Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Влияние ионизирующего излучения на биологические мембраны 14
1.1.1. Экспериментальные результаты 14
1.1.2. Биоиндикаторы радиационного воздействия 24
1.1.3.Механизм действия ионизирующего излучения 25
1.2. Электропорация мембран 28
Глава 2. Методика экспериментов.
2.1. Методика экспериментов 42
2.1.1. Характеристики источников излучения. Пучок электронов, у-излучение 226Ra-источника. .42
2.1.2. Схема проведения опытов по комбинированному воздействию ионизирующего излучения и импульсного электрического поля 49
2.1.3. Кинетические кривые уменьшения числа эритроцитов 60
2.2. Результаты методических опытов 66
2.3. Флуктуации токов в модельных липидных мембранах при фазовых переходах 79
Глава 3. Воздействие гамма-излучения на мембраны эритроцитов. Комбинированное действие гамма-излучения и импульсного электрического поля 85
3.1. Облучение суспензии эритроцитов у-излучением 85
3.1.1. Схема эксперимента 85
3.1.2. Действие у-излучения на мембраны 87
3.2. Комбинированное действие у-излучения и импульсного электрического поля 91
3.2.1. Действие Y -излучения и импульсного электрического ПОЛЯ 91
3.2.2. Воздействие малых доз у -излучения на мембраны: динамика скрытых повреждений. 95
3.3. Комбинированное действие у -излучения, импульсного электрического поля и перфторана на мембраны эритроцитов 100
Глава 4. Воздействие пучка электронов на мембраны. Комбинированное действие пучка электронов и импульсного электрического поля 105
4.1. Оценка параметров облучения 105
4.1.1. Схема эксперимента 105
4.1.2. Оценка однородности облучения суспензии 106
4.1.3. Оценка мощности дозы. Оценка дозы 107
4.1.4. Оценка количества электронов, приходящихся в среднем на один эритроцит 110
4.2. Действие пучка электронов на мембраны 111
4.3. Комбинированное действие пучка электронов и импульсного электрического поля 119
4.3.1. Схема эксперимента 119
4.3.2. Особенности комбинированного действия пучка электронов и импульсного электрического поля 120
4.3.3. Комбинированное действие пучка электронов и электрического импульса различных энергий на суспензию эритроцитов 126
4.3.4. Влияние пучка электронов на порог электропора ци и 132
4.3.5. Зависимость коэффициента неаддитивности констант скоростей от дозы и напряжения между электродами 135
Глава 5. Модель комбинированного действия ионизирующего излучения и импульсного электрического поля на биологическую мембрану.
5.1. Физические основы детектирования ионизирующего излучения с помощью калиброванной электропорации 138
5. 2. Мембрана в виде статистического ансамбля участков с различными физико-химическими свойствами. 143
5.3. Воздействие у-излучения в малых дозах. Возникновение дополнительного статистического ансамбля активных центров электропорации в мембране 154
5.3.1. Сечения фотоэффекта и комптоновского рассеяния для суспензии эритроцитов. ... 155
5.3.2. Оценка средней длины трека вторичных электронов. 160
5.3.3. Оценка минимального времени облучения, необходимого для повреждения мембраны . 164
5.4. Изменение порога электропорации в результате облучения пучком электронов 175
5.5. Математическое описание кинетических кривых для комбинированного действия пучка электронов и импульсного электрического поля на мембраны эритроцитов 177
Глава 6. Универсальность метода детектирования с помощью калиброванной электропорации: 190
6.1. Комбинированное действие УФ излучения и импульсного электрического поля 190
6.1.1. Схема эксперимента 190
6.1.2. Результаты экспериментов 191
6.2. Действие двух последовательных импульсов одинаковой и разной полярности на мембраны эритроцитов 201
6.3. Перфторан в суспензии крови 203
6.3.1. Схема экспериментов 204
6.3.2. Результаты и их обсуждение 206
6.4. Константы скоростей гемолиза для разных возрастных групп 216
Приложение 222
- Схема проведения опытов по комбинированному воздействию ионизирующего излучения и импульсного электрического поля
- Флуктуации токов в модельных липидных мембранах при фазовых переходах
- Комбинированное действие у -излучения, импульсного электрического поля и перфторана на мембраны эритроцитов
- Комбинированное действие пучка электронов и импульсного электрического поля
Введение к работе
Актуальность работы
Изучение механизмов взаимодействия ионизирующих излучений с веществом различной структурной организации является одной из важных проблем ядерной физики. Особую значимость имеет изучение закономерностей взаимодействия радиации с живыми биологическими объектами, элементарную основу которых составляют клетки.
В настоящее время наименее изученными остаются физические процессы в структурно сложных субклеточных образованиях, в частности, в клеточной мембране, рассматриваемой в последнее время, наряду с ДНК, в качестве критической мишени радиационного воздействия. При этом актуальным является исследование физических аспектов формирования радиационного повреждения биологических мембран при действии у-излучения и потоков электронов. Невыясненными остаются механизмы повреждения структуры мембран; отсутствуют точные количественные данные для оценки эффектов воздействия излучений в различных дозах на биологические мембраны.
Поэтому исследование влияния ионизирующего излучения на структурные и функциональные характеристики биологических мембран является актуальной междисциплинарной проблемой ядерной физики, радиобиологии, биофизики.
Для изучения физических процессов, инициируемых воздействием излучения ядерно-физические методы используются как самостоятельно, так и в сочетании с другими физическими методами, что позволяет проявить эффекты, вызываемые действием ионизирующего излучения. Это актуально в настоящее время для выявления радиационных нарушений в биологических мембранах, в частности, путем воздействия на клетки разнородных физических факторов: ионизирующего излучения, импульсного электрического поля, химических агентов - как по отдельности, так и в различных их комбинациях.
Для эффектов воздействия ионизирующих излучений на биологические объекты характерно появление скрытых повреждений. Такие повреждения могут на протяжении длительного времени не обнаруживать себя изменением функционального состояния биологических объектов разной степени сложности. Для выявления скрытых радиационных повреждений используют различные методы, включая дополнительные воздействия, в результате которых такие повреждения становятся явными. Разработка методов выявления и количественного анализа скрытых повреждений в биологических мембранах особенно важно,, для исследования механизмов действия у-излучения в малых дозах (до 10 сГр).
Вместе с тем эта задача актуальна и для исследования радиационных эффектов облучения в высоких дозах. Потоки элементарных частиц, в частности, электроны, могут создавать в биологических структурах дозы облучения 2000 Гр и более. И в этих случаях остаются не ясными механизмы и степень эффективности действия таких излучений на мембраны.
Поэтому создание способов, позволяющих исследовать действие ионизирующих излучений в широком диапазоне доз на мембраны является актуальной задачей современной ядерной физики.
Целью работы является экспериментальное исследование действия у-излучения в малых (до 10 сГр) дозах и пучков электронов в больших (2000 Гр и более) дозах на биологические мембраны на основе комбинированного действия излучения и импульсного электрического ПОЛЯ.
Научная новизна работы
1. Исследованы особенности комбинированного действия ионизирующих изучений (у-излучение в малых дозах, 0,5 - 10 сГр, и пучки электронов в дозах 2000 - 13400 Гр) и импульсного электрического поля на мембраны эритроцитов человека в суспензии. Показана
неаддитивность констант скоростей гемолиза эритроцитов в суспензии в результате комбинированного воздействия указанных факторов.
Предложен метод детектирования у-излучения и пучка электронов с помощью калиброванной необратимой электропорации биологических мембран.
Выявлены скрытые повреждения биологических мембран, возникающие в результате воздействия на них у- излучения в малых дозах. Исследована и установлена зависимость степени повреждения мембраны от дозы излучения (0,5 - 10 сГр).
Обнаружены скрытые повреждения биологических мембран после воздействия на них пучка электронов в высоких дозах (2000 -13400 Гр). Исследована и установлена зависимость степени повреждения мембран от дозы излучения.
Экспериментально показано, что при действии пучка электронов в диапазоне доз 7000 - 13000 Гр порог электропорации мембран при действии импульсного электрического поля уменьшается на П-16%.
Создана экспериментальная установка для изучения действия излучений на мембраны, включающая в себя разрезной микротрон импульсного действия (НИИЯФ МГУ), контейнеры для источников у-излучения, прибор для электропорации биологических мембран, регистрирующий фотоколориметр, устройство для размещения модельных биологических объектов облучения.
Разработана методика для исследования скрытых повреждений в мембранах, возникающих при действии у-излучения и пучка электронов. Экспериментально установлены параметры калиброванного электрического импульса для необратимого пробоя мембран (длительность, амплитуда) и параметры биологической модели (концентрация клеток, температура).
Предложен метод количественного анализа повреждающего действия ионизирующих излучений и других физико-химических факторов на мембрану in vitro и in vivo, на основе кинетики уменьшения числа эритроцитов в суспензии после необратимой электропорации клеточной мембраны.
Разработаны теоретические основы и математическая модель для описания механизмов действия у-излучения и пучка электронов на биологические мембраны в сочетании с действием импульсного электрического поля, в которой:
мембрана представляется в виде статистического ансамбля участков (активных центров) с различными пороговыми потенциалами электрического пробоя; воздействие у -излучения и пучка электронов изменяет параметры статистического ансамбля и, соответственно, условия электрического пробоя;
проведена оценка средней длины трека вторичных электронов и эффективного числа активных центров повреждения в мишени с учётом статистического веса атомов, составляющих биологическую систему;
решена обратная задача вычисления параметров статистического распределения порогового потенциала электрического пробоя после воздействия излучений.
10. Показана универсальность предложенного метода для диагностики состояния мембран после воздействия различных физико-химических факторов: ультрафиолетовое излучение, фармакологические препараты (на примере перфторана), электрические импульсы разной полярности, для доноров различных возрастных групп.
Достоверность научных результатов и выводов обеспечена использованием хорошо апробированных методик, строгим соблюдением условий экспериментов, высокой степенью воспроизводимости опытных данных. Полученные новые данные согласуются с современными представлениями по рассматриваемой проблеме.
Практическая и научная ценность работы
Предложенный метод исследования действия излучений на
биологические мембраны в сочетании с импульсным электрическим полем может быть применен в биофизических экспериментах по изучению действия ионизирующего излучения на биологические мембраны как in vitro, так и in vivo. Данный метод может быть использован в практической медицине: для мониторинга за состоянием эритроцитов в ходе лучевой терапии, при выборе оптимальных характеристик электрического импульса для дефибрилляции сердца, при изыскании оптимальных искусственных кровезаменителей в хирургии, для оптимизации условий консервации и хранения крови. Предложенная модель может быть использована для оценки и количественного анализа степени повреждающего воздействия у -излучения и пучка электронов на мембраны.
Результаты, полученные в диссертации, могут быть включены в программу обучения студентов высших учебных заведений, специализирующихся в области ядерной физики, биофизики, медицины.
Основные положения, выносимые на защиту:
Физический метод детектирования у -излучения, пучков электронов и других ионизирующих излучений на основе последующей необратимой электропорации биологических мембран экспоненциальным электрическим импульсом длительностью 10 мс.
Константа скорости уменьшения числа эритроцитов в суспензии при комбинированном воздействии у-излучения, пучка электронов и импульсного электрического поля не является суммой констант скоростей при действии этих же факторов по отдельности, что указывает на синергический механизм, лежащий в основе наблюдаемых эффектов.
Разработанный метод исследования результатов воздействия ионизирующих излучений на биологические мембраны с помощью калиброванного импульсного электрического поля позволяет оценивать скрытые повреждения мембран эритроцитов через 1-30 мин после воздействия in vitro у-излучения в малых дозах (0,5-10 сГр), пучка электронов в больших дозах (2000 - 13400 Гр).
В результате действия ионизирующих излучений на мембраны уменьшается пороговый потенциал их электрического пробоя.
Предложенная математическая модель описывает механизмы действия у-излучения и пучка электронов в сочетании с импульсным электрическим полем на мембраны. Биологическая мембрана представлена в виде статистического ансамбля ее участков с различными пороговыми потенциалами электрического пробоя. Воздействие у-излучения и пучка электронов приводит к изменению параметров исходного статистического ансамбля и к возникновению дополнительных активных
центров электрохимических процессов на границе раздела «раствор-мембрана». Модель позволяет: - количественно оценить степень воздействия у-излучения в малых дозах (до 10 сГр) и пучка электронов в высоких дозах (2000 Гр и более) ;
решить обратные задачи оценки изменений собственных параметров системы в результате воздействия пучка ускоренных электронов и у-квантов: порогового напряжения электрического пробоя, количества пор и их радиусов на разных сторонах клетки, уменьшение величины поверхностного заряда эритроцита.
6. Предложенный метод позволяет оценить степень воздействия на мембраны ультрафиолетового излучения, перфторуглеродных соединений в разных концентрациях (1-100 мкл/мл суспензии), последовательных электрических импульсов разной полярности, оценить влияние на состояние клеточных мембран возраста доноров (от 25 до 70 лет).
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих форумах: XII Всесоюзная конференция по когерентной и нелинейной оптике (Москва, 1985); Международная школа «Проблемы теоретической биофизики» (Москва, 1998); конференция «Физические проблемы экологии (физическая экология) (Москва, 1999); II и III Съезды биофизиков России (Москва, 1999; Воронеж, 2004); I и II Евразийский конгрессе по медицинской физике (Москва, 2001, 2005); Second and Third International Summer Student School "Nuclear Physics Methods and Accelerators in Biology and Medicine (Poznan, Poland, 2003; Дубна, 2005); Конференция по использованию ядерно-физических методов в медицине (Москва, 2003); конференция "Основные общепатологические и клинические
закономерности развития критических, терминальных и
постреанимационных состояний. Принципы их коррекции" (Москва, 2003);
Международная конференция «Критические технологии в реаниматологии»
(Москва, 2003); XI Российский национальный конгресс «Человек и
лекарство» (Москва, 2004); V и VI межвузовская научная школа молодых
специалистов конференции «Реаниматология. Ее роль в современной
медицине» (Москва, 2004); V и VI Межвузовская научная школа молодых
специалистов «Концентрированные потоки энергии в космической технике,
электронике, экологии и медицине» (Москва, 2004, 2005); Российская
научная конференция «Перфторуглеродные соединения вэкспериментальной и клинической медицине (Санкт-Петербург, 2004); третий Российский Конгресс по патофизиологии с международным участием (Москва, 2004); Ломоносовские чтения (Москва, 2005); European Association for Red Cell Research ,15th Meeting (Murten, Switzerland, 2005); Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005).
Работы в данной области поддержаны грантом Правительства Москвы (2002), грантом Программы «Университеты России» (2004).
Под руководством автора защищено 5 дипломных работ на физическом факультете МГУ.
Автор читает курс физики на кафедре медицинской и биологической физики ММА им.И.М.Сеченова и специальный курс «Биофизические основы физиологических процессов» на кафедре физики ускорителей высоких энергий физического факультета МГУ. Лекции по теме диссертации читаются автором и на ежегодной (1998 - 2005) летней практике студентов в ОИЯИ, г. Дубна.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе: в
соавторстве 1 учебник «Биофизика» для студентов высших учебных заведений
(с грифом Министерства образования Российской федерации, 1-е и 2-е
издания), учебное пособие «Практикум по биофизике» (с грифом УМО) и 27
статей, в том числе в журналах «Биофизика» (1), «Бюллетеньэкспериментальной биологии и медицины» (2), «Биомедицинские технологии и
радиоэлектроника» (1), «Вестник МГУ. Физика и астрономия» (4),
«Патологическая физиология и экспериментальная терапия» (2),
«Радиационная биология. Радиоэкология» (1), «Анестезиология иреаниматология» (1), «Медицинская физика» (6), «Квантовая электроника» (3), «American Journal of Physiology» (1), «Advances in Physiology Education» (1), «Appl. Physics» (1), «Известия АН, сер. физ.» (1), «Общая реаниматология» (2).
Личный вклад автора. В основе диссертации - результаты исследований, выполненных автором в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, в НИИЯФ им. Д. В. Скобельцына МГУ, НИИ общей реаниматологии РАМН. Постановка экспериментальных и теоретических задач предложены лично автором. Экспериментальные исследования проведены на разрезном микротроне Отдела электромагнитных процессов и взаимодействий с атомными ядрами НИИЯФ и на кафедре медицинской и биологической физики ММА им. И.М.Сеченова при непосредственном участии автора.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, шести глав текста, заключения, списка литературы, двух приложений, всего на 284 страницах, включая 119 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 245 наименований.
Схема проведения опытов по комбинированному воздействию ионизирующего излучения и импульсного электрического поля
Общая схема проведения опытов по комбинированному действию ионизирующего излучения и импульсного электрического поля (ИЭП) на суспензию эритроцитов состоит из следующих этапов (Козлова и др., 2002 -2005). Вначале производится забор крови у донора и приготавливается суспензия эритроцитов. Затем суспензия, помещённая в пробирки, облучается ионизирующим излучением: у-излучением или пучком электронов. После облучения эта суспензия подвергается действию импульсного электрического поля. На всех этапах, используя кинетические кривые гемолиза, регистрируется состояние эритроцитов, находящихся в суспензии. На рис. 2.4 представлена общая схема проведения опытов по комбинированному воздействию излучения и импульсного электрического поля. Приготовление суспензии эритроцитов В экспериментальной биологической модели использовали суспензию крови человека в 0,9% растворе хлористого натрия (в дальнейшем этот раствор будем называть физиологическим). Кровь брали из пальца непосредственно перед приготовлением суспензии. Использовали кровь как одного, так и нескольких доноров. Кровь не центрифугировали. (у-излучение источника На, пучок электронов), II этап электропорация мембраны эритроцитов, Ш этап измерение оптической плотности суспензии и построение кинетических кривых . Пр пробирка с суспензией, ДФ дефибриллятор, ФЭК фотоэлектроколоршлетр, КС контрольная суспензия, КЭ - кювета с суспензией и электродами. Получение кинетических кривых: 1 контрольной суспензии, 2 облученной суспензии, 3 суспензии после электропорации, 4 4 суспензии после облучения и последующей электропорации (комбинированное действие) В 1 мл физиологического раствора содержалось 0,05 мл крови, что соответствует разбавлению крови в 20 раз. Учитывая, что в среднем в 1 мкл крови содержится 4, 6 млн эритроцитов ( Шмидт, 1996), в наших опытах в среднем в 1 мл суспензии находилось 230 млн эритроцитов. Исходная суспензия всегда имела оптическую плотность 1,0 при толщине слоя 5 мм. Это был мутный, непрозрачный раствор.
Перед каждой серией опытов суспензию приготавливали в стеклянной кювете объемом 100 мл. Для проведения большого числа опытов приготавливали два таких объема суспензии. Затем приготовленную суспензию разливали по 4 мл по стандартным пробиркам. Суспензию термостатировали. Объем 4 мл обусловлен необходимостью иметь стандартный объем раствора (3 мл) в кювете для электрического пробоя (рабочая кювета). В свою очередь необходимость иметь 3 мл в кювете для пробоя вызвана требованием поддержания одного и того же электрического сопротивления в рабочей кювете. После приготовления суспензию выдерживали в течение 1 часа при заданных в данном опыте условиях. После этого ее подвергали воздействию того или иного физико-химического фактора. После воздействия электрическим полем суспензию переливали в измерительные кюветы (2 мл), при этом толщина слоя составляла 5 мл. В случае необходимости проведения измерения в течение длительного времени (более суток) все измерительные кюветы хранились в одинаковых условиях. Для измерения числа эритроцитов в суспензии наиболее удобным является спектрофотометрический метод.
В основу фотоколориметрии положено явление уменьшения интенсивности света при прохождении его через вещество. Ослабление света при прохождении его через суспензию эритроцитов обусловлено двумя процессами: истинным поглощением и рассеянием (рис. 2.5а). Если в суспензии произошел гемолиз эритроцитов, то оптическая плотность будет определяться поглощением гемоглобина, остальными форменными элементами крови, тенями эритроцитов. Из рис. 2.5. б (кривая 2) оптическая плотность на длине волны X =760 нм составляет 0,02. В случае же исходной суспензии эритроцитов оптическая плотность определяется еще и рассеянием на эритроцитах и равна на этой длине волны 0,8 (кривая 2). Количество гемоглобина и других форменных элементов крови в обеих суспензиях одинаковое. Поэтому можно утверждать, что оптическая плотность суспензии на длине волны Х=760 нм определяется именно рассеянием на эритроцитах, вклад других компонент не более 2,5-3%. Количественно ослабление света в результате рассеяния описывается формулой, подобной формуле закона Бугера-Ламберта- Бера: Где 1о и I - интенсивности падающего и ослабленного пучков света, е-основание натурального логарифма, к - показатель ослабления, п-концентрация эритроцитов, /- толщина образца Для разбавленной суспензии оптическая плотность D пропорциональна концентрации эритроцитов: К - коэффициент пропорциональности. Оптическая плотность суспензии почти линейно зависит от концентрации крови при С=1-25%. Поэтому, измеряя оптическую плотность раствора, можно получить информацию о концентрации эритроцитов в суспензии. Как правило, в опытах исходная оптическая плотность суспензии равнялась 1, поэтому измеряя оптическую плотность в данный момент времени, можно говорить об относительном изменении оптической плотности и соответственно об относительном уменьшении числа эритроцитов в данной суспензии.
Флуктуации токов в модельных липидных мембранах при фазовых переходах
Для анализа результатов действия ионизирующего излучения и импульсного электрического поля необходимо знать структурно- функциональное состояние исходных мембран эритроцитов. Электромеханические свойства мембран эритроцитов определяются химическим составом их компонентов и температурой. Исходно эритроциты находятся в организме при температуре 36 - 37 С. При этом известно, что температура фазового перехода фосфатидилхолина - липида, входящего в состав мембраны эритроциты, около 22 С (Геннис, 1997). В работах (Вьгшенская и Пасечник, 1986) показано, что при температуре около 22 ОС наблюдаются структурные перестройки и изменения механических характеристик в мембранах эритроцитов. В наших опытах температура суспензии эритроцитов в физиологическом растворе равнялась 20 С, то есть в точке ниже фазового перехода основных липидов. Измерить флуктуации тока через мембрану клетки, находящейся в суспензии, не представляется возможным. Однако можно получить результаты, исследуя флуктуации тока на модельных липидных бислоях в условиях фазового перехода. Основу биологоической мембраны составляют липиды. Наиболее удобным объектом изучения процессов в липидах являются плоские бислойные липидные мембраны (пБЛМ). Наиболее детально изучены процессы при фазовых переходах в БЛМ в работах (Антонов и др., 1992 - 2005). Поскольку от микроструктуры мембраны зависят электрические токи через через нее, то нами была проведена серия опытов по изучению особенностей ионных токов через пБЛМ при изменению температуры, включая температуру фазового перехода липида.
В опытах было важным установить, изменяются ли структура БЛМ при уменьшении температуры от 1 1ф до Кїф. Для решения поставленной задачи необходимо получить устойчивые БЛМ. Для формирования бислойных липидных мембран были выбраны цвиттерионный дипальмитоилфосфатидилхолин (пр-во Avanti) - один из фосфолипидов клеточной мембраны и природный липид - гидрированный яичный лецитин (ГЯЛ, производство Avanti). Поскольку нас интересовало поведение мембраны в области до и после фазового перехода, необходимо было выбрать те липиды, фазовый переход которых находится в области положительных температур. По этой причине природные ненасыщенные фосфолипиды, фазовый переход которых происходит при отрицательной температуре, не могли быть использованы. Другим недостатком природных фосфолипидов для решения поставленных задач является их способность окисляться на воздухе и образовывать продукты перекисного окисления, которые вызывают рост проводимости мембраны.
Температуру фазового перехода суспензии липосом, приготовленных из разных липидов в различных растворах определяли с помощью адиабатического сканирующего микрокалориметра (Антонов, 2003). Плоские бислойные мембраны формировались по методу Мюллера на отверстии в тефлоновом стаканчике. Концентрация мембранного раствора составляла 25 мг/мл. В качестве растворителя использовалась тройная смесь: н-декан, хлороформ, метанол в пропорции 7:2:1 по объему. Во внутреннем стаканчике, изготовленном из тефлона, проделано отверстие радиусом 0,57 мм. Внешний стаканчик представлял собой оптически прозрачную термостатируемую кювету. В кювету наливали электролит и помещали внутренний стаканчик. При этом уровни жидкости по разные стороны отверстия были одинаковы. Из пипетки на отверстие выдавливалось небольшое количество липидного раствора. На отверстии возникала первоначально цветная пленка, которая затем чернела, что свидетельствовало об уменьшении ее толщины. Почернение пленки наблюдали в отраженном свете в оптический микроскоп МБС-2 с увеличением до х32. Регистрацию электрических сигналов проводили прибором для измерения ионных токов (г. Пущино). Для определения емкости и проводимости мембраны на нее подавали пилообразное напряжение частотой /=2 Гц и в диапазоне напряжений 10-200 мВ. Была разработана компьютерная программа для обработки вольтамперных характеристик. По ним рассчитывалась проводимость и емкость в растворах электролитов. Интегральную проводимость пБЛМ рассчитывали по формуле: GM=UG/{RQUo\ где UG - измеряемое напряжение, обусловленное проводимостью мембраны, R0 -сопротивление обратной связи в цепи операционного усилителя, U0 - амплитуда подаваемого на мембрану напряжения. Расчет емкости См производили по формуле: CM=Uc/(2fU0Ro), где Uc - измеряемый скачок напряжения, обусловленный емкостью мембраны. Регистрацию флуктуации тока в зоне температурного фазового перехода липида производили в режиме фиксации напряжения. Установка позволяла измерять флуктуации тока амплитудой до 0,5 пА. Основной метод оценки радиуса поры обусловлен омической природой липидных пор. Рассматривая пору как цилиндрическую трубку, заполненную раствором электролита, можно оценить радиус поры по амплитуде регистрируемых флуктуации тока по формуле: где Gp - проводимость поры, /2=5 нм - толщина пБЛМ, g - удельная проводимость раствора электролита. На рис. 2.21 представлены записи флуктуации тока (Антонов и др., 2004) регистрируемых в пБЛМ из ДПФХ в растворе LiCl при температуре основного фазового перехода для различных значений фиксированного мембранного потенциала. Показано снижение амплитуды флуктуации с уменьшением напряжения. Вольтамперная характеристика единичной поры имела линейный характер.
Комбинированное действие у -излучения, импульсного электрического поля и перфторана на мембраны эритроцитов
В медицине используются методы физического воздействия на ткани организма для проведения терапевтических процедур. В ряде случаев на организм действуют различными факторами одновременно. Так возможна комбинация воздействия ионизирующего излучения и импульсного электрического поля, например, при проведении электрической дефибрилляции сердца пациентам, которые подвергались процедурам лучевой терапии или лучевой диагностики. При этом в качестве кровезаменителя в ряде случаев используются перфторуглеродные соединении.
В связи с этим актуальным представляется исследование нарушений функционирования мембран в результате воздействия на клетки разнородных факторов: ионизирующего излучения, импульсного электрического поля, химических агентов не только по отдельности, но и их совместного воздействия в различных комбинациях. Результаты исследования особенностей воздействия на мембрану перфторуглеродных соединений с помощью метода электропорации представлены в главе 6. Как уже отмечалось, если проводить процесс облучения и электропорации при низкой температуре t = 14 - 15 С, то константа скорости гемолиза в результате электропорации облученной суспензии (доза 5 сГр, мощность дозы 5 сГр/час) меньше, чем константа скорости гемолиза необлученной. На рис. 3.11 приведены экспериментальные кинетические кривые для различных сочетаний физико-химических воздействий у -излучения , перфторана и калиброванного электрического импульса (ИЭП): контрольная (без у-облучения, перфторана, импульсного электрического поля) (1), только перфторан (2), только у-излучение (3), у-излучение и перфторан (4), у-излучение и ИЭП (5) только ИЭП (6) перфторан и ИЭП (7), у-излучение, перфторан и ИЭП (8). Из рис. 3.11 следует, что в этом случае при низких температурах процесс гемолиза после электропорации происходил медленнее в 1,2-2 раза для облученной суспензии (кривая 5), чем для необлученной (кривая 6). Рис. 3.11.
Кинетические кривые для различных комбинаций воздействия у-излучения, перфторана и калиброванного импульсного электрического поля (ИЭП) на суспензию эритроци: 1 - без облучения, перфторана и НЭП, 2-е перфторапом, 3 - у-излучеиие , 4 - у-излучение и перфторан, 5 - у-излучение и ИЭП, б - ИЭП, 7 - перфторан и ИЭП, 7 - у-излучение, перфторан и ИЭП. Суспензии эритроцитов с перфторапом и без него облучали в течение 1 часов, затем подвергали воздействию калиброванного импульсного электрического поля. Доза 5 сГр, t=14-15C В серии представленных опытов показано, что добавление перфторана или действие у-излучения, а также их комбинация не изменяли оптическую плотность суспензии (кривые 1,2,3,4). Предварительное действие у-излучения замедляло гемолиз в результате последующей электропорации (кривая 5) по сравнению с кривой в результате электропорации без перфторана и без облучения (кривая 6).
Добавление перфторана в суспензию С=20 мкл/мл ускоряло гемолиз в результате электропорации примерно в 2 раза (кривая 7) по сравнению с электропорацией без перфторана (кривая 6). То есть и ,у-излучение, и перфторан по отдельности повлияли па результаты электропорации. Эксперименты этой серии свидетельствуют о неаддитивности констант скоростей уменьшения числа эритроцитов при комбинированном воздействии у-излучения, перфторана и импульсного электрического поля. Результаты экспериментов позволили сделать вывод об эффективности метода калиброванной электропорации для исследования действия у-излучения в малых дозах на мембраны эритроцитов. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов в облученной (у-излучение в малых дозах до 10 сГр) и необлученной суспензиях статистически не различаются. Показана возможность выявления скрытых повреждений мембран после воздействия у-излучения в малых дозах (0,5 - 10 сГр) с использованием калиброванной необратимой электропорации. При комбинированном действии у-излучения и импульсного электрического поля на биологические мембраны наблюдается неаддитивность констант скоростей уменьшения числа эритроцитов в суспензии. Константа скорости гемолиза клеток при комбинированном воздействии больше, чем сумма констант скоростей при воздействии каждого из этих факторов по отдельности, в 1,2 — 1,8 раза при поглощенной дозе ионизирующего излучения 0,5 -10 сГр с мощностью дозы 5 сГр/час.
Комбинированное действие пучка электронов и импульсного электрического поля
Эксперимент по исследованию комбинированного действия проводился по схеме, представленной на рис. 2.1. во второй главе диссертации. Пробирку с суспензией облучали несколько минут пучком электронов, получаемых на ускорителе, а затем через 1-3 мин часть облученной суспензии подвергали воздействию электрического импульса дефибриллятора. В различных сериях энергия импульса варьировалась от 50 до 330 Дж. Другую часть облученной суспензии не подвергали электропорации, а переливали её в измерительную кювету и следили за ее параметрами в течение нескольких дней. Таким образом, в экспериментах использовали 4 различных вида суспензии: суспензия эритроцитов не подвергавшаяся ни облучению, ни действию импульсного электрического поля - эта суспензия использовалась в качестве контрольной; облучённая суспензия, но не подвергавшаяся электропорации; суспензия не облучённая пучком электронов, но на которую действовали импульсом электрического поля; суспензия на которую воздействовали и облучением и импульсом электрического поля. В результате строили зависимость оптической плотности от времени для суспензий после различных воздействий.
Проводили анализ кинетических кривых. Эффект комбинированного воздействия сравнивали с эффектом гемолиза оставшейся части облученной суспензии, а также с поведением необлученной суспензии, но подвергнутой действию импульсного электрического поля. Наряду с этим следили за кинетикой гемолиза исходной контрольной суспензии. На рис. 4.11. представлен характерный вид кинетический кривых для комбинированного действия пучка ускоренных электронов и импульсного электрического поля, а также их действия по отдельности. Рис. 4.11. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов в суспензии в результате воздействия пучка ускоренных электронов (1) , калиброванного импульсного электрического поля (2) и их комбинированного действия (3) . Доза 7700 Гр (энергия электронов Е 40 МэВ, средний ток пучка 1= 1 мА, время облучения 4 мин) Из полученных графиков оценили константу скорости уменьшения эритроцитов в результате воздействия по отдельности электронами ре в результате воздействия импульсным электрическим полем РЕ И при комбинированном их воздействии ре+Е. Так, для времени после воздействия 20 минут ре =0, р =0,007, ре+Е =0,025 мин " (рис. 4.11). Из рис. 4.11 следует эффект неаддитивности скоростей. В первые 10 - 40 минут после воздействия константа скорости уменьшения числа эритроцитов после комбинированного воздействия J3e+E больше, чем сумма констант скоростей после воздействия пучка электронов ре и импульсного электрического поля по отдельности РЕ: Таким образом, скорость процесса при комбинированном воздействии пучка ускоренных электронов и импульсного электрического поля не являлась суммой скоростей уменьшения числа эритроцитов в результате этих же воздействий по отдельности. Другими словами, наблюдался нелинейный эффект сложения скоростей. Аналогичные результаты были получены и для 5 других доноров крови.
Дозу облучения можно было варьировать за счет времени облучения, тока пучка электронов и энергии импульса. На рис. 4.12 - 4.14 представлены результаты комбинированного действия (кривая 3) пучка ускоренных электронов и импульсного электрического поля, а таюке их действия по отдельности (кривые 1 и 2) для разных времен облучения, ток пучка 0,7 мА. Импульсное электрическое поле позволило проявить скрытые эффекты повреждения мембран после облучения . Из этих рисунков следует, что во всех случаях в первые 5-20 минут константа скорости уменьшения числа эритроцитов при комбинированном действии была больше, чем сумма констант скоростей при действии тех же факторов, но по отдельности. Кроме этого из данных рисунков следует и следующий факт. В параграфе 4.2 были приведены опытные данные (рис. 4.7 -4.9), свидетельствующие о том, что в первые 20 мин после облучения оптическая плотность облученной суспензии и необлученной (контроль) не отличались. Кроме этого, значимое различие оптических плотностей суспензий, облученных разное время, наблюдали лишь через 100 мин после облучения.
Похожие диссертации на Комбинированное действие излучения и импульсного электрического поля на биологические мембраны
