Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы
Глава 1. Типы и природа повреждений ДНК 7
1.1. Нарушения спаривания оснований 7
1.2. Спонтанные повреждения ДНК 7
1.3. Индуцированные повреждения ДНК 11
Глава 2. Повреждения оснований ДНК активными формами кислорода 13
2.1. Генерация активных форм кислорода 21
2.2. Антиоксидантная защита клетки 26
2.3. Роль АФК в биологических системах и окружающей среде 33
2.4. 8-Оксогуанин - биологический маркер окислительной модификации ДНК
2.4.1. Генотоксичность 8-оксогуанина: неоднозначные матричные и субстратно-кодовые свойства 41
2.4.2. Роль 8-оксогуанина в развитии болезней и старения 46
Глава 3. Репарация АР-сайтов и 8-оксогуанина в ДНК 49
Часть II. Экспериментальное исследование
Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1. Материалы 57
4.2. Депуринизация ДНК 57
4.3. Депуринизация oxo8dG, oxo8rG, Юи rG 58
4.4. Определение тепловой продукции гидроксильных радикалов в морской воде 59
4.5. Определение фотохимической продукции ОН-радикалов в морской воде 60
4.6. Определение тепловой продукции ОН-радикалов в бидистиллированной воде 61
4.7. Определение тепловой продукции ОН-радикалов в фосфатном буфере (1 мМ, рН6,6) 61
4.8. Определение восстанавливающего агента в морской воде 61
ЧАСТЬ III. Результаты исследования и их обсуждение
Глава 5. Депуринизация гуанина в ДНК 62
Глава 6. Депуринизация 7,8-дигидро-8-оксо-2 -дезоксигуанозина, 7,8-дигидро 8-оксогуанозина, 2 -дезоксигуанозина и гуанозина 71
Глава 7. Генерация гидроксильных радикалов в воде и водно-солевых растворах под действием тепла 76
Глава 8. Образование восстанавливающего агента в морской воде под действием тепла 91
Заключение 98
Выводы 100
Список основных сокращений и обозначений 102
Список цитируемой литературы
- Спонтанные повреждения ДНК
- Роль АФК в биологических системах и окружающей среде
- Определение тепловой продукции гидроксильных радикалов в морской воде
- Генерация гидроксильных радикалов в воде и водно-солевых растворах под действием тепла
Спонтанные повреждения ДНК
Супероксидный анион-радикал ( Ог") является продуктом присоединения одного электрона к молекулярному кислороду, находящемуся в триплетном состоянии (рис.3). Протонирование Oi приводит к образованию более активного гидроперекисного радикала (НОг ), являющегося слабой кислотой с рКа= 4,8 (при рН 7,4 на 1 молекулу НОг приходится 400 молекул Ог" [Владимиров и др., 1991]). Супероксидный радикал малоактивен, но более реакционноспособен, чем молекулярный кислород: его время полужизни в биологических системах составляет 10"6 с, радиус диффузии - 0,3 мкм [Зенков, Меньшикова, 1993]. Обычно "Ог" в физиологических условиях проявляет свойства слабого окислителя, но может выступать и как донор электронов, восстанавливая, например, ионы металлов переменной валентности: Fe3+ + "Ог" -» Fe2+ + О2 [Зенков и др., 2001]. Будучи нуклеофильным соединением и неся заряд, Oi с трудом мигрирует через мембраны, но легко окисляет мембранные фосфолипиды [Prasad, Das, 1989]. Супероксидный радикал активирует фосфолипазу А2 [Madesh, Balasubramanian, 1997], способен инактивировать каталазу, папаин, орнитин-декарбоксилазу, глутатионпероксидазу, Са2+-АТФазу [Suzuki, Ford, 1991]. In vivo основными источниками образования 0{ являются ферментативные системы: цитохром-с-оксидаза комплекса IV переноса электронов митохондрий, НАДФН-оксидаза фагоцитов, монооксигеназы микросом, ксантиноксидаза [Зенков и др., 2001]. Кроме ферментативных реакций, одноэлектронное восстановление кислорода происходит при взаимодействии последнего с легко окисляющимися соединениями - НАДФН, ионами переходных металлов и др. Согласно одной из оценок [Halliwell, 1994], в организме человека за счет "утечки" на молекулярный кислород электронов с митохондриальной и микросомальной электрон-транспортных цепей за год образуется 2 кг супероксидных анион-радикалов. Одна митохондрия производит супероксидных радикалов в сутки [Richter, 1994]. Продукция 0{ мембраносвязанной НАДФН-оксидазой фагоцитирующих клеток (моноциты, гранулоциты, перитонеальные и альвеолярные макрофаги) важна для реализации их бактериостатического, микробицидного, цитотоксического действия; при стимуляции фагоциты могут генерировать 1 нмоль "Ог /ч на тысячу клеток [Murrell, Bromley, 1990]. Супероксидный анион-радикал даёт начало другим формам АКМ: присоединение электрона и протонов приводит к образованию перекиси водорода; гидроксильный радикал и синглетный кислород образуются в реакции Габера-Вайса (Haber-Weiss) ( Ог" + Н2О2 - "ОН + ОН" + хОг)\ высокореакционный пероксинитрит (ONOO") возникает при взаимодействии с окисью азота ("NO) [Saran et al., 1990].
Перекись водорода образуется путём присоединения двух электронов к молекуле кислорода или одного - к супероксидному аниону с последующим протонированием образовавшегося двухзарядного аниона. Перекись водорода, не будучи радикалом, является окислителем умеренной силы (способна окислять, например, тиолы). В водных растворах молекула Н2О2 достаточно стабильна (в отсутствие каталазы, пероксидаз и ионов переходных металлов) и не несёт электрического заряда. Это позволяет Н2О2 легко мигрировать через гидрофобные мембраны. Внутри клетки перекись водорода, взаимодействуя с ионами железа или меди, разлагается с образованием высокоактивного гидроксильного радикала, чем и объясняют токсическое действие Н2О2 [Halliwell, Gutteridge, 1986]. Механизмы реализации цитотоксического действия Н2О2 разнообразны. Так, перекись водорода вызывает гибель NK-клеток посредством апоптоза [Hansson et al., 1996]; в клетках респираторного эпителия индуцирует образование однонитевых разрывов ДНК [McDonald et al., 1993]; ингибирует трансмембранный перенос ионов вследствие индукции процессов ПОЛ [Demiera, Rudy, 1992]; активирует фосфолипазу D2 [Oh et al., 2000]; инактивирует ингибитор протеиназ [Wu, Pizzo, 1999]; инактивирует каталазу, глутатионпероксидазу, Си,2п-С0Д [Pigeolet et al., 1990; Salo et al., 1990]. В присутствии каталитически активных ионов железа цитотоксическое действие перекиси водорода увеличивается на 1-3 порядка [Link, 1990]. Миелопероксидаза (МПО) гранулоцитов разлагает Н2О2 с образованием цитотоксичных гипогалоидов, например: СГ + Н2О2 —» ОСТ + Н20 [Weiss, 1989]. Считается, что внутриклеточные системы защиты от перекиси водорода делают клетки резистентными к концентрациям Н2О2 до 50 мкМ [Зенков и др., 2001]. В клетках животных основным источником перекиси водорода являются ферменты: оксидазы (ксантиноксидаза, оксидазы L- и D-аминокислот, уратоксидаза и пр.), локализованные в пероксисомах -органеллах, осуществляющих метаболизм аминокислот и ксенобиотиков, (3-окисление жирных кислот, биосинтез липидов, окисление полиаминов и другие функции [Del Rio et al., 1992], а также СОД, катализирующая реакцию дисмутации 02 (рис.3).
Гидроксильный радикал обладает наиболее высокой химической активностью среди АФК: скорости его реакций с большинством органических молекул ограничиваются лишь скоростью диффузии ОН. Гидроксильный радикал способен разрывать любую С-С и С-Н-связь, участвуя в реакциях трёх основных типов: 1) отрыв атома водорода, 2) присоединение по двойной связи, 3) перенос электрона [Владимиров и др., 1991]. Время жизни ОН-радикала в биологической среде составляет 10" с, а радиус диффузии 0,01 мкм [Зенков, Меньшикова, 1993]. Вследствие этого место образования и место вступления в реакцию ОН находятся в непосредственной близости друг от друга, а сама реакция совершенно неселективна: "мишенью" становится любая ближайшая органическая молекула. Гидроксильный радикал образуется в процессе радиолиза воды при действии ионизирующих излучений на организм (для чистой воды и редкоионизирующих излучений (?он= 2,7 молекул/100 эВ поглощённой энергии [Тимофеев-Ресовский и др., 1981]), при взаимодействии гипохлорита с ионами железа [Осипов и др., 1993], в реакциях с пероксинитритом [Beckman et al., 1990], но основным механизмом образования "ОН в биологических системах является реакция Фентона (Fenton) при участии ионов металлов переменной валентности (в основном, Fe2+ и Си+) [Меньшикова и др., 1994]: Н2О2 +- Fe2+ — Fe3+ + "ОН + ОН". Ионы Си+ заметно активнее Fe2+ при сопоставимых концентрациях в окислительном повреждении ДНК [Aruoma et al., 1991]. Показана возможность участия в реакции разложения Н2О2 ионов других переходных металлов (Mn2+, Со2+, V2+, Сг4+), металлопротеинов [Goldstein et al., 1993]. Ионы железа и меди проявляют каталитическую активность и в хелатированном состоянии [Que et al., 1980; Kachur et al., 1998]. В клетке ионы железа в окисленной форме депонируются ферритином [Orino et al., 2001]. Другими источниками железа являются гемоглобин и микросомы. Расчёт показывает [Владимиров и др., 1991], что скорость генерации ОН в клетке составляет 34 радикала в секунду (в предположении, что внутриклеточная концентрация Fe2+ и Н2Ог не превышает 1 мкМ каждая). Полагают [Imlay, Linn, 1988], что ОН-радикалы обусловливают преобладающую часть цитотоксического действия АФК. Гидроксильные радикалы опосредуют микробицидное действие NK-клеток [Duwe et al, 1985], вызывают повреждение фибронектина [Vissers, Winterbourn, 1991] и мембранных белков [Richards et al., 1988], ДНК [Imlay, Linn, 1988], индуцируют ПОЛ [Владимиров и др., 1991].
Синглетный кислород возникает при изменении спина одного из неспаренных электронов молекулярного кислорода на "антипараллельный" относительно спина второго электрона. Существуют две формы (состояния) синглетного кислорода, Zg+ и Ag, но биологическое значение имеет только последняя. Энергия синглетного кислорода Ag02 на 96,3 кДж/моль превышает энергию триплетного состояния. В биологических системах Ог образуется как сопутствующий продукт в ряде реакций с участием АКМ (в том числе ферментативных), основными из которых являются [Зенков, Меньщикова, 1993]: 1) реакции диспропорционирования (2 02 + 2 Н+ - Н2О2 + Ог; 2 Н2О2 — 2 НгО + Ог), 2) реакции с участием миелопероксидазы (ОСГ + Н2О2 - СГ + НгО + Ог), 3) реакции разложения перекиси водорода каталазой (2 Н2О2 — 2 НгО -ь 1Ог), 4) реакция гидроксильного радикала с супероксидом ( 0{ + ОН +- Н+ — НгО + Ог). Время жизни синглетного кислорода в биологических субстратах составляет 10"6 с, радиус диффузии 0,3 мкм [Зенков, Меныцикова, 1993]. Основными тушителями Ог являются фенольные антиоксиданты, аскорбат, Р-каротин, белки [Осипов и др., 1990]. Синглетный кислород обладает высокой реакционной способностью, участвуя в инициировании ПОЛ [Владимиров и др., 1991], повреждении клеточных белков [Dahl, 1993] и ДНК [Eisenberg et al., 1992], опосредуя микробицидное действие нейтрофилов [Tatsuzawa et al., 1999]. Существенна роль О2 в фотобиологии: в присутствии фотосенсибилизатора кванты света видимого диапазона (400-700 нм) эффективно (с высоким квантовым выходом) переводят молекулы кислорода в синглетное состояние; это явление положено в основу фото динамической терапии опухолей [Dougherty, Marcus, 1992].
Роль АФК в биологических системах и окружающей среде
Указанные методы существенно различаются не только по чувствительности, но и по своей себестоимости, сложности, продолжительности анализа (так, анализ 32Р-постмечением занимает несколько суток).
Хотя охо G является лишь одним из нескольких десятков продуктов окислительной модификации азотистых оснований, определяемых в ДНК [Dizdaroglu, 1991, 1994], именно он рассматривается и широко используется в качестве наиболее репрезентативного биомаркера окислительного повреждения ДНК in vivo [Shigenaga, Ames, 1991]. Тому есть несколько причин: 1) количественное преобладание oxo8G над другими аддуктами ДНК (составляет -5% от общего их числа [Dizdaroglu, 1992]), 2) лёгкость образования oxo8G в условиях окислительного стресса любой этиологии и относительная стабильность этого продукта, 3) биологическая значимость oxo8G ввиду его высокого мутагенного потенциала, 4) наличие надёжных, чувствительных, высокоспецифичных, достаточно простых и относительно недорогих, а потому доступных, методов детекции охо (d)G как в ДНК in vitro, так и в клетках и тканях in situ и in vivo, а также в культуральной и биологических жидкостях. Некоторые методы (HPLC-ECD, иммунохимия) позволяют неинвазивно проводить постоянный биомониторинг у людей, по содержанию в моче oxo8dG (продукта эксцизионной репарации ДНК эндонуклеазой) и/или oxo8G (продукта репарации гликозилазой) оценивая скорость и степень окислительного повреждения ДНК, а также уровень баланса между скоростями повреждения и репарации ДНК [Shigenaga et al., 1989; Loft, Poulsen, 1996]. Т.е. уринарный уровень oxo d представляет собой интегральный индекс, отражающий степень окислительного стресса в организме, тогда как стационарное (steady-state) содержание охо (d)G в ДНК является мерой кумулятивного окислительного повреждения ДНК. Вместе с тем, в последние годы всё более актуальной становится проблема расхождения результатов количественного определения oxo8(d)G, выполненного в различных лабораториях на близких объектах одинаковыми или (тем более) различными методами [Collins et al., 1996; Helbock et al., 1998; Evans et al., 1999]. Количество oxo8G в ДНК тканей человека, согласно сообщениям разных групп исследователей, колеблется от 1 аддуктана 107 оснований до 1 oxo8G на 103 оснований ДНК [Cadet et al., 1997]. Недавно в рамках единого проекта под эгидой Европейского комитета ESCODD (European Standards Committee for Oxidative DNA концентрация oxo8dG в моче человека составляет около 5-30 нМ (для сравнения: в плазме крови -около 70-120 пМ) [Жанатаев и др., 2002]. Damage) более десяти лабораторий независимо измеряли содержание охо G в коммерческой ДНК тимуса телёнка из одной партии, при этом уровень oxo8G составил (число охо G на 10 оснований ДНК): 21,5-86,7 при измерении методом GC/MS, 10,5-39,4 - методом HPLC-ECD, 12,3-37,2 - методами иммунохимии, LC/MS и 32Р-постмечения, и лишь половина результатов была близка к медианному значению [ESCODD, 2000].
Полагают, что причинами различий в результатах могут являться: артефактное окисление ДНК в длительном процессе её выделения из ткани и очистки, особенно фенольным методом [Claycamp, 1992; Finnegan et al., 1996]; кислотный гидролиз ДНК (способствующий депуринизации) и дериватизация ; образцов при подготовке к GC/MS [Cadet et al., 1998; Jaruga et al., 2000]; загрязнение образцов ДНК ионами переходных металлов (с буфером, ферментами) и их последующий контакт с воздухом [Nakajima et al., 1996]. При измерении в моче oxo8dG источником артефактов может служить oxo8dG из ДНК погибших (апоптотических) клеток, из митохондриальной ДНК, из внутриклеточного пула dGTP; при измерении в моче oxo8G к завышению результата может приводить oxo8G из РНК; причиной же заниженной оценки уровня oxo8(d)G может быть его окисление in vivo [Helbock et al., 1998]. Следует отметить, что у человека (в отличие от крыс) диета не влияет на уровень oxo8(d)G в моче [Gackowski et al., 2001].
Предполагается, что указанная проблема расхождения результатов может быть в основном преодолена благодаря унификации и стандартизации используемых методик и экспериментальных условий, а также устранением известных источников артефактов [ESCODD, 2000]. Кроме того, для повышения надёжности результатов предложено измерять не один, а одновременно несколько продуктов окислительного повреждения ДНК [Podmore et al., 1998; Ravanat et al., 1999; Whiteman et al., 2002]. В качестве альтернативы oxo8(d)G предложено [Mamett, 2000] использовать другой биомаркер окислительного стресса - тиминовые гликоли, для определения которых разработан надёжный и чрезвычайно чувствительный метод (предел обнаружения -3 10"21 моля Tg) [Le et al., 1998]. обработка гидролизата ДНК смесью Л/ ,(9-ЬІ5(триметилсилил)трифлюороацетамид (BSTFA) -ацетонитрил (и/или пиридин) для придания основаниям/нуклеозидам летучести [Ravanat et al., 1995]. Охо G является генотоксической предмутагенной модификацией гуанина [Полтев и др., 1993; Wang et al., 1998]. Согласно квантово-химическим расчетам аЪ initio, среди четырёх таутомеров oxo8dG наиболее стабильна и энергетически выгодна 6,8-дикетоформа [Aida, Nishimura, 1987]. Спектроскопический (УФ, ИК, ЯМР) анализ показал, что, вследствие стерических особенностей молекулы oxo8dG, в водном растворе при физиологических рН преобладает 6,8-дикето таутомер в «-ориентации относительно гликозидной связи (тогда как немодифицированным основаниям в ДНК свойственна шШ -конформация) [Culp et al, 1989; Cho et al., 1990]. Теоретически возможно образование пар охо G(syri):C, охо G(syn):A, охо G(syn):G, охо G(anti):A, oxo G(antiy.TFU (wobble-пара), oxosG(anti):C, причём последняя аналогична по своей геометрии нормальной уотсон-криковской паре G:C (рис.5). Как показал расчёт [Poltev et al., 1990], энергия взаимодействия оснований и их взаимное положение в охо80-содержащих парах практически не отличается от аналогичных пар, содержащих гуанин. Рентгеноструктурный анализ кристалла охо G-содержащего додекамерного дуплекса, а также ЯМР-анализ 12-мерного дуплекса, включающего охо G, выявили стабильную хугстиновскую пару охо G(syn):A(anti), которая геометрически корректна и не вносит заметных конформационных изменений в сахарофосфатный остов [Kouchakdjian et al., 1991; McAuley-Hecht et al., 1994]. Показано также существование в составе олигомерных дуплексов пары oxos G(anti):C(syn) [Oda et al., 1991]. Экспериментально показано, что относительная стабильность пар оснований меняется в ряду: охо G(anti):C = G:C » охо G(syn):G oxo8G(syn):A oxosG(syn):T s T:A [Gannett, Sura, 1993], т.е. мутагенным потенциалом обладает только oxo8G(s w)(noCKOJlbKy oxosG(anti) считывается правильно, - как G), проявляя неоднозначные кодовые свойства С Т А. При изучении синтеза ДНК in vitro на охо80-содержащих матрицах одними авторами, использовавшими ДНК-полимеразу I (Pol I), наблюдалось включение А, Т, С и G напротив oxo8G с почти одинаковой частотой [Kuchino et al., 1987], другие авторы [Shibutani et al., 1991] показали, что включаться могут только С или А с соотношением частоты включения, определяемым использованной полимеразой (POLct, POLp , POLS , Pol III). Pol I, обладающая 3 -5 экзонуклеазной активностью, не распознаёт пару A(anti):oxo%G(syn) как ошибочную (в отличие от пары A(anti):G(syn)) вследствие, по-видимому, её относительно высокой термодинамической стабильности [Shibutani et al., 1991; McAuley-Hecht et al., 1994]. При исследовании мутагенной специфичности oxo8G in vivo с использованием E.coli,
Определение тепловой продукции гидроксильных радикалов в морской воде
Для сравнения оценим также вклад в образование ОН-радикалов в морской воде в естественных условиях, вносимый природным радиационным фоном (ПРФ). С учётом того, что мощность поглощённой дозы, обусловленной ПРФ, составляет 7,6 10"п Гр с 1 [Усачёва и др., 1995], а радиационно-химический выход образования гидроксильных радикалов при радиолизе воды, как указано выше, эквивалентен 0,27 мкМ Гр"1, средняя скорость образования ОН под действием ПРФ равна: v = 2,05 10"17 М с"1, что на три порядка величины меньше скорости тепловой генерации гидроксильных радикалов при 28С.
В табл. 10 представлены результаты исследования влияния различных агентов на процесс генерации гидроксильных радикалов при нагревании. Отчетливо выявляется "кислородный эффект" - зависимость величины константы скорости этой реакции от количества растворённого кислорода (табл.10, № 7). Ускоряет протекание реакции добавление в среду экзогенного Ре2+(габл.10, № 8). С другой стороны, реакцию ингибируют как каталаза (табл. 10, № 2), так и селективный (фенантролин) и неселективный (ЭДТА) хелаторы ионов железа (табл.10, №№ 4,5). Это, возможно, свидетельствует о том, что тепловая генерация ОН-радикалов в морской воде протекает отчасти по фентоновскому механизму. Реакция подавляется в различной степени известными перехватчиками гидроксильных радикалов -диметилсульфоксидом (DMSO) [Steiner, Babbs, 1990] и трисом [Hicks, Gebicki, 1986] (табл.10, №№1,3). Дефероксамин/десферал (табл.10, №№ 8-12), хелатор ионов металлов переменной валентности, используемый, в частности, в клинике в качестве антидота-комплексона при острых отравлениях железом и при некоторых других состояниях, связанных с нарушением обмена железа в организме (гемохроматоз, гемосидероз) [Машковский, 1993], оказывает парадоксальное действие, вызывая резкое увеличение генерации гидроксильных радикалов. Даже при наименьшей из исследованных концентраций, равной 20 мкМ, и температуре, близкой к физиологической (40С), реагент многократно увеличивает константу скорости реакции. Можно полагать, что процессы, протекающие в морской воде и в плазме крови, аналогичны ввиду значительной близости их химического состава [Хорн, 1972; Уайт и др., 1981]. (Заметим, что при терапевтическом применении десферала по традиционной схеме, его концентрация в крови пациента в ближайшее после инъекции время составляет около 150 мкМ. Высшая терапевтическая доза соответствует концентрации препарата в плазме крови -500 мкМ [Summers et al., 1979].) Приведённые данные позволяют предполагать существование побочных эффектов при применении десферала, не учитывавшихся прежде, а также предложить механизм, объясняющий развитие некоторых уже известных (например, помутнение хрусталика у животных в эксперименте при длительном применении больших доз этого препарата [Машковский, 1993]). Очевидно, для уточнения эффектов, оказываемых десфералом на организм, целесообразно проведение дополнительных исследований in vivo.
Ранее было показано опосредуемое ионами железа образование свободных радикалов в присутствии дефероксамина (DFO) [Knecht et al., 1993], также обращалось внимание на способность десферала ускорять аутоокисление железа в комплексе "Fe2+- десферал", сопровождающееся генерацией активных форм кислорода [Владимиров и др., 1991]. Отмечалось [Yang, Schaich, 1996], что дефероксамин в концентрациях 100 мкМ усиливает повреждающее действие липидных гидроперекисей на ДНК. Показано радиосенсибилизирующее действие DFO на клетки млекопитающих линии V79 [Samuni et al., 2001].
Чем вызвано стимулирующее действие дефероксамина на тепловую продукцию ОН-радикалов? Не исключено, что наблюдаемый эффект объясняется особенностью методики: возможно, дефероксамин способен образовывать тройной комплекс "молекула DFO - ион металла - молекула ККК", а взаимодействие такого комплекса с Н2Ог будет обеспечивать сайт-специфичную генерацию радикалов и, тем самым, повышенную эффективность окисления кумарина. Ранее подобный механизм предлагался для объяснения усиленного окисления белков в системе "хелатор - ион металла - белок" [Stadtman, 1990]. Возможно также, что наблюдаемый эффект обусловливается химическими свойствами дефероксамина, представляющего собой производное гидроксамовой кислоты. Недавно сообщалось [Левина и др., 2001], что гидроксамовые кислоты потенциально являются эффективными донорами окиси азота (NO). Последняя, посредством образования пероксинитрита, может служить дополнительным источником гидроксильных радикалов. Согласно предложенному правилу [Welch et al., 2002], хелаторы железа, в которых лигандами иона являются атомы кислорода, стабилизируют Fe +, снижая его окислительно-восстановительный потенциал и увеличивая реакционную способность, тогда как хелаторы с лигандами-атомами азота или серы стабилизируют Fe2+, повышая его ОВП и уменьшая реакционность; DFO относится к первой группе хелаторов. Десферал способен восстанавливать ионы Cu2+ [VanReyk, Dean, 1996], содержание которых (Cu2+/Cu+) в естественной океанской воде составляет 5 нМ [Twiss, Moffett, 2002]. Ионы меди в морской воде участвуют в образовании перекиси водорода [Moffett, Zika, 1987].
Как видно из табл.10 (№ 6), тепловую продукцию ОН-радикалов усиливает и другой хелатор ионов металлов переменной валентности, лимонная кислота, хотя и в значительно меньшей степени, чем дефероксамин. Ранее было установлено, что хелатирование цитратом ионов Fe значительно ускоряет реакцию Фентона [Smith et al., 1990], а также увеличивает скорость аутоокисления железа в трис-буфере (рН 7) [Welch et al., 2002].
Экстраполяция полученных нами экспериментальных значений константы скорости тепловой генерации ОН при высоких температурах к 37С позволяет предположить, что во внеклеточной жидкости теплокровных животных константа скорости тепловой продукции гидроксильных радикалов к = 1,05 Ю-9 с"1 при скорости v = 3,15 10" М-с"1 (учитывая, что внутритканевая концентрация кислорода у млекопитающих составляет в среднем 30 мкМ [Brunori, 2001]). Возможно, одним из путей реализации защитного эффекта повышения температуры тела при инфекционной лихорадке служит усиление теплопродукции ОН-радикалов, оказывающих бактерицидное/вироцидное действие.
Как следует из приведённых выше, а также опубликованных ранее [Брусков и др., 2001, 2002; Bruskov et al., 2002] данных, нагревание насыщенной до равновесия воздухом воды и водно-солевых растворов индуцирует образование в них АФК: 02, 027 НОг", Н2О2, ОН. Есть основания полагать, что под действием тепла наряду с перечисленными основными видами АФК происходит образование других радикалов и молекулярных продуктов, наблюдающихся прирадиолизе воды [Пикаев, 1986]: "NO, гидратированного электрона, атомарного водорода и молекул водорода как продукта рекомбинации двух атомов водорода.
Какие физико-химические механизмы могут лежать в основе этого явления, учитывая, что удельная плотность энергии теплового потока значительно меньше, чем у ультрафиолетового излучения и ионизирующей радиации? С помощью ингибиторного анализа было показано [Брусков и др., 2001; Bruskov et al., 2002], что под действием тепла происходит "активация" растворённого молекулярного кислорода переводом его в синглетное состояние, после чего !Ог восстанавливается до супероксид анион-радикала, дисмутация которых приводит к образованию Н2О2. Другой возможный путь тепловой генерации Н2О2 заключается в рекомбинации гидроксильных радикалов, образующихся из гидроксил-ионов: ОН" —» ОН + e aq [Брусков и др., 2002]. В работе [Домрачёв и др., 1995] показано образование перекиси водорода (10" -10" М) в деионизованной воде под действием звука докавитационной интенсивности (в отсутствие газовых пузырьков в воде) и при фазовых переходах вода-лёд-вода и вода-пар-вода, т.е. при воздействиях на воду с низкой удельной плотностью энергии, при этом в деаэрированной воде величина эффекта уменьшается в несколько раз. Авторы проводят аналогию между поведением полимеров и воды как пространственно структурированной, ассоциированной жидкости и предлагают гипотезу механохимической генерации Н2О2 в воде как следствие гомолиза отдельных молекул воды с образованием атомов Н и радикалов ОН с последующей рекомбинацией последних. При увеличении энергии звуковой волны в жидкости наблюдается акустическая кавитация [Маргулис, 1984; Липсон, Кузнецов, 2002], причём при схлопывании (адиабатическом коллапсе) образовавшегося газового микропузырька (диаметром до нескольких десятков мкм) его потенциальная энергия трансформируется в механическую энергию, тепло, энергию химических реакций и испускаемых фотонов (сонолюминесценция), а температура внутри коллапсирующего пузырька может достигать экстраординарных величин (до 2 104 К в воде [Didenko, Suslick, 2002], 10б К в дейтерированном ацетоне [Taleyarkhan et al., 2002]), достаточных для ионизации и разрыва валентных связей в находящихся внутри пузырька молекулах с образованием плазмы, радикалов и ионов. В работе [Didenko, Suslick, 2002] в воде (3 и 22С, 52 кГц, акустическое давление 1,5 атм) прямо измерено количество образующихся внутри кавитирующего микропузырька радикалов "ОН, при этом значение звуко-химического выхода образования ОН-радикалов составило 10"10 моль Дж"1 (напомним, радиационно-химический выход образования ОН при радиолизе воды равен 2,8 10"6 моль Дж"1 [von Sonntag, 1987]). Можно предполагать, что некоторая часть естественных газовых микропузырьков, содержащихся в водных растворах вследствие гидрофобности газовых молекул, способна подвергаться подобному коллапсу под действием тепла, что приводит к образованию в растворе радикальных продуктов, в том числе АФК. В условиях акустической кавитации ( 2 МГц) в водном растворе ДНК происходит окислительное повреждение оснований и регистрируется образование Н2О2 [Fuciarelli et al., 1995]. Инфразвуковые колебания (4-10 Гц) изменяют физико-химические свойства воды и водного раствора ДНК [Степанян и др., 2000]. Под действием электромагнитного излучения КВЧ-диапазона (41 ГГц) в водных растворах образуются АФК, в частности, перекись водорода [Поцелуева и др., 1998], причём авторы предполагают, что в образовании АФК под действием ЭМИ КВЧ непосредственно участвует растворённый молекулярный кислород. По мнению авторов последней работы, вода представляет собой неравновесную самоорганизующуюся систему, которая после внешнего возбуждения обладает запасом свободной энергии; релаксация системы "может быть сопряжена с индукцией химических реакций, в том числе реакций образования АФК".
Таким образом, не только тепло, но и ряд других воздействий с относительно низкой удельной плотностью энергии приводит к образованию АФК в воде и водных растворах. Весьма вероятно, что в основе всех этих явлений лежат единые, универсальные механизмы.
Генерация гидроксильных радикалов в воде и водно-солевых растворах под действием тепла
Как отмечалось выше, нормальное состояние морской среды - окислительное. Однако редокс-состояние водной среды является динамическим, определяется совокупным балансом всех протекающих в ней химических реакций (часть из которых продуцирует вещества восстановительной природы), а потому подвержено изменениям в зависимости от времени суток, сезона, биогенной активности и т.д. вплоть до смены "знака" на квазивосстановительное [Штамм и др., 1991].
В качестве детектора образования в среде донора(ов) электронов был использован реактив Эллмана (DTNB) [Ellman, 1959], восстановленная форма которого - TNB -оптически активна. При прогревании образцов морской воды, содержащих DTNB, при температурах от 40 до 60С, происходит увеличение поглощения растворов А412 (рис.17), обусловленное, очевидно, восстановлением DTNB в TNB. Концентрация образующейся TNB меняется от 3,1 10"6 М (40С, 10 мин) до 3,6 10 5 М (60С, 20 мин).
Кинетика процесса описывается уравнением реакции (псевдо)первого порядка, о чём свидетельствует линеаризация кинетических графиков в полулогарифмических координатах (не показано). Концентрация образующейся TNB при кратковременном нагревании линейно зависит от времени /: Р = C0-kt, (3") где Р - концентрация TNB, С0- исходная концентрация DTNB в растворе, к- константа скорости реакции. В табл.11 представлены значения константы скорости реакции при разных температурах. Величину энергии активации процесса образования вещества-восстановителя определяли на графике Аррениуса, как описано выше. Энергия активации его образования при нагревании морской воды оказалась равной 20 ккал/моль. Внесение DTNB в морскую воду через различные промежутки времени (1-15 мин) после окончания нагревания (60С, 10 мин) позволило определить время полужизни восстанавливающего агента, которое О 5 10 20 30
Зависимость концентрации образующейся TNB от времени, прошедшего между окончанием нагревания (60С, 10 мин) морской воды и добавкой в неё DTNB (до 50 мкМ) (М±ш,п = 3).
Значения константы скорости (к) генерации восстановителя в морской воде при различных температурах (М± т,п = Ъ) составило Ті/2 = 4 мин (рис.18). В полулогарифмических координатах экспериментальные данные линеаризуются (не показано). Внесение в инкубационную смесь (морская вода, DTNB) супероксиддисмутазы (0,5; 20; 200 ед/мл) не приводит к изменению образования TNB при нагревании раствора (40С, 20 мин) по сравнению с контролем, не содержащим СОД. Воздействие хелаторов железа на процесс восстановления DTNB при нагревании её раствора в морской воде (40С, 20 мин) различно: десферал (50 мкМ) не влияет на реакцию, дефероксамин (50 мкМ) уменьшает количество образующейся TNB на 28%, фенантролин (100 мкМ) - уменьшает на 9%. Аскорбиновая кислота (500 мкМ, рН инкубационной смеси 8,44) угнетает реакцию восстановления DTNB на -60%, выступая, по-видимому, в качестве прооксиданта.
Известно, что щелочная среда (каковой является морская вода) способствует стабилизации дисульфидной связи (в частности, в белках [Creighton, 1986]). Несмотря на это, константы скорости расщепления S-S-связи в DTNB в морской воде при её нагревании (табл. 11) свидетельствуют о высокой реакционной и электронно-донорной способности образующегося в морской воде восстановителя. Какие компоненты морской воды могут проявлять подобные свойства? Такими качествами в полной мере обладает гидратированный электрон, генерация которого недавно была показана в морской воде при облучении ультрафиолетом [Thomas-Smith, Blough, 2001]. Другим претендентом на эту роль может быть перекись водорода, если учесть, что при щелочных значениях рН она способна проявлять и свойства восстановителя [Tarpey, Fridovich, 2001]. Металлы переменной валентности в составе поверхностных морских вод находятся в основном в своих высших степенях окисления [Хорн, 1972], а содержание их редокс-активных форм невелико и составляет 1 нМ [Zafiriou, 1990] (оценки концентрации иона Fe2+ в морской воде, сделанные другими авторами, колеблются от 3 10"7М [Кононец и др., 2002] до 10" М [Хорн, 1972]); поэтому активное участие ионов металлов в наблюдаемой реакции в качестве доноров электронов маловероятно. Морская вода содержит значительное количество двуокиси углерода, растворимость которой многократно превышает растворимость азота и кислорода. При щелочных значениях рН морской воды растворённый в ней ССЪ находится преимущественно в форме бикарбонатного аниона НСОз" [Хорн, 1972]. Авторы недавних публикаций [Goss et al., 1999; Shafirovich et al., 2001] полагают, что ион НСОз" способен к одноэлектронному окислению, проявляя свойства восстановителя. При этом образуется бикарбонат-анион радикал СОз". Однако эта реакция в настоящее время остаётся малоизученной. Обнаружено [Yermilov et al., 1996], что НСОз" подавляет "ОН-подобную активность пероксинитрита, ингибируя образование разрывов в плазмидной ДНК при действии PON.
Другим мажорным компонентом морской воды является хлорид-анион. Ранее было показано [Bruskov et al., 2002], что наличие NaCl в инкубационной смеси уменьшает тепловую генерацию перекиси водорода в фосфатном буфере и окислительное повреждение гуаниновых оснований в ДНК активными формами кислорода, образование которых индуцировалось нагреванием раствора.
Представленные выше данные позволили предположить, что некоторые неорганические анионы морской воды (прежде всего, бикарбонат-анион и хлорид-анион) способны выступать в роли восстановителя. Для проверки этой гипотезы исследовали влияние отдельных компонент (анионов) морской воды на реакцию восстановления DTNB. Прогревали образцы раствора DTNB (50 мкМ) в бидистиллированной воде, содержащие NaCl и/или ЫаНСОз. Концентрация солей в образцах (0,53 М NaCl, 2,33 мМШНСОз) соответствовала их содержанию в морской воде [Хорн, 1972], а рН образцов (8,75) соответствовала рН использовавшейся искусственной морской воды. На рис.19 видно, что присутствие в нагреваемых образцах водного раствора DTNB как хлорид-аниона (рис.19, Б), так и бикарбонат-аниона (рис.19, В) в указанных концентрациях приводит к восстановлению DTNB и, тем самым, к увеличению поглощения раствора А412 по сравнению с контрольными пробами, не содержащими неорганических анионов (рис.19, А). Но только при совместном действии хлорида и гидрокарбоната натрия (рис. 19, Г) поглощение образцов A4i2 достигает величины, наблюдаемой в 50 мкМ растворе DTNB в морской воде при его прогревании при той же температуре и продолжительности (50С, 20 мин) (рис. 17). Следует отметить, что сочетанное действие СГ и НСОз" имеет сверхаддитивный характер. Аналогичные эксперименты, проведенные с сульфат " 0,30 п
