3. Результаты статистического моделирования 272
5.3.4. Результаты экспериментальных исследований 279
5.4. Влияние поглощения многократно рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией 285
5.4.1. Феноменологическое описание 286
5.4.2. Результаты экспериментальных исследований 290
5.5. Выводы 297
Глава 6. Поляризационная визуализация рассеивающих сред 299
6.1. Поляризационная визуализация рассеивающих сред с помощью непрерывного лазерного излучения 303
6.1.1. Поляризационная визуализация рассеивающей среды в проходящем свете: феноменологическое описание и статистическое моделирование 304
6.1.2. Результаты экспериментальных исследований 312
6.2. Визуализация рассеивающих сред при обратном рассеянии линейно поляризованного немонохроматического света 324
6.2.1. Поляризационная визуализация при обратном рассеянии излучения: феноменология и статистическое моделирование 325
6.2.2. Результаты экспериментальных исследований 328
6.3. In vivo поляризационная отражательная спектроскопия биотканей 340
6.3.1. Модельные измерения в условиях in vitro 342
6.3.2. In vivo поляризационная отражательная спектроскопия кожи человека 348
6.4. Выводы 356
Заключение 358
Библиографический список 365
- Формирование спектра диффузного отражения кожи человека
- Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектрам диффузного отражения
- Количественная оценка содержания хромофоров в биоткани по спектрам ее АФ
- Методика расчета цветовых характеристик отраженного кожей белого света и АФ кожи
Введение к работе
1. Актуальность темы
Оптика биотканей - одна из наиболее интенсивно развивающихся областей знаний, представляющая интерес как для физиков, так и биологов и медиков, работающих над созданием оптических медицинских технологий диагностики и лечения. Бурному развитию оптики биотканей в последнее время способствовали достижения в областях лазерной физики, волоконной оптики, оптоэлектроники и компьютерных технологий. Актуальность исследований в данной области подтверждается тем фактом, что в последние годы проявляется явная тенденция выделения исследований по оптическим свойствам биотканей и клиническим аспектам лазерной медицины в отдельное научное направление - биомедииинскую оптику.
В настоящее время разработано большое число методов определения оптических свойств биотканей как в ультрафиолетовой, так и в видимой и ближней инфракрасной областях спектра (R.R. Anderson, J.A. Parish, S.L. Jacques, M.J.C. van Gemert, H.J.C.M. Sterenborg, B. Chance, P.H. Andersen, A.J. Welch, L O. Svaasand, N. Kollias и др.).
Однако большинство результатов получено при исследованиях in vitro образцов биотканей, при этом отмечается широкий разброс значений оптических параметров биотканей, обусловленный различиями в методиках подготовки и проведения эксперимента. Значительно меньше сведений об оптических свойствах биотканей получено на живых объектах, хотя именно результаты in vivo исследований дают возможность получать информацию о происходящих в биологической ткани биохимических процессах.
Среди оптических методов исследования in vivo биотканей наибольшее развитие получили методы отражательной и флуоресцентной спектроскопии
Метод отражательной спектроскопии используются в биомедицине достаточно давно (S.L. Jacques et al., В.В. Кузьмин и В.П. Жаров, P.H. Andersen, J.B. Dawson et al., N. Kollias et al., C. Edwards et al., R. Marchesini et al., A.H. Королевич с соавт., M. J. С. van Gemert et al., B. Chance et al. и др.), однако его применение вызывает определенные сложности в выявлении взаимосвязи между измеряемым спектром диффузного отражения и спектральными зависимостями оптических характеристик среды. Корректная интерпретация экспериментальных результатов требует теоретического описания формирования спектра диффузно отраженного биотканями света.
К началу исследований по диссертационной работе моделирование
распространения света в биотканях (в частности, в кожной ткани) основыва
лось на моделях, описывающих частные случаи состояния биоткани (нор
мальную кожную ткань, кожную ткань с эритемой, кожную ткань с пигментаци
ей и др.) (М. J. С. van Gemert et al., S.L. Jacques, R. Graaff et al., P.H. Andersen
и P. Bjerring, J.M. Schmitt et al., J. B. Dawson et al., R.R. Anderson, J.A. Parrish,
B.L. Differ, et al., N. Kollias et al., L.O. Svaasand et al. и др.). Однако эти модели
не позволяют адекватно описать динамику спектра диффузного отражения
кожи при воздействиях, приводящих к определенным изменениям ее оптиче
ских параметров. . _,с. национальная']
і БИБЛИОТЕКА I
С.Петербург/00 ]
Особенности реализации метода in vivo отражательной спектроскопии можно отнести и к другому методу исследования биотканей - флуоресцентной спектроскопии.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области in vivo флуоресцентной спектроскопии биотканей (В. Chance et al., Е.А. Черницкий и Е.И. Слобожанина, Дж. Лакович, D.J. Leffell et al., Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко, R.R. Richards-Kortum et al., W. Lohmann et al., K.T. Schomacker et al., H.J.C.M. Sterenborg, M. Motamedi et al., N. Ramanujam et al., H. Zeng et al., Andersson-Engels S. et al. и др.), возможности метода далеко не исчерпаны. Первым шагом к полной реализации возможностей метода является переход от качественного анализа состояния биоткани к количественной оценке характеристик среды по спектрам ее автофлуоресценции (АФ).
Как и в случае метода отражательной спектроскопии, ограниченность измеряемых параметров (спектр возбуждения и спектр флуоресценции) требует разработки адекватной физической модели биоткани, позволяющей по спектрам АФ количественно оценивать ее состояние (М. Kaijzer et al., R. Richards-Kortum et al., H. Zeng et al., A.J. Welch et al.) Однако до сих пор нет модели, позволяющей адекватно описать динамику спектра УФА возбужденной АФ кожи в процессе воздействий, изменяющих структуру и хромофорный состав биоткани. Более того, хотя данный вид флуоресценции лежит в основе распространенного диагностического метода, природа АФ кожной ткани в коротковолновой части видимого диапазона спектра до сих пор не изучена, поэтому очень сложно связать наблюдаемые изменения в спектрах АФ кожи с происходящими в ней морфо-функциональными изменениями.
Перспективным методом исследования биотканей является комбинированный метод отражательной и флуоресцентной спектроскопии, который недостаточно развит.
Методы отражательной и флуоресцентной спектроскопии в основном реализуются для биотканей, доступных визуальному исследованию, при этом один из основных акцентов направлен на анализ изменений цвета биоткани, вызванных воздействиями различных факторов.
Объективность оценки восприятия цвета биоткани основана на физических принципах его формирования, воплощенных в колориметрических методах и компьютерных методах цифровой визуализации объекта.
Современные колориметры успешно применяются для диагностики в дерматологии, при этом особый интерес вызывают колориметры, которые измеряют цветовые характеристики отраженного кожей света определенных спектральных интервалов, соответствующих областям поглощения основных хромофоров (J. В. Dawson et al, С. Edwards et al, B.L. Differ, et al, H. Kopola et al), и, соответственно, позволяют получить информацию об их количественном содержании в биоткани. Однако существующие методики основаны на приближенных моделях кожной ткани, что выражается в достаточно грубых оценках содержания хромофоров.
Применительно к биотканям представляет интерес спектральный метод колориметрии, дающий возможность детального анализа происходящих в биотканях изменений. При этом УФА возбужденная АФ биотканей наблюдается в видимом диапазоне спектра, что дает основание проводить количественную оценку изменения цвета АФ кожи. Возможности метода колориметрии,
основанного на измерении цвета флуоресценции, практически не изучены, в связи с чем исследования в данном направлении актуальны.
В последние годы значительно вырос интерес к методу цифровой визуализации биоткани (R.H. Moss et al., R.D. Kenet et al., H. Takiwaki et al., R. Marchesini et al., L. Savolainen et al.), однако в его основе лежит простой RGB-анализ изображений, что ограничивает возможности метода.
Альтернативным методом исследования является широко используемый в настоящее время в океанографии, геологии и космических исследованиях метод многоспектральной визуализации (МСВ), основанный на комбинации пространственных и спектральных измерений. Применительно к биоткани метод позволяет получать функциональную «карту» объекта, показывая тип и область локализации содержащихся в нем биологических компонентов. Исследования возможности визуализации биотканей путем формирования их компьютерных изображений с использованием для визуализации диагностических параметров (индекса эритемы, индекса меланина, степени оксигена-ции и др.) находятся в начальной стадии и являются актуальными.
Одним из преимуществ оптических методов исследования биологических сред является возможность получения информации о среде путем анализа поляризационных характеристик рассеянного средой излучения. Необходимо отметить исследования поляризации рассеянного света при наблюдении когерентного обратного рассеяния (Р.-Е. Wolf, G. Maret, М.Р. van Albada et al.), анализ временных корреляционных функций линейно и циркулярно поляризованного света, рассеянного нестационарными средами (F.C. MacKintosh et al., В.Л. Кузьмин и В.П. Романов), а также исследования влияния размеров частиц среды на поляризацию рассеянного вперед излучения (D. Bicout et al., V. Sankaran et al.).
В биомедицинских приложениях использование поляризованного излучения связано с детектированием обратно рассеянного излучения. В связи с этим исследования влияния оптических характеристик среды на релаксацию поляризации зондирующего света с начальной линейной поляризацией и величину предельного значения остаточной поляризации некогерентно обратно рассеянного излучения представляют несомненный интерес.
Одной из важнейших проблем современной медицинской диагностики является разработка методов визуализации неоднородной структуры биотканей. В последние годы интенсивно развиваются методы диагностики и визуализации in vivo биотканей, основанные на анализе поляризационных характеристик рассеянного света. Предложено несколько вариантов поляризационной визуализации, продемонстрировавших определенную перспективность данного подхода (J.M. Schmitt et al., J.S.Tyo et al., J.F. de Boer et al.).
Однако авторы известных работ (R.R. Anderson, N. Kollias, S.G. Demos, R.R. Alfano, S.L Jacques и др.) в основном ограничились качественным рассмотрением вопроса поляризационной визуализации рассеивающих сред, содержащих макронеоднородность. В связи с этим исследования влияния оптических свойств рассеивающих сред и геометрии рассеяния на качество поляризационных изображений макронеоднородности в рассеивающей среде являются актуальными.
Все вышеперечисленные факты и обстоятельства позволяют сформулировать основную цель диссертационной работы и определить круг задач, не затронутых другими исследователями и решаемых в данной работе.
2. Цель и основные задачи работы
Основной целью диссертационной работы является развитие оптических методов исследования биотканей в состоянии in vivo, основанных на анализе спектрального состава диффузно отраженного биотканями света и их автофлуоресценции, а также состояния поляризации рассеянного биотканями поляризованного света.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие основные задачи:
-
Модельные и in vivo экспериментальные исследования спектров диффузного отражения кожи человека в процессе изменения ее поглощающих (УФА наведенная эритема и пигментация) и рассеивающих (иммерсия кожной ткани) свойств с целью разработки физической модели формирования спектра диффузного отражения кожи.
-
Модельные и in vivo экспериментальные исследования спектров АФ кожи человека в процессе изменения ее поглощающих свойств (УФА наведенная эритема и пигментация) с целью разработки физической модели формирования спектра АФ кожи.
-
Разработка физических основ комплекса методик in vivo определения количественного содержания основных хромофоров кожной ткани по ее спектрам диффузного отражения и АФ.
-
Разработка физических основ и алгоритмов компьютерной визуализации пространственного распределения хромофоров в in vivo кожной ткани, основанная на исследовании цветовых характеристик рассеянного белого света и АФ кожи с целенаправленно изменяющимися параметрами.
-
Теоретическое и экспериментальное исследования влияния параметров рассеивающей среды (анизотропии рассеяния и селективного поглощения) и геометрии детектирования (прошедшее или обратно рассеянное излучение) на релаксацию линейной поляризации распространяющегося в многократно рассеивающей среде когерентного и некогерентного света и степень его остаточной первоначальной поляризации.
-
Теоретическое и экспериментальное исследования спектрального состава разностной составляющей между ко- и кросс-поляризованными компонентами диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного излучения и степени его остаточной поляризации с целью разработки комплекса методик определения пространственного распределения в биоткани основных хромофоров и структуры ее подповерхностных слоев.
-
Теоретическое и экспериментальное исследования потенциальных возможностей поляризационного метода визуализации макронеоднородности, внедренной в многократно рассеивающую среду, при использовании в качестве параметров визуализации поляризационных характеристик прошедшего через рассеивающую среду и обратно рассеянного средой света с исходной линейной поляризацией.
3. Научная новизна работы
Научная новизна работы определяется комплексом результатов теоретических и экспериментальных исследований, которые существенно расширяют представления о взаимодействии света с живыми биотканями и возможности исследования биотканей оптическими методами:
-
Впервые in vivo экспериментально исследована временная (45 суток) динамика спектров диффузно отраженного света видимого диапазона и УФА возбужденной АФ кожи с целенаправленно изменяющимися поглощающими свойствами (УФА наведенная эритема и пигментация), а также временная динамика спектра диффузно отраженного света кожей с изменяющимися рассевающими свойствами (иммерсия кожной ткани).
-
Разработана принципиально новая физическая модель кожной ткани, адекватно описывающая формирование спектров диффузного отражения и АФ реальной биоткани.
-
Развит принципиально новый подход для исследования in vivo кожи на основе комбинированного метода отражательной и флуоресцентной спектроскопии, позволивший разработать комплекс методик определения содержания основных хромофоров (оксигенированной и деоксигенированной форм гемоглобина и меланина) кожи и определения оптических свойств фотозащитных и косметических меланинсодержащих препаратов.
-
Впервые теоретически и экспериментально исследованы возможности использования цветовых характеристик диффузно отраженного излучения и АФ in vivo биотканей для количественного определения хромофорного состава. Впервые показана принципиальная возможность количественного определения содержания меланина в волосах путем RGB-анализа их цветных изображений.
-
Впервые in vivo экспериментально исследованы возможности метода визуализации пространственного распределения основных хромофоров кожной ткани, основанного на формировании компьютерных изображений кожной поверхности с индексами эритемы и пигментации в качестве параметров визуализации. Показано существенное увеличение чувствительности контраста компьютерного изображения к изменению содержания хромофоров по сравнению с изображением в белом свете.
-
Теоретически и экспериментально исследована эволюция состояния поляризации когерентного света при многократном рассеянии. Исследовано влияние свойств рассеивающей среды (анизотропии рассеяния) и геометрии детектирования на степень остаточной поляризации излучения с исходной линейной поляризацией, прошедшего через рассеивающую среду с ограниченной геометрией.
-
Теоретически и экспериментально исследована эволюция состояния поляризации некогерентно обратно рассеянного излучения при многократном рассеянии линейно поляризованного света. Впервые получено выражение для оценки предельного значения степени остаточной поляризации некогерентно обратно рассеянного излучения при освещении линейно поляризованным светом многократно рассеивающей полубесконечной среды.
-
Теоретически и экспериментально исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянно-
го излучения при зондировании многократно рассеивающих сред линейно поляризованным светом.
9. Предложен новый метод диагностики биотканей, основанный на анализе
спектра степени поляризации и разностного спектра ко- и кросс-
поляризованных составляющих диффузно отраженного линейно поляризо
ванного света. Показано, что спектр степени поляризации чувствителен к
изменению поглощающих свойств биоткани, а разностный поляризацион
ный спектр - к изменениям структуры и рассеивающих свойств ее подпо
верхностных слоев.
-
Теоретически обоснован и экспериментально апробирован метод поляризационной визуализации многократно рассеивающей среды, содержащей макронеоднородность, основанный на анализе пространственных распределений степени поляризации прошедшего через среду лазерного излучения с исходной линейной поляризацией.
-
Теоретически обоснован и экспериментально апробирован метод поляризационной визуализации макронеоднородности, погруженной в многократно рассеивающую среду, при использовании в качестве параметров визуализации поляризационных характеристик обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией.
4. Практическая значимость
Практическая значимость определяется следующими положениями.
-
Фундаментальные результаты, полученные в результате теоретических и экспериментальных исследований релаксации поляризации излучения с исходной линейной поляризацией при его распространении в неупорядоченной многократно рассеивающей среде, найдут применение при решении прикладных проблем статистической оптики.
-
Полученные результаты найдут практическое применение в биологии и медицине, в частности:
в результате выполнения работы разработан комплекс методов и приборов для оценки морфо-функционального состояния in vivo биотканей человека, позволяющий получать объективную информацию о степени выраженности патологических и функциональных изменений в биотканях, а также оценивать эффективность лечения и профилактических мероприятий;
новый метод оценки эффективности фотозащитных композиций позволил значительно сократить время определения солнцезащитного фактора; с помощью данного метода определен оптимальный режим нанесения наружных препаратов, применяемых совместно с фотохимиотерапией;
разработанный в процессе выполнения работы оригинальный трехволно-вый зритема-меланинометр не имеет аналогов в России и имеет ряд преимуществ по сравнению с зарубежными аналогами, что определяет перспективу его использования в научных исследованиях и для практического здравоохранения в различных областях медицины.
3. Полученные результаты внедрены в учебный процесс на кафедре оптики
СГУ:
в виде материала, используемого при чтении курса лекций «Оптика био
тканей» и специальных курсов лекций «Фундаментальные проблемы со-
временной оптики», «Автоматизированные системы научных исследований» и «Люминесценция и ее биомедицинское применение».
в виде материала, изложенного в изданных учебных пособиях:
ДАЗимняков, В.И.Кочубей, Ю.П.Синичкин. Специальный оптический практикум. Компьютеризированные спектральные комплексы для биофизических исследований: Учеб. Пособие. - Саратов: Изд-во Сарат. унта, 1999. -56с;
Ю.П.Синичкин, Л.Е.Долотов, ДАЗимняков, В.В.Тучин, С.Р.Утц. Специальный практикум по оптической биофизике. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека: Учеб. Пособие. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 160 с. (с грифом Минобразования РФ).
в виде разработки методических основ и постановке Специального прак
тикума по оптической биофизике: in vivo отражательная и флуорес
центная спектроскопия кожи человека для студентов и аспирантов, обу
чающихся по специальностям «Биофизика», «Биохимическая физика» и
«Медицинская физика».
5. Связь с государственными и международными программами
Исследования по теме диссертации частично выполнялись в рамках научных фантов по программам: АФГИР «Научно-образовательный центр нелинейной динамики и биофизики» (грант № REC-006); РФФИ (гранты №№ 96-15-96389, 00-15-96667, 00-02-81014, 01-02-17493); INCO-COPERNICUS (грант № IC15-CT96-0815); Федеральная целевая программа «Интеграция» (грант № 696.2); Научная программа Минвуза РФ «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук. Университеты России» (гранты №№ 1669, 015.11.01.05, 015.01.01.20); Инновационная научно-техническая программа Минвуза РФ «Исследование, разработка, освоение и выпуск наукоемкой продукции для отраслей народного хозяйства на основе фундаментальных исследований» (проект № МС-38.11); Научно-техническая программа «Лазеры в народном хозяйстве и научных исследованиях» Российского центра лазерной физики (проекты №№ 3.2.16 и 3.2.17); Научно-техническая программа «Лазеры в науках о жизни» Российского центра лазерной физики (проект № 11).
6. Достоверность результатов диссертации
Достоверность полученных результатов и выводов обеспечивается адекватностью используемых физических моделей и математических методов, корректностью используемых приближений, соответствием теоретических выводов с результатами экспериментов. Достоверность экспериментальных результатов обеспечивается использованием современной измерительной аппаратуры, апробированных методик, воспроизводимостью результатов экспериментов и их соответствием экспериментальным результатам других авторов.
7. Основные результаты и положения, выносимые на защиту
1. Разработана физическая модель кожной ткани для описания закономерностей формирования спектров диффузного отражения и УФА возбужденной автофлуоресценции кожи. В модели учтены пространственные распреде-
ления рассеивающих свойств и показателя преломления кожи, а также ее хромофоров и флуорофоров.
-
Доминирующим флуорофором в формировании УФА возбужденной автофлуоресценции кожи является коллаген дермы; вклад флуорофоров эпидермиса (кератина и НАД-Н) не превышает 10%.
-
Разработаны методы определения физиологических параметров кожи (содержание меланина и крови, степень оксигенации гемоглобина крови) и солнцезащитного фактора фотозащитных препаратов по спектрам диффузного отражения и автофлуоресценции кожи.
-
Релаксация состояния поляризации света определяется экспоненциальным законом с длиной деполяризации в качестве параметра, определяющего характерное расстояние релаксации поляризации при распространении излучения в рассеивающей среде. В случае детектирования прошедшего через рассеивающую среду излучения длина деполяризации немонотонно зависит от параметра анизотропии рассеяния, достигая максимального значения в области первого резонанса Ми в зависимости сечения рассеяния частицы от дифракционного параметра, в то время как в случае детектирования обратно рассеянного излучения с ростом параметра анизотропии длина деполяризации монотонно убывает.
-
В режиме обратного многократного рассеяния излучения с исходной линейной поляризацией в неупорядоченной среде всегда частично сохраняется поляризация обратно рассеянного излучения, предельная степень которой выражается следующим соотношением:
Р * 1,5ехр
f^-mr.
где {;р - длина деполяризации, ца - коэффициент поглощения, /* - транспортная длина, у - параметр, зависящий от граничных условий.
-
Разработан метод исследования оптических свойств многократно рассеивающих сред с селективным поглощением, включая биоткани, основанный на измерении спектров степени поляризации и разности ко-поляризационной и кросс-поляризационной составляющих диффузно отраженного средой света с исходной линейной поляризацией. Спектр степени поляризации чувствителен к изменению поглощающих свойств биоткани, а разностный поляризационный спектр - к изменениям структуры и рассеивающих свойств ее подповерхностных слоев в пределах длины деполяризации в среде света с исходной линейной поляризацией.
-
Разработан метод поляризационной визуализации многократно рассеивающей среды, содержащей макронеоднородность, основанный на анализе пространственных распределений поляризационных характеристик вперед и обратно рассеянного средой линейно поляризованного света. Качество поляризационного изображения (контраст и резкость) существенно выше по сравнению с традиционными схемами оптической томографии в области переходных режимов рассеяния.
8. Апробация работы
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях и семинарах, в том числе на Междуна-
родных конференциях «Laser Application in Life Science» (LALSA'92, Jyvaskyla, Finland, 1992; LALSA'96, Jena, Germany, 1996); Международных симпозиумах «Biomedical Optics» (Budapest, Hungary. 1993; Lille, France, 1994; Barcelona, Spain, 1995; Vienna, Austria, 1996; Stockholm, Sweden, 1998); Международной конференции «Новые достижения лазерной медицины» (Москва-С.Петербург, 1993); Международном семинаре «Cell and Biotissue Optics: Applications in Laser Diagnostics and Therapy (CBO'93)» (Дубна - Нижний Новгород - Москва, 1993); Международных симпозиумах «Bioengineering and the Skin» (Cincinnati, Ohio, USA, 1994; Zurich, Switzerland, 1996); Международной конференции «The Prevention of Contact Dermatitis (ICPCD)» (Zurich, Switzerland, 1995); 4-ом Конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Brussels, Belgium, 1995); Международных симпозиумах «Biomedical Optics» (San Jose, California, USA, 1996, 1999-2002 гг.); VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996); 12-ом Международном конгрессе по Фотобиологии (Vienna, Austria, 1996); Международном конгрессе «Clinical Dermatology 2000» (Vancouver, Canada, 1996); Международной конференции «Проблемы и перспективы прецизионной механики и управления в машиностроении» (Саратов, 1997); IV-ой научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва,, 1997), Всероссийском семинаре «Проблемы и достижения люминесцентной спектроскопии» (Саратов, 1998); 7-ой Международном семинаре по Лазерной физике (LPHYS'98) (Berlin, Germany, 1998); Международном междисциплинарном научном семинаре и осенней школе молодых ученых «Методы светорассеяния в механике, биомедицине и материаловедении» (Саратов, 1998); 5-ой Международной конференции «Optics Within Life Sciences» (Aghia Pelagia, Crete, Greece, 1998); Международных школах для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting) (Саратов, 1999-2002 гг.);
2-ой Международной конференции «Фундаментальные проблемы физики» (Саратов, 2000); Международном симпозиуме «Optics and Optoelectronic Inspection and Control: Techniques, Applications and Instruments» (Beijing, China, 2000); 1-ом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2001» (Москва, 2001); а также на научных семинарах в Саратовском государственном университете.
9. Публикации
По теме диссертации опубликовано свыше 100 научных работ, в числе которых монография, глава в коллективной монографии, 25 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, 57 статей в тематических сборниках и трудах научных конференций, 1 свидетельство на полезную модель.
10. Личный вклад соискателя
Постановка основных задач, являющихся предметом исследований в диссертации, принадлежит автору. Автором диссертации проводился выбор методов решения задач, обоснование экспериментальных методик, разработка экспериментального оборудования и проведение экспериментов, разработка моделей для анализа полученных экспериментальных результатов и проведение такого анализа. Разработка алгоритмов и проведение статистическо-
го моделирования выполнено совместно с Зимняковым Д А. и Меглинским И.В На выбор направления научных исследований оказали существенное влияние научные идеи доктора медицинских наук Сергея Рудольфовича Утца, докторов физико-математических наук профессоров Дмитрия Александровича Зимняко-ва и Валерия Викторовича Тучина.
11. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения. Содержит 364 страницу машинописного текста, включая 11 таблиц и 173 рисунка, и список используемых источников, насчитывающий 562 наименований, в том числе 52 ссылки на основные публикации автора по теме диссертации.
Диссертация является обобщением научных работ автора, выполненных на кафедре оптики и кафедре лазерной и компьютерной физики Саратовского государственного университета, в лаборатории оптики и спектроскопии НИ-ИМФ СГУ и в лаборатории фотобиологии и фотомедицины Саратовского НИИ сельской гигиены Минздрава РФ.
Формирование спектра диффузного отражения кожи человека
Спектр диффузного отраженного кожей света определяется ее поглощающими и рассеивающими свойствами.
По существу, эпидермис представляет собой сравнительно тонкую многослойную клеточную структуру, содержащую специфические пигменты, защищающие дерму от УФ излучения. Наоборот, дерма представляет собой сравнительно толстый фиброзный слой, в котором рассеяние света играет значительно большую роль и который характеризуется поглощением света в диапазоне спектра, превышающем видимый диапазон, при этом поглощение локализовано главным образом в кровеносных сосудах.
Взаимодействие света с кожей носит сложный характер, который начинает проявляться уже при прохождении светом границы раздела кожа/воздух.
Граница раздела воздух-кожа не является гладкой. Она представляет собой плотной слой кератиноцитов, на котором располагаются фрагменты эпидермиса, находящиеся в стадии десквамации [12]. Из-за разных показателей преломления воздуха и рогового слоя кожи (средний показатель преломления рогового слоя п 1,5) падающее излучение частично отражается (френелевское отражение, составляющее величину порядка 5-6%), при этом из-за микроскопической неоднородности границы раздела отраженный свет носит характер зеркально-диффузного. Значительная часть пучка света (- 95%) входит в кожу, где свет рассеивается и частично поглощается другими слоями кожи,-то есть эпидермисом, дермой, базальной ламиной, кровеносными сосудами и т.д.
Другим следствием влияния границы воздух/кожа является увеличение плотности светового потока в приповерхностных слоях кожи по сравнению с падающим излучением. Причиной этого является внутреннее переотражение от границы раздела обратно рассеянного излучения [3,12,163]. Вблизи поверхности (то есть, в эпидермисе и верхней папиллярной дерме) интенсивность света может значительно превышать интенсивность падающего на кожу излучения [12].
В ультрафиолетовой (УФ) и видимой области спектра поглощение света биотканями обусловлено специфическими электронными переходами в поглощающем атоме или молекуле (хромофорными группами).
Спектры поглощения биологически важных веществ представляют собой сравнительно плавные кривые с одним или несколькими максимумами. Положение максимумов поглощения определяется количеством сопряженных двойных связей в поглощающей молекуле (увеличение количества связей приводит к сдвигу максимума в длинноволновую область спектра) и наличием гетероатомов [65]. Поэтому входящие в состав биологических тканей хромофоры имеют характерные специфические спектры поглощения.
В коже содержатся много различных хромофоров, спектральные области поглощения основных из них приведены на рис. 1.1 . В пределах каждого слоя кожной ткани поглощение света определяется несколькими доминирующими хромофорами. Спектры поглощения основных хромофоров эпидермиса приведены на рис. 1.2.
В эпидермисе роль хромофоров в коротковолновой части ультрафиолетового диапазона спектра: УФС (200-280 нм) и УФВ (280-320нм) - выполняют различные фрагменты входящих в состав белков аминокислот. В этой же спектральной области поглощают основания нуклеиновых кислот (их хромофоры - ароматические и гетероциклические кольца азотистых оснований) [1,12].
Фотометрия слоев эпидермиса показала наличие локальных пиков поглощения вблизи 260 нм у базальных кератиноцитов и около 275 нм для зернистого и рогового слоев, что является следствием утраты ДНК (максимум поглощения вблизи 260 нм) и увеличения содержания протеина (максимум поглощения около 275 нм) в процессе образования кератиноцитов и их миграции к поверхности кожи [255]. Уроканиновая кислота, являющаяся продуктом распада гистидина и селективно сохраняющаяся в эпидермисе, имеет высокую оптическую плотность в полосе около 265-275 нм [256].
Уроканиновая кислота помимо прочих функций играет роль «эндогенного фотозащитного препарата». Она присутствует в выделяемом кожей поте, а также в большом количестве присутствует в роговом слое. Уроканиновая кислота хорошо водорастворима, что сильно влияет на реакцию кожи на УФВ излучение: помещение в воду образцов кожи на 30 минут снижает УФВ минимальную эритемную дозу приблизительно на 35% [12]. Изменения в спектрах пропускания УФС и УФВ излучения in vitro образцов эпидермиса под действием водной среды служат основой для оценки количества урако-ниновой кислоты, экстрагированной в воду. =Меланин является основным хромофором эпидермиса, хорошо поглощающим свет как в УФА, так и видимой и ближней инфракрасной (ИК) областях спектра [2,12,17,29,53,220,257-259].
Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектрам диффузного отражения
Спектры диффузного отражения дают возможность количественно оценивать содержание основных хромофоров биотканей. Особенностью отражательной спектроскопии биотканей является то, что единственной измеряемой величиной является коэффициент диффузного отражения Rd. Величина коэффициента диффузного отражения дает только качественную картину наличия в среде поглощающих компонентов. Количественная оценка их содержания возможна путем анализа величины «эффективной оптической плотности» рассеивающей среды OD, которая связана с коэффициентом диффузного отражения Rd простым соотношением [8,25]: Величина OD введена по аналогии с величиной оптической плотности D прозрачной или слабо рассеивающей среды, которая определяется коэффициентом коллимированного пропускания образца Т: и пропорциональна коэффициенту поглощения среды jua: В отличие от оптической плотности D эффективная оптическая плот ность OD рассеивающей среды зависит не только от поглощающих свойств среды, но и от ее рассеивающих свойств. Одним из следствий рассеяния света в среде является искажение измеряемых спектров эффективной оп тической плотности по сравнению с истинными спектрами поглощения со держащихся в среде хромофоров. Поэтому адекватность определения поглощающих свойств рассеивающей среды по спектрам диффузного отражения зависит от пространственного распределения хромофоров внутри среды [227,228]. На рис. 2.11 и рис. 2.12 приведены результаты экспериментального исследования влияния рассеивающих свойств модельных образцов на спектры оптической плотности гемоглобина и меланина.
В качестве модельных образцов были взяты водные растворы крови и меланина (в случае измерения спектров пропускания) и модельные рассеивающие среды (50% смесь вода-молоко), содержащие хромофоры той же концентрации (в случае измерения спектра диффузного отражения). Выбор в качестве поглощающих компонентов крови и меланина обоснован тем, что они являют ся основными хромофорами кожи человека. Хотя спектры кажущейся оптической плотности (рис. 2.11а и рис. 2.12а) качественно согласуются со спектрами оптической плотности, полученными из спектров коллимированного пропускания (рис. 2.116 и рис. 2.126), между ними есть определенные различия. Основное различие заключается в том, что спектры OD демонстрируют по сравнению со спектрам D увеличение оптической плотности с ростом длины волны. Следствием этого является уменьшение различия в интенсивностях пиков поглощения гемоглобина (рис. 2.8) и разный характер спектров поглощения меланина (рис. 2.9). Причиной такого различия является рассеяние света в базовой среде (раствор молока). Для неупорядоченной рассеивающей среды эффективное значение относительного размера рассеивающей частицы ка (к = 2л/Л, а - характеристический размер элементарного рассеивателя) уменьшается с ростом длины волны, что приводит к увеличению среднего значения транспортной длины Г и, соответственно, уменьшению транспортного коэффициента рассеяния ju s (ju s = \/I ) [22]. Диффузионное приближение теории переноса излучения позволяет определить влияние рассевающих свойств среды на коэффициент диффузного отражения.
В случае полубесконечной среды выражение для коэффициента диффузного отражения Rd имеет вид [301]: где a = M S КМа + Ms) Ma - коэффициент поглощения; А = 1,078 (для границы раздела воздух/молоко). Соответствующее значение OD может быть определено из (2.4) с использованием (2.1). Рис. 2.13 иллюстрирует эффект увеличения OD с уменьшением ju s. Таким образом, использование спектров OD(/l), полученных из измерений спектров диффузного отражения биотканей, для количественной оценки содержащихся в ней хромофоров возможно при таких концентрациях хромофоров и в таких спектральных диапазонах, где коэффициент ju s слабо зависит от длины волны. Измерения коллимированного пропускания и диффузного отражения света от образцов биоткани позволяют определить спектральную зависимость n s{X). Экспериментальные результаты, представленные на рис. 2.11а и рис. 2.12а, позволяют определить спектральные зависимости коэффициента поглощения поглощающих компонентов (кровь и меланин) в растворах. В свою очередь, полученные спектры поглощения jua(A) позво ляют с помощью метода наименьших квадратов путем сопоставления ре зультатов расчета по (2.4) с экспериментальными данными по диффузному отражению света определить спектральную зависимость транспортного ко эффициента рассеяния для 50% раствора молока. Приведенные на рис. 2.14 спектральные зависимости ju s(X), полученные с использованием из мерений спектров коллимированного пропускания и диффузного отражения растворов крови, хорошо согласуются с результатами поляризационных измерений (см. Главу 5). В ряде случаев хромофоры в биологических тканях распределены в виде тонких слоев вблизи поверхности среды. Примером являются распре деления меланина и гемоглобина в кожной ткани, гемоглобина в субэпите лиальном слое ткани шейки матки и др. Такую биологическую ткань можно представить как двухслойную (трехслойную и т.д.) среду, каждый слой которой однородно пропускает и рассеивает свет, пропускание и рассеяние света каждым из слоев могут быть описаны формулами, обычно используемыми для описания диффуз ного рассеяния света порошками [302], и границы между слоями не влияют существенно на пропускание и отражение света всей системой в целом. То есть, модельная система предполагает наличие процессов погло щения и рассеяния света в каждом из двух слоев однородными частицами, которые хаотически распределены в слое и чьи размеры значительно меньше толщины слоя.
Количественная оценка содержания хромофоров в биоткани по спектрам ее АФ
Количественно оценивать содержание в биотканях поглощающих компонентов возможно путем введения величины эффективной оптической плотности рассеивающей среды с поглощением, аналогичной величине OD, определяемой выражением (2.1). В отличие от введенной в Главе 2 величины эффективной оптической плотности, определяемой коэффициентом диффузного отражения среды Rd\ новая величина определяется интенсивностью АФ биологической ткани. Ввести величину эффективной оптической плотности среды, определяемую интенсивностью АФ, достаточно просто, предположив, что флуоресценция биоткани обусловлена флуорофорами, пространственно распределенными по глубине среды, а поглощающий компонент распределен в тонком слое вблизи поверхности среды (рис. 3.8). Функция T(XFL,z) определяет ослабление выходящей из среды флуоресценции хромофором слоя 1 и может быть представлена следующим образом: где (ЛГ1) - коэффициент экстинкции хромофора слоя 1 на длине волны флуоресценции, Cj - концентрация хромофора в этом слое, dx - толщина слоя. Усредненное значение плотности потока возбуждающего излучения в слое 2 может быть представлено в виде: где /0( Л-) " интенсивность возбуждающего излучения, падающего в виде коллимированного пучка на поверхность среды, є Л ) - коэффициент экстинкции 1-го слоя на длине волны возбуждающего излучения. Тогда интенсивность выходящей из среды флуоресценции можно выразить следующим образом: Нормировка интенсивности флуоресценции 12(Лп) на величину {ЛЕХ Лрі)І0(Лру) позволяет определить величины Величина OD может быть названа эффективной оптической плотностью слоя 1 рассеивающей среды, так как она прямо пропорциональна его поглощающим свойствам. В отличие от величины оптической плотности OD, полученной из спектров отражения кожи, изменения OD определяются изменением в поглощении слоя 1 на длинах волн возбуждения и излучения, но так как поглощение хромофоров слоя 1 пропорционально концентрации Сх этих компонентов (не зависимо от длины волны излучения), то изменение величины эффективной оптической плотности OD однозначно определяется изменением содержания хромофоров в этом слое.
Из результатов измерения спектров АФ биоткани чрезвычайно трудно получить абсолютную количественную информацию о содержащихся в ней флуорофоров (и/или хромофоров), прежде всего из-за сложности определения квантового выхода флуоресценции т], поэтому флуоресцентный анализ обычно используется для определения относительных изменений содержания флуорофоров (и/или хромофоров) в биоткани. В отличие от отражательной спектроскопии, где нормировка отраженного кожей света на известный эталон с высоким отражением (типа BaS04) дает возможность определять абсолютные значения коэффициента отражения Rd и оптической плотности OD, флуоресцентная спектроскопия позволяет измерять только относительные изменения поглощающих свойств кожи. Изменения OD определяются только изменениями в интенсивности флуоресценции: где 1FLX и IFL2 -два сравниваемых значения интенсивности флуоресценции среды (при идентичных условиях измерения). Так как изменения OD не зависят от величины rjl0, то ]10 можно выбрать таким образом, чтобы значения R и Rd были одного порядка. Типичный спектр АФ кожи, возбужденной УФА светом, приведен на рис. 3.9. Анализ представленного спектра можно провести на основе простой модели кожной ткани. Согласно этой модели кожу можно представить как трехслойную структуру, состоящую из эпидермиса, папиллярной дермы и слоя дермы под папиллярной дермой (рис. 3.10).
Предполагается однородное пространственное распределение флуо-рофоров, дающих вклад в АФ: НАД-Н и кератина - в эпидермисе, коллагена - в дерме. Вклад флуоресценции рогового слоя и эпидермиса в общую флуоресценцию кожи мало меняется при эритеме или внешнем механическом давлении. Как возбуждающее излучение, так и флуоресценция коллагена при распространении в коже частично поглощается слоями, содержащими кровь и меланин. Интенсивность IAF АФ кожи определяется флуоресценцией /j эпидермиса (НАД-Н, кератин) и флуоресценцией /4 дермы (коллаген). При этом, как показано выше, общий вклад эпидермальных флуорофоров в АФ кожи составляет величину порядка 10%. Неучет флуоресценции эпидермиса в рассматриваемой модели определяет погрешность метода. Однако нужно принять во внимание, что флуоресценция эпидермиса вносит постоянный вклад в АФ кожи и мало влияет на зависимость OD от содержания в коже гемоглобина и меланина. Передаточная функция Т(Л ,z), определяющая ослабление флуоресценции коллагена по мере ее выхода из кожной ткани, может быть представлена следующим образом
Методика расчета цветовых характеристик отраженного кожей белого света и АФ кожи
Количественная (яркость) и качественная (цветность) характеристики цвета диффузно отраженного кожей белого света определяются с использованием колориметрической системы MK01931(ATZ), принятой МКО (Международная комиссия по освещению) в 1931г. (система CIE1931(jP3cy)). Цвет диффузно отраженного кожей белого света, имеющего спектральное распределение Rd(X), рассчитывается следующим образом. Сначала рассчитываются три координаты цвета согласно приведенным ниже соотношениям: где x(A.),y(A.),z(/t.) - удельные координаты цвета монохроматического излучения на длине волны Л,, средней в интервале АЯ (АЯ= 5 нм), /е(Лу) спектр падающего на поверхность кожи излучения стандартного источника белого света С (по классификации МКО).
Координата цвета Y определяет яркость цвета диффузно отраженного кожей излучения (в процентном отношении к яркости цвета белого света, диффузно отраженного от стандартного отражающего объекта (типа BaS04), принятой за 100%). Цветовые координаты X, Y, Z определяют две координаты цветности х, у: которые определяют цветность отраженного кожей белого света в виде точки на диаграмме цветности (х,у). Количественно цветовое различие между двумя цветами, определяемое величиной, выраженной минимальным числом цветовых порогов и называемой цветовым контрастом, возможно при использовании равнокон-трастных колориметрических систем, в частности, равноконтрастной системы МК01976( L a b ). Использование системы MK01976(Z,W) для цветового анализа спектров отражения и АФ кожи, представленного в настоящей работе, оправдано тем, что она положена в основу широко используемого в дерматологии колориметра Minolta Chroma Meter, что позволяет сравнивать результаты наших исследований с зарубежными публикациями. В системе MK01976(LW) цвет представляется в виде вектора в пространстве, где параметры L , а \л Ь образуют декартову систему координат [438,444-446] (рис. 4.1): Параметр L определяет равноконтрастную шкалу светлоты ("психометрическую светлость", относительную яркость, "градацию серого" цвета). Параметры а и Ь являются координатами цветности (а меняется от зеленого цвета к красному, Ь - от синего к желтому).
Они определяют основной цвет (hue) и его насыщение (chroma): Цветовое различие АЕ в системе MK0 976(L a b ) определяется как геометрическое расстояние между сравниваемыми цветами (L ,a ,b )j и (L ,a ,b )j в пространстве (L a b ) (см. рис. 4.1): Цветовой анализ может быть расширен на восприятие цвета АФ кожи. Флуоресценция кожи, возбужденная УФА излучением, происходит в видимом диапазоне спектра, что дает основание проводить количественную оценку изменения цвета АФ кожи, происходящего в результате изменения состояния кожи. Координаты цвета АФ кожи рассчитываются по формулам, аналогичным (4.1)
